Name: 建立患者来源的结直肠肿瘤类器官和肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL） 的共培养系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学习建立患者来源的结直肠肿瘤类器官与肿瘤浸润淋巴细胞共培养系统，用于研究免疫相互作用及个性化治疗策略。该方法为结直肠癌免疫治疗研究提供重要的临床前平台。

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本工作得到国家自然科学基金 [82172822]、大连市科技局高层次人才创新支持计划 [2021RD02]、辽宁省科技计划联合项目 [2024JH2/102600067] 和辽宁省国际科技合作项目 [2024JH2/101900006] 的支持。

所有涉及人源材料的实验均按照《赫尔辛基宣言》进行，并事先获得大连大学附属中山医院伦理委员会的批准（批准编号：KY2023-206-1）。所有提供临床样本用于本研究的患者均签署了知情同意书。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
纳入标准包括经病理学确诊的原发性结直肠癌组织、足够的样本量（≥1 cm3）、无新辅助治疗史（化疗放疗或靶向治疗）以及签署知情同意书。排除标准包括样本质量差，坏死或纤维化程度超过50%、存在并发严重感染或自身免疫性疾病、有其他恶性肿瘤病史以及患者拒绝参与。
1. 细胞培养试剂的配制
<ol>
	<li>结直肠癌类器官（CRC PDOs）培养基：根据表1中描述的成分配制CRC PDOs完全培养基。</li>
	<li>TILs完全培养基（CM）16：在RPMI1640培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素、HEPES、2-巯基乙醇和3000 IU/mL IL-2。</li>
	<li>TILs扩增培养基（EM）：在RPMI1640培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素、HEPES和600 IU/mL IL-2。</li>
	<li>AdDMEM++++：在高级DMEM培养基中添加1%青霉素-链霉素、1% HEPES、1%谷氨酰胺和5 mM Y-27632。</li>
	<li>结直肠癌组织消化缓冲液：向AdDMEM++++中加入50 µL IV型胶原酶和10 µL青霉素-链霉素-两性霉素B溶液。</li>
	<li>组织洗涤液：向PBS中加入2%青霉素-链霉素。</li>
</ol>
2. 患者来源组织的处理
<ol>
	<li>由经验丰富的外科医生切除原发性结直肠癌肿瘤组织。采集后，将组织分为两部分：将其中一部分置于冰盒中的 AdDMEM++++ 中，运送至实验室用于肿瘤细胞解离与培养；另一部分置于 4% 多聚甲醛中，用于组织病理学分析17。</li>
	<li>将 Matrigel 在 4 °C 冰箱中缓慢解冻。将红细胞裂解缓冲液预热至室温。准备组织剪、镊子、AdDMEM++++ 培养基和结直肠癌组织消化缓冲液。</li>
	<li>将组织转移至培养皿中，用 5&#8239;mL PBS 洗涤三次。更换新的培养皿，再用 5&#8239;mL 组织洗涤缓冲液洗涤三次，以最大限度减少污染。</li>
	<li>用剪刀将组织剪碎，转移至消化缓冲液中，在 37 °C 水浴中孵育 30&#8239;min，直至完全解离。</li>
	<li>用组织剪进一步剪切组织，并转移至组织消化液中。在 37 °C 水浴中进行消化，并持续观察，直至组织完全解离。</li>
	<li>加入等体积的 AdDMEM++++ 以中和消化反应。在 25 °C 下以 380 × g 离心 5&#8239;min。</li>
	<li>用移液器弃去上清液。观察沉淀中红细胞的数量。加入 1–3&#8239;mL 红细胞裂解液，在 25 °C 孵育 10&#8239;min。
	<ol>
		<li>加入等体积的 AdDMEM++++ 终止裂解反应。在约 25 °C 下以 380 × g 离心 5&#8239;min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用移液器弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于适量体积的 AdDMEM++++ 中。</li>
	<li>采用台盼蓝排斥法对活细胞进行定量，获得肿瘤组织的单细胞悬液。</li>
</ol>
3. PDO 模型的建立与 TILs 培养
<ol>
	<li>将肿瘤组织的单细胞悬液分为两部分：一部分用于类器官（PDO）模型的建立，另一部分用于肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的培养。</li>
	<li>细胞计数后，将每孔80,000个细胞的细胞悬液与Matrigel按1:1比例混合，用于PDO模型的建立。</li>
	<li>将剩余的细胞悬液以1 × 106 cells/mL的浓度重悬于完全培养基（CM）中，接种于24孔板进行TILs培养。</li>
	<li>每日观察，拍照记录PDO和TILs的生长状态，每2天更换一次培养基。</li>
</ol>
4. TIL 的纯化与扩增
<ol>
	<li>在纯化前将TILs培养10-20天。</li>
	<li>将TILs收集至离心管中。用新鲜培养基冲洗培养板孔，并收集孔板中残留的细胞。</li>
	<li>在约25 °C条件下，以125 × g离心5&#8239;min。</li>
	<li>用移液器弃去上清液。加入2&#8239;mL PBS洗涤，然后在约25 °C条件下再次以125 × g 离心5&#8239;min。</li>
	<li>进行细胞计数。</li>
	<li>使用CD3+&#160;磁珠分选法分离CD3+T细胞18。</li>
