急性髓性白血病患者来源的异种移植的细胞内磷酸流式细胞术

我们的研究旨在了解急性髓性白血病如何对批准的疗法产生耐药性。基于代谢起关键作用的假设。最终目标是确定能够有效克服这种阻力的策略。流式细胞术广泛用于白血病研究，是分析白血病细胞等悬浮细胞的理想选择。其适应性使其成为数据分子机制的有力工具。AML 研究的主要实验挑战是开发一种最佳的体内分子复活方案，即用于准确建模的细胞，了解治疗耐药性背后的机制。

[旁白]首先，弯曲鼠标的膝盖并用非惯用手固定腿部，以暴露穿刺侧所在的股骨关节面。将拇指放在胫骨上，食指放在股骨上，中指放在骨头的外侧以稳定它们。在保持固定的同时，用异丙醇对膝盖区域进行消毒，以移开剩余的毛发并增强骨骼结构的可视化。使用第一个干式 25 号注射器，将针头放置在股骨关节中间并轻轻旋转，在股骨关节面上打一个孔，而无需施加力。一旦针头进入骨髓，在旋转注射器的同时逐渐拔出注射器。将第二个冲洗过的注射器插入第一个针头形成的孔中。对插入股骨的第二个注射器施加真空，同时轻轻旋转并逐渐将其抽出。通过冲洗注射器内容物将提取的骨髓转移到含有 500 微升 PBS 的冷冻微量离心管中。将样品放在冰上。使用异丙醇拭子轻轻按压穿刺部位 30 秒以止血。将细胞在 500G 下在 4 摄氏度下离心 5 分钟。使用真空抽吸系统，轻轻吸出并丢弃上清液。每个样品添加 200 微升荧光细胞染色溶液。在PBS中稀释1至100以标记死细胞。用移液器轻轻重新悬浮细胞。然后将细胞在冰上孵育 10 分钟，避光。10分钟后，将细胞在500G下在4摄氏度下离心5分钟。使用真空系统吸出并弃去上清液，在含有2%胎牛血清的PBS中，每个样品加入100微升HCD 45 Brilliant ultraviolet 395抗体，稀释至1至100，以标记人造血细胞。将细胞在冰上孵育 15 分钟，确保它们避光。将细胞在 500G 下在 4 摄氏度下离心 5 分钟。使用真空系统吸出并丢弃上清液。将沉淀重新悬浮在PBS溶液中的一毫升1.6%甲醛中。在室温下孵育10分钟，避光。10分钟后，将细胞在500G下在4摄氏度下离心5分钟。使用真空系统吸出并丢弃上清液。现在将一毫升100%甲醇，在零下20摄氏度下预冷，直接加入两者中。将样品在零下 20 摄氏度下孵育 30 分钟，避光。将细胞在 500G 下在 4 摄氏度下离心 5 分钟。使用真空系统，吸出并丢弃上清液。向每个样品中加入 50 微升抗体混合溶液或同种型对照混合溶液。使用移液器轻轻重新悬浮细胞，将所有样品在 4 摄氏度下孵育过夜，确保它们避光。接下来，将细胞在 500G 下在 4 摄氏度下离心 5 分钟。弃去上清液后，用移液器轻轻重新悬浮细胞，用1000微升PBS洗涤细胞。在4摄氏度下再次以500G离心细胞五分钟。弃去上清液后，使用 1000 微升 PBS 进行第二次洗涤，并用移液器轻轻重悬浮细胞，然后在 4 摄氏度下再次离心细胞。吸出上清液后，将最终样品重新悬浮在200微升PBS中。该图说明了急性髓系白血病患者来源的异种移植小鼠的骨髓细胞中细胞内磷蛋白信号的工作流程、门控策略和正常化，这些小鼠接受基于维奈托克的治疗15天。门控策略根据前向和侧向散射曲线以及 CD45 阳性成功识别了活的人类急性髓性白血病或 AML 细胞，从而能够在所有治疗组中进行一致的分析。Venetoclax 5-阿扎胞苷和 CDZ 尿苷治疗导致 AML 细胞中 STAT5 和 RPS6 的磷酸化增加，表明与耐药相关的生存途径被激活。有趣的是，当小鼠接受吉特替尼治疗时，该治疗并没有显着降低 FLT3 通路蛋白的磷酸化，这表明尽管靶向治疗，信号传导仍然持续存在。磷酸化 STAT5 和磷酸化 RPS6 在基于维奈托克的治疗后表达水平的相关性增加最强，表明这些途径共同激活。