可重复制造SPOT作为高通量基于支架的培养平台

我们的研究重点是开发高通量、支架支持的平台，用于稳定、可重复的患者来源类器官培养，以改进药物筛选检测流程，并推动疾病建模的进展。

自动化液体处理系统、支架支撑的水凝胶平台、器官芯片技术以及单细胞检测方法（如流式细胞术和CYTOPs）是目前可用的一些技术。

目前面临的挑战包括维持水凝胶的完整性、克服凝胶弯月面以实现实时成像，以及确保在长期基于类器官的检测中细胞分布的均匀性。

本方案可实现稳定、基于支架的水凝胶加样，最大限度减少弯月面问题，支持类器官的长期培养，并能与自动化液体处理系统和高内涵成像系统无缝整合。

我们最期待利用我们的疾病建模平台来探索癌症中的疾病进展机制以及肥胖症的发展过程。

[指导教师] 首先，取一个用于96孔或384孔SPOT的PMMA图案支架。修剪支架蓝色区域周围的多余纸张，保留周边约五毫米的白色边缘。确保最终得到的片材尺寸约为760毫米×1,300毫米。准备组装96孔SPOT支架时，将一片聚乙烯薄膜覆盖在刚性丙烯酸支撑板上。将覆有薄膜的支撑板放置于工作台面，再将支架置于聚乙烯薄膜之上。用直尺对准支架前两行之间的边缘，以避免在孔位区域进行压痕。将压痕轮置于支架底部，沿直尺引导自下而上滚动至顶部。对于384孔SPOT支架，则无需进行压痕处理。接下来，将支架粗糙面向上放置于PDMS板上，确保行方向为水平。利用引线确定哪一侧为粗糙面，然后将支架平整地贴合到PDMS板上，以消除皱褶或气泡。移除双面胶带未刻蚀面的保护层。将胶带中部略微弯曲，使胶带中间两列与支架对齐。随后，将胶带中心按压到支架上以固定位置，并从中心向外抚平胶带，使其均匀粘附。使用镊子轻轻将支架从PDMS板上揭起。将PDMS板保存以备后续使用。为将支架连接至第二条带孔胶带，翻转支架使其光滑且无胶的一面朝上放置于工作台。移除第二条胶带刻蚀面中间的保护层，暴露其中央两列。将第二条胶带中部略微弯曲，与支架中间两列对齐，然后按压胶带中心以固定位置。若使用的是刻蚀胶带，则移除暴露区域两侧剩余的保护层，并从中间向外围抚平胶带。为将支架连接至无底板，移除保护层。将支架置于带盖的无底板下方并对齐。对齐后，从中间向下按压使其固定。若使用刻蚀胶带，则移除相邻保护层，并从中心向外将支架抚平贴合至板上。为将支架连接至聚碳酸酯薄膜，使用镊子小心地从聚碳酸酯薄膜一侧松开保护层，然后缓慢剥离保护层，避免在薄膜上造成任何压痕。重复此操作处理第二侧，随后将薄膜暂放于工作台备用。剥离板底的保护胶带层，并从中心向外将聚碳酸酯薄膜压贴至支架上。然后用力按压聚碳酸酯薄膜，确保每个孔均具有清晰边界。使用精密刀具，小心切除板底部多余的材料。完成全部组装后，将96孔SPOT板放入透明可重复封口的塑料袋中，并移出生物安全柜。在板下方放置一块刚性丙烯酸支撑板，并在对角两端夹紧固定。将组装好的板存放于洁净干燥处，待后续使用。在为期30天的测试期间，当384孔SPOT板中交替的孔分别填充荧光素和PBS时，未观察到任何培养基渗漏或交叉交换现象，证实PMMA屏障在维持孔间隔离方面的有效性。将表达GFP的胰腺肿瘤类器官接种至96孔SPOT板后，类器官从培养第0天至第12天持续存活并逐步扩增。在第12天，SPOT培养的类器官显示出强烈的细胞角蛋白19和闭合小环蛋白-1表达，并可见内部腔样结构。在384孔SPOT板中，组织接种效果的次优与最优结果可通过边缘清晰度和细胞分布均匀性进行直观区分。使用自动化液体处理系统，可在整个96孔SPOT板和384孔SPOT板上实现一致且均匀的接种效果。