	<li>将抗体与细胞悬液在4 °C孵育10-15 min。</li>
	<li>将磁珠与抗体-细胞悬液在4 °C孵育10-15 min。</li>
	<li>将分选柱放入分选磁铁中。将细胞悬液加入分选柱，仅使磁珠标记的阳性细胞保留在分选柱中。</li>
	<li>将分选柱从磁场中取出。加入缓冲液以洗脱分选柱中保留的阳性细胞。将细胞重悬于2&#8239;mL PBS中，并在约25 °C条件下以195 × g 离心5&#8239;min。</li>
	<li>用移液器弃去上清液。将细胞以1 × 106 个细胞/mL的浓度重悬于12孔板中的新鲜EM培养基中。加入5 µg/mL CD3抗体。每3天将细胞传代至新的培养瓶中。</li>
</ol>
5. 类器官的组织学与免疫组化表征
<ol>
	<li>当类器官生长至50 µm大小时，吸除培养基。</li>
	<li>直接使用4%多聚甲醛固定类器官球体。吸除类器官，于约25 °C下以195 × g离心5&#8239;分钟，将沉淀物包埋于2%琼脂糖中，待其凝固后转移至4%多聚甲醛中过夜固定。</li>
	<li>次日进行梯度脱水处理。制备石蜡包埋块，切取4 µm厚切片，采用梯度溶液复水，随后使用CK7、CK20、Ki-67和CDX-2抗体进行免疫组织化学染色。</li>
</ol>
6. 肿瘤浸润淋巴细胞的免疫荧光表征
<ol>
	<li>纯化肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），培养至获得足够数量后，取出部分细胞用于表征分析。</li>
	<li>采用剥离法对悬浮细胞进行表征。将剥离仪的转速设定为 343 × g ，在约 25 °C 下离心 4&#8239;分钟。</li>
	<li>将细胞计数后以每张载玻片 1 × 104 的密度接种。</li>
	<li>通过离心将细胞牢固地附着于载玻片上。</li>
	<li>用 4% 多聚甲醛固定细胞 15&#8239;分钟，并用 PBS 洗涤三次。</li>
	<li>加入封闭液（含 2% FBS 的 PBS）于室温孵育 1&#8239;小时。</li>
	<li>加入一抗（CD45、CD3、EpCAM）于室温孵育 1&#8239;小时，随后用 PBS 洗涤三次。</li>
	<li>根据制造商推荐浓度配制二抗，并于室温孵育 1&#8239;小时，之后用 PBS 洗涤三次。 
	注意：注意抗体的同源性问题。</li>
	<li>加入 DAPI 于约 25 °C 下孵育 15&#8239;分钟。</li>
	<li>在荧光显微镜下观察染色后的细胞。</li>
</ol>
7. PDOs 与 TILs 共培养系统
<ol>
	<li>向类器官培养基中加入 IFN-γ 以增强抗原呈递。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24&#8239;h15。</li>
	<li>用 PBS 稀释抗 CD28 抗体。通过向每孔加入 50 µL 抗体溶液，对 96 孔板进行包被。用封板膜密封后，在 4 °C 孵育 24&#8239;h。</li>
	<li>孵育 24&#8239;h 后，使用 TrypLE 将类器官消化为单细胞。计数细胞，并用 PBS 洗涤两次。</li>
	<li>收集配对的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），计数细胞，并用 PBS 洗涤两次。</li>
	<li>将类器官以每孔 1 × 104 个细胞接种，TILs 以每孔 1 × 105 个细胞接种，使效应细胞与靶细胞（E:T）比例达到 10:1，进行共培养。</li>
	<li>在补充有 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素、3000&#8239;U/mL IL-2 和 20 µg/mL 抗 PD-1 阻断抗体的 RPMI 1640 培养基中进行共培养。孵育 3 天后，采集图像用于观察和记录。 
	注意：设置未添加 TILs 的类器官作为对照组。</li>
</ol>
8. 通过流式细胞术对肿瘤浸润淋巴细胞进行功能检测
<ol>
	<li>在共培养期结束时收集PDOs和TILs。</li>
	<li>用PBS洗涤细胞两次，每次以300 × g 离心5&#8239;分钟，使用移液器弃去上清液。</li>
	<li>配制含有CD3-FITC、CD4-APC/Cyanine7、CD8-APC、CD107a-PE-Cyanine7、CD279-PE和7-AAD的抗体混合液。</li>
	<li>将细胞重悬于100 µL抗体混合液中，室温避光孵育20&#8239;分钟。</li>
	<li>加入1&#8239;mL PBS洗涤细胞，以300 × g 离心5&#8239;分钟，使用移液器弃去上清液。</li>
	<li>将细胞重悬于500 µL PBS中。</li>
	<li>进行流式细胞术分析。详细的分析策略请参见补充图1。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究利用患者来源的结直肠癌组织，分离获取肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），并建立类器官（PDOs），同时扩增TILs。随后通过共培养系统研究这两组分之间的相互作用。
在以往的研究中，肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）的提取依赖于复杂的仪器设备19，或直接从肿瘤组织悬液中获取20。然而，这些方法通常难以在有限的肿瘤样本条件下于短时间内获得足够数量的TILs，从而限制了其广泛应用。Young-TIL培养技术的建立16显著简化了TILs的制备流程。尽管TILs已在黑色素瘤21、宫颈癌22及其他肿瘤类型23的研究中被广泛使用，但在结直肠癌（CRC）中，TILs的分离及其与患者来源类器官（PDO）模型的共培养研究仍较为有限。
本研究中，将肿瘤浸润性淋...

