Name: 在斑马鱼幼虫中自动植入肿瘤，用于癌症研究和医学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: 了解利用自动化注射系统在斑马鱼幼虫中进行肿瘤异种移植的完整实验方案。该方法支持静脉给药并可在体内功能性地测试抗癌药物疗效，为基础研究和临床实验室提供可靠的癌症模型构建技术。

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我们衷心感谢Eurostars计划通过ROBO-FISH项目（项目编号：E! 114899）以及EIC-PATHFINDER计划通过ALADDIN项目（项目编号：101130574）对本研究的资助。

斑马鱼品系的维持遵循标准方案（https://zfin.org），并依照当地动物福利法规进行操作。这些法规落实了欧洲理事会《实验动物保护指南》（指令86/609/EEC），允许使用斑马鱼幼体至开始自由摄食前（受精后5天）。由于本研究中使用的所有幼体均不超过5天龄，根据指令86/609/EEC无需获得伦理许可。
注意：在使用自动注射仪开始&#160;操作之前，应预先准备好去壳的48小时斑马鱼幼鱼以及待注射到这些幼鱼中的材料。相关操作步骤详见本文的补充方法（补充文件1）。本实验方案的流程示意图见图1。补充图1展示了斑马鱼胚胎发育阶段的示意图。
1. 微针制备
注意：注射需要使用微针，微针是注射过程中用于排查问题和优化操作的关键要素。自动注射器可使用商用微针或手工拉制的微针。以下是使用 Sutter Instrument P-1000 或 PC-10 手工拉制微针的操作步骤，尽管大多数微针拉制仪的操作原理相似。理想的微针形态应具有逐渐变细的 6–8 mm 锥形部分，尖端直径为 0.3–0.7 µm，在注射前需使用尖头镊子手动折开尖端。
<ol>
	<li>准备合适的硼硅酸盐玻璃毛细管：外径 1.0 mm，内径（ID）0.78 mm。确保其清洁，无灰尘和碎屑。</li>
	<li>检查加热丝是否完好且处于良好状态。</li>
	<li>将玻璃毛细管插入夹具中，并使用夹具螺丝牢固固定，但不要过紧以免管体破裂。</li>
	<li>调整设置：加热值、拉力强度和斜坡时间。使用 PC-10 毛细管拉制仪时，采用单步拉制模式，加热设置为 68 并使用全重锤，可获得理想的针尖形态。 
	注意：这些参数会影响针尖锥部的长度和宽度，具体数值可能因毛细管壁厚不同而有所变化。需通过反复试验调整以获得最佳结果。</li>
	<li>小心地从夹具中取出针尖，避免损伤尖端。检查尖端，确保锥度均匀。</li>
	<li>将微针小心地存放在胶带上，确保精细的针尖不会&#160;接触任何表面。</li>
</ol>
2. 机器人注射用琼脂糖凝胶板的制备
<ol>
	<li>称取 0.6 g 琼脂糖，转移至一个 100 mL 玻璃瓶中。</li>
	<li>使用量筒量取 40 mL E3 溶液，加入装有琼脂糖的玻璃瓶中，配制成 1.5% 的琼脂糖溶液。</li>
	<li>将玻璃瓶放入微波炉中，以 900 W 加热 30 秒，随后每次继续加热 30 秒，并在每次加热间隔之间佩戴手套轻轻旋转瓶身，直至琼脂糖完全溶解。 
	注意：操作时需小心，因为摇动可能引发暴沸。</li>
	<li>琼脂糖完全融化后，将玻璃瓶外壁置于流动水下冷却，直至瓶壁触感温热但不烫手（约 60 °C）。</li>
	<li>清洁并彻底干燥可重复使用的载玻片夹具和玻璃载片。将玻璃载片插入夹具侧面的插槽中进行组装（补充图 2A），然后将其放置于平坦表面上。 
	注意：请检查玻璃载片是否未从夹具侧面突出。</li>
	<li>将约 40 mL 琼脂糖混合液倒入玻璃载片上，确保其充分铺展并覆盖整个表面。如有必要，可轻微倾斜使液体到达所有边缘。</li>
