鉴定 分枝杆菌属 通过DNA微阵列芯片方法鉴定物种

[旁白] 本研究聚焦于临床微生物学中的分子诊断。与传统检测方法相比，用于鉴定分枝杆菌属物种的DNA微阵列芯片方法具有高灵敏度、高特异性和快速的特点，可为临床患者的早期诊断提供重要帮助。目前，许多基层实验室对非结核分枝杆菌的快速鉴定方法仍十分有限，这直接影响了患者的临床诊断与治疗。首先，将恒温水浴锅的温度设置为50摄氏度并进行预热。准备芯片时，在基因微阵列芯片杂交盒底部加入200微升蒸馏水。将支架置于盒内两个定位柱之间。小心地将芯片正面朝上放置在支架上，并盖上盖玻片，使盖玻片的四个凸起朝下，确保盖玻片末端与芯片末端的标签对齐。接下来，根据样本数量准备200微升离心管或八联管，并正确标记。将试剂盒中的杂交缓冲液在50摄氏度下加热至完全融化。充分混匀后，在微量离心机中快速离心。将9微升杂交缓冲液分装至每个已准备好的管或条中。向每管中加入6微升相应的PCR产物，使每份反应体系的终体积为15微升。使用PCR仪或水浴将杂交反应体系在95摄氏度加热5分钟以进行变性处理。变性完成后，立即将反应体系浸入冰水混合物中，孵育3分钟。从冰浴中取出杂交反应体系，通过移液器上下吹打两次混匀。当无白色絮状沉淀残留时，经由盖玻片上的加样孔加入13.5微升反应体系。迅速盖紧并密封杂交盒，并记录芯片编号、微阵列位置及样本编号。随后，将密封好的杂交盒水平放入已预热至50摄氏度的恒温水浴锅中。待所有杂交盒放置完毕后，启动计时器，计时120分钟。杂交反应完成后，水平取出杂交盒，拆开并取出芯片。立即将芯片放入盛有已平衡至室温的芯片洗涤液I的容器内的载玻片架上，在恒温摇床（转速80至100 RPM）中室温洗涤3分钟。再用芯片洗涤液II在相同摇床条件下（转速80至100 RPM）室温洗涤3分钟。随后，将芯片放入离心机中，在室温下以100 ×g离心5分钟。打开扫描仪，启动相应软件。点击激光控制按钮，使其预热10分钟。在软件中输入样本相关信息。扫描仪预热完成后，点击弹出按钮。将干燥的芯片平稳放置在小型支架上。轻轻将芯片水平推入扫描仪仓内，点击加载按钮。在软件中输入芯片编号，并选择检测区域微阵列1至4。点击选择样本，为每个微阵列选择对应的样本。然后点击开始检测，启动芯片扫描。扫描结果将显示在屏幕上并自动保存。通过数据查询页面进行数据查询和打印操作。完成所有操作后，关闭激光，退出软件，最后关闭扫描仪。实验结果的有效性通过质控确认：阳性对照应检出结核分枝杆菌复合群，阴性对照应无分枝杆菌检出。对检测样本的判读首先考虑所有探针（包括信号值最高的探针）均为阴性的情况，此时报告为无分枝杆菌检出。若仅结核分枝杆菌复合群探针显示强信号，则结果判定为该菌种群阳性。若仅鸟分枝杆菌（Mycobacterium avium）对应的探针显示强信号，则样本判定为鸟分枝杆菌阳性。若仅内参探针为阳性而其余探针均为阴性，则结果报告为不确定，提示存在本检测试剂盒未覆盖的分枝杆菌物种。