结直肠癌（CRC）是全球范围内最常见且致死率最高的癌症之一，构成了重大的公共卫生挑战1。尽管在手术、化疗和免疫治疗等治疗手段方面已取得进展，但结直肠癌患者的预后——尤其是转移性疾病的患者——仍然较差。肿瘤微环境（TME）在调控癌症进展和治疗反应中发挥着关键作用，其中肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）作为影响抗肿瘤免疫反应的重要组分日益受到关注2。TILs是一类存在于肿瘤内部的多样化免疫细胞群体，已被确认为结直肠癌的重要预后标志物，较高的TIL浸润水平通常与更佳的临床结局相关3。近期研究还揭示了TILs在其他癌症（如黑色素瘤4和宫颈癌5）中的治疗潜力，基于TIL的免疫治疗在这些肿瘤中已显示出良好的疗效。
然而，尽管肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）在某些癌症类型中已取得成功，其在结直肠癌（CRC）中的应用仍处于持续研究阶段。结直肠癌的复杂性和异质性，加之其免疫抑制性的肿瘤微环境，为基于TIL的有效免疫治疗带来了挑战6。结直肠癌肿瘤通常表现出高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME）7，其特征是存在调节性T细胞（Tregs）、髓系来源的抑制性细胞（MDSCs）以及肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），这些成分均会主动抑制TIL的功能。此外，结直肠癌细胞常表达免疫检查点分子（如PD-L1），可进一步阻碍TIL介导的肿瘤杀伤作用8。同时，结直肠癌肿瘤的遗传异质性及其伴随的免疫抑制性间质，使得TIL难以有效识别并清除肿瘤细胞，因而较难达到在黑色素瘤和宫颈癌中所观察到的治疗效果9。当前研究中的一个关键空白在于缺乏能够准确模拟结直肠癌与TIL之间相互作用的合适体外（in vitro）模型。此类模型对于评估TIL在结直肠癌治疗中的潜力，并优化其在个体化治疗策略中的应用至关重要。
患者来源的类器官（PDOs）已成为模拟人类癌症的有力工具10。这些源自患者肿瘤组织的三维培养物，能够高度模拟原始肿瘤的组织学和遗传学特征，相较于传统的二维细胞系，更能准确地反映肿瘤生物学特性。PDO模型还保留了患者间的异质性，使其成为实现个体化医疗的理想平台11。在结直肠癌（CRC）研究中，PDOs已被用于药物筛选和肿瘤生物学研究12，但其在评估免疫应答——特别是肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）相关研究中的应用仍较为有限。构建PDO与免疫细胞共培养模型时，需在微环境复杂性与实验可控性之间取得平衡。尽管巨噬细胞和树突状细胞等成分可增强模型的仿生性，但由于外周血单个核细胞（PBMCs）易于获取，已成为主流选择。然而，PBMCs中肿瘤特异性T细胞比例较低，且单核细胞亚群可能干扰微环境的稳定性13。相比之下，TILs天然富集了对肿瘤有反应的T细胞克隆，并携带原位耗竭表型，因此在精确解析结直肠癌免疫逃逸机制方面具有更优的建模价值。
本研究的目的是开发一种新型 体外 评估TIL介导的结直肠癌抗肿瘤反应的平台，通过建立结直肠癌PDO与TIL的共培养体系实现。该模型可直接评估TIL对结直肠癌PDO的细胞毒性，并在患者特异性背景下分析免疫反应。利用该系统可能加深对基于TIL的结直肠癌免疫治疗潜力的理解，并支持通过工程化手段增强TIL疗效的策略探索。既往方法受限于TIL数量较少14在大多数情况下，外周血单个核细胞（PBMCs）首先与患者来源类器官（PDOs）共培养两周，随后可从PBMCs中扩增出肿瘤特异性肿瘤浸润性T细胞（TILs），再进一步与PDOs共培养以观察其细胞毒性效应15然而，这种方法也存在建模时间长和总体得率低的问题。相比之下，本文所述方法能够从小体积肿瘤组织样本中分离并建立类器官（PDOs）和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），并可直接进行共培养。该方法在实验操作和效率方面可能更具便利性。最终，该体系旨在为TIL疗法的临床前评估提供一个有力工具，推动个性化治疗策略的发展，从而改善结直肠癌（CRC）患者的治疗效果。

<table><tbody><tr><td>高级DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>sigma</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>BBI</td><td>E672002-0100</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td></td></tr><tr><td>CD107a-PE-Cyanine7</td><td>Biolegend</td><td>328618</td><td></td></tr><tr><td>CD279-PE</td><td>Biolegend</td><td>329906</td><td></td></tr><tr><td>CD3 单克隆抗体 (OKT3)</td><td>Invitrogen</td><td>14-0037-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300406</td><td></td></tr><tr><td>CD45（胞内区）(D9M8I)&amp;nbsp;</td><td>CST</td><td>13917S</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC/Cyanine7</td><td>Biolegend</td><td>300518</td><td></td></tr><tr><td>CD8-APC</td><td>Biolegend</td><td>344722</td><td></td></tr><tr><td>CDX-2</td><td>MXB</td><td>RMA-0631</td><td></td></tr><tr><td>CK20</td><td>MXB</td><td>Kit-0025</td><td></td></tr><tr><td>CK7</td><td>MXB</td><td>Kit-0021</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488 山羊抗兔 IgG</td><td>Abbkine</td><td>A23220</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 549 山羊抗小鼠 IgG</td><td>Abbkine</td><td>A23310</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM</td><td>CST</td><td>36746T</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Cellmax</td><td>SA211.02</td><td></td></tr><tr><td>FGF 10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>胃泌素（人源）</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>人CD3+细胞分离试剂盒（仅供科研使用）</td><td>RWD</td><td>K1201-10</td><td></td></tr><tr><td>人IFN-γ重组蛋白</td><td>PeproTech</td><td>300-02-20UG</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>CST</td><td>9449s</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nivolumab（抗PD-1）</td><td>Sellerk</td><td>A2002&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma</td><td>V900929</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>NCM Biotech</td><td>C100C5</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>Ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解液</td><td>thermo-invitrogen</td><td>00-4300-54</td><td></td></tr><tr><td>重组人IL-2（无载体）</td><td>Biolegend</td><td>589104</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sellerk</td><td>S1077</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝染液</td><td>thermo-invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF 纯化抗人CD28抗体</td><td>Biolegend</td><td>302934</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF 纯化抗人CD3抗体</td><td>Biolegend</td><td>317325</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sellerk</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

建立患者来源的结直肠肿瘤类器官与肿瘤浸润淋巴细胞（tils）共培养体系

Establishment of a Co-culture System of Patient-Derived Colorectal Tumor Organoids and Tumor-Infiltrating Lymphocytes (TILs)

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症。肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）已被确定为结直肠癌的重要预后标志物。TILs 的治疗应用在黑色素瘤和宫颈癌中已显示出良好的疗效。然而，其在结直肠癌治疗中的应用仍处于探索阶段。一种合适的 体外 目前尚无有效的模型用于评估肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的疗效，这限制了该领域的进一步发展。源自患者的类器官（PDO）模型能够高度保留原始肿瘤组织的特征，并反映患者间的异质性，为研究结直肠癌（CRC）与TIL之间的相互作用提供了优良平台。本研究描述了一种从新鲜切除的肿瘤组织中建立患者来源的结直肠癌类器官模型的方法，并进一步分离与扩增TIL。该体系可实现结直肠癌类器官与TIL的共培养，从而评估TIL介导的细胞毒性和免疫应答。通过分析TIL对类器官的杀伤效果，可预测基于TIL的免疫治疗在个体化结直肠癌治疗中的潜在疗效。此外，对TIL进行进一步的工程化改造可能增强其抗肿瘤活性，为开发更有效的细胞治疗策略提供新途径。该PDO-TIL共培养模型为结直肠癌中TIL疗法及个体化治疗策略的临床前评估提供了有力工具。

结直肠癌类器官（CRC PDOs）的建立与表征 
肿瘤样本取自结直肠癌（CRC）患者。采用新鲜切除的结直肠癌肿瘤组织建立类器官（PDOs）和肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），并进一步用于PDO-TIL共培养实验（图1）。
<img alt="肿瘤消化流程；PDO-TILs 共培养；流式细胞术；细胞毒性检测；CRC 方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68346/68346fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：整体实验流程示意图。 该图展示了实验设计的各个连续步骤，包括结直肠癌类器官（CRC PDOs）的建立、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的扩增以及共培养实...

本方案描述了一种建立患者来源的结直肠癌（CRC）类器官模型的方法，该模型与肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）共培养，用于研究二者之间的相互作用及其治疗潜力。该模型为研究肿瘤微环境中的免疫应答以及预测基于TIL的疗法在个体化CRC治疗中的疗效提供了临床前研究平台。

建立患者来源的结直肠肿瘤类器官与肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）共培养体系

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症。肿瘤浸润性淋巴细胞（TILs）已被确定为重要的预后……

本研究旨在探索肿瘤浸润性淋巴细胞与结直肠癌类器官之间的相互作用，以及基于肿瘤浸润性淋巴细胞的疗法在个体化结直肠癌治疗中的治疗潜力。我们的方案简化了从淋巴细胞中分离肿瘤浸润性淋巴细胞的过程，并实现了其与结直肠癌类器官的共培养，从而克服了患者治疗中疗效不佳和常见不良反应的问题。[旁白] 首先，准备好实验试剂和实验服以供使用。然后用五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）将原发性结直肠癌肿瘤组织冲洗三次，随后用组织洗涤缓冲液洗涤。使用组织剪将组织剪切成小片段。将剪碎的组织转移至结直肠癌消化缓冲液（CRC digestion buffer）中。将样品置于37°C水浴中孵育30分钟，直至组织完全解离。然后向消化后的样品中加入等体积的Ad DMEM培养基以中和反应。在25°C条件下，以380×g离心5分钟。随后用移液器弃去离心后样品的上清液。向沉淀中加入1至3毫升预热的红细胞裂解缓冲液，于25°C孵育10分钟。加入等体积的Ad DMEM培养基以终止裂解反应。在约25°C条件下，以380×g离心5分钟。弃去上清液后，用适量Ad DMEM培养基重悬细胞沉淀。向悬液中加入台盼蓝以计数活细胞，并获得肿瘤组织的单细胞悬液。将肿瘤组织的单细胞悬液分为两部分。其中一部分用于建立患者来源类器官模型，另一部分用于培养肿瘤浸润性淋巴细胞。细胞计数后，将每孔80,000个细胞与Matrigel以1:1比例混合，用于类器官培养。将剩余的细胞悬液重悬于完全培养基中，接种至24孔板。将肿瘤浸润性淋巴细胞收集至离心管中。用新鲜培养基冲洗孔板，以回收残留细胞，并转移至同一离心管中，随后进行离心。弃去上清液后，用2毫升PBS洗涤细胞沉淀，再次离心。接下来，使用CD3阳性磁珠分选并分离CD3阳性T细胞。将分选柱置于磁力架上，然后将细胞悬液转移至分选柱中，使磁珠标记的细胞保留在柱内。分选完成后，将分选柱从磁铁上取下，加入缓冲液洗脱保留的阳性细胞。将洗脱的细胞重悬于2毫升PBS中，并进行离心。用移液器弃去上清液。将细胞重悬于12孔板中，加入新鲜EMEM培养基，细胞浓度为每毫升100万个细胞。加入CD3抗体，终浓度为每毫升5微克。向类器官培养基中加入干扰素γ，以增强抗原呈递。将培养物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时。用PBS将抗CD28抗体稀释至每毫升2微克的浓度。向96孔板的每个孔中加入50微升抗体溶液，进行包被。然后用封板膜密封板子并进行孵育。24小时后，使用TrypLE将类器官解离为单细胞并进行计数。随后用PBS洗涤细胞两次。收集配对的肿瘤浸润性淋巴细胞。使用细胞计数仪或血细胞计数板对细胞进行计数，并用PBS洗涤两次。将类器官以每孔10,000个细胞的密度接种至各孔。将肿瘤浸润性淋巴细胞以每孔100,000个细胞的密度接种，使效应细胞与靶细胞的比例达到10:1。在添加补充物的RPMI 1640培养基中进行

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建立患者来源的结直肠肿瘤类器官和肿瘤浸润淋巴细胞 （TIL） 的共培养系统

本文描述了一种建立原代小鼠结肠肿瘤类器官的简单方法。该方法利用了结肠肿瘤细胞能够在含有有限生长因子的培养基中存活并生长成类器官，而正常结肠上皮细胞则不能的特性。...

体外 原代小鼠结肠肿瘤类器官培养

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结直肠癌原位小鼠模型中循环肿瘤细胞的分离

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多维共培养系统模拟肺鳞状细胞癌进展

患者来源的类器官（PDOs）是转化癌症研究中的有力工具，能够反映疾病的遗传和表型异质性以及对个体化抗癌治疗的响应。本文详细描述了一种用于建立人类原发性膀胱癌PDOs的整合性实验方案，为后续开展表型分析和药物反应评估做好准备。...

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本文提供了一种从患者来源的乳腺肿瘤切除组织或正常乳腺组织建立人乳腺类器官的详细方案。该方案提供了培养、冻存和复苏人源性乳腺类器官的全面分步操作指南。...

建立和培养患者来源的乳腺类器官

肿瘤类器官已彻底改变了癌症研究及个体化医疗的方法。它们代表了一种具有临床相关性的肿瘤模型，使研究人员能够在临床治疗中领先于肿瘤的发展。本方案建立了源自新鲜胰腺肿瘤组织样本及胰腺腺癌患者来源异种移植瘤的肿瘤类器官。...

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本方案描述了一种从同一食管鳞状细胞癌（ESCC）患者中同时分离癌类器官、癌相关成纤维细胞（CAFs）和非肿瘤相关成纤维细胞（CFs）的方法。使用这些来自同一患者的匹配样本可避免个体间差异带来的问题，为ESCC研究提供合适的实验平台。...

从同一食管癌患者建立肿瘤类器官、癌相关成纤维细胞及配对正常成纤维细胞

以下实验方案重点介绍建立患者来源的软组织肉瘤（STS）原代培养的方法。该模型有助于我们更深入地理解这些罕见恶性肿瘤的分子基础和药物反应特征，并可为后续改善STS治疗策略的研究提供起点。...

建立患者来源软组织肉瘤的原代培养

学习建立患者来源的结直肠肿瘤类器官与肿瘤浸润淋巴细胞共培养系统，用于研究免疫相互作用及个性化治疗策略。该方法为结直肠癌免疫治疗研究提供重要的临床前平台。

建立患者来源的结直肠肿瘤类器官与肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）共培养体系

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