	<li>静置约 5 分钟，使琼脂糖凝固。此时载片即可使用。 
	注意：在凝固的琼脂糖平板表面添加 E3 溶液可防止干燥，但在用于注射前应将其去除。</li>
</ol>
3. 将斑马鱼幼体放置于琼脂糖凝胶板上
<ol>
	<li>用 E3 溶液润湿琼脂糖凝胶板。</li>
	<li>将培养板倾斜，使多余的 E3 溶液自然流走并收集。</li>
	<li>在培养皿中准备含有 40 µg/mL 三卡因的 E3 溶液。将约 20 条幼鱼放入该溶液中，使其麻醉 2 分钟。</li>
	<li>小心地将 10–20 条麻醉后的幼鱼转移至凝胶板上（补充图 2B），确保多余水分自然排出。</li>
	<li>确保幼鱼彼此分开、互不接触，并避免将其放置在距离板边缘过近（5–10 mm）的位置（补充图 2B）。</li>
	<li>去除板上多余的液体，同时确保幼鱼保持湿润。 
	注意：过多液体可能导致注射过程中幼鱼发生非预期移动，而湿度过低则可能增加死亡率。</li>
</ol>
4. 装载微针
注意：在进行注射前，立即将高密度的荧光标记细胞加载到微针中。细胞可遗传表达荧光标记物，也可使用化学标记方法23。尽管每次注射到每条幼虫中的细胞数量相对较少，通常为 700 至 900 个细胞，但由于注射体积极小（约 2 nL），在注射阶段细胞密度必须较高，约为每 µL 300,000 至 500,000 个细胞。
<ol>
	<li>将细胞悬液在 200 × g 条件下离心 5 分钟，并弃去细胞培养基。</li>
	<li>使用细胞计数仪对细胞进行计数，然后将细胞沉淀重悬于无菌的室温（RT）磷酸盐缓冲液（PBS）中，调整至终浓度为 300,000 个细胞/µL。</li>
	<li>取一支预先制备好的微针，用拇指和食指小心夹住。然后使用微载样移液枪头，根据所需细胞数量，向微针中加入 1–10 µL 细胞悬液。 
	注意：将枪头插入微针末端，在填充过程中缓慢向外抽出。</li>
	<li>在 4 倍体视显微镜下，使用一对精细镊子小心折断微针的封闭尖端，以形成开口。此步骤也可在加载注射悬液前完成。 
	注意：斜面针尖有助于穿刺，可使用针头研磨器制备。若使用针头研磨器，应在加载注射悬液前完成针尖斜面处理。此种情况下，微针在加载细胞前已处于开放状态。</li>
</ol>
5. 显微注射机器人的操作
<ol>
	<li>执行启动程序。
	<ol>
		<li>确保已连接充足的气体供应并已打开。 
		注意：建议从实验室集中供气系统或空气压缩机输入的压力为 0.6 MPa（6 bar）。空气压缩机或阀门可保持持续开启，无需频繁关闭。输入压力可使用压缩空气、氮气或 CO2。</li>
		<li>将U盘插入机器人背面的任一接口（可选）。 
		注意：U盘应在机器人通电前插入，并仅在机器人完全断电后拔出。</li>
		<li>按下屏幕旁的绿色电源按钮以开启机器人（补充图2C）。等待控制面板出现（约1分钟）。</li>
		<li>检查机器人左右两侧是否有15 cm的自由空间，然后在弹出窗口中点击确定（补充图2D）。</li>
		<li>在下一个关于U盘的弹出窗口中点击确定（补充图2E）。 
		注意：若未插入U盘，则此弹出窗口不会出现。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置远程控制连接（可选）。 
	注意：远程控制用于远距离查看和操作设备。该功能在演示、培训、软件更新和故障排查时非常有用。
	<ol>
		<li>将网线插入机器背面的端口。初次设置时，请联系IT部门协助。</li>
		<li>点击屏幕左上角的菜单图标（补充图2F）。</li>
		<li>点击菜单底部中央的设置图标（补充图2F）。</li>
		<li>在设置菜单中选择维护模式（补充图2G）。</li>
		<li>点击连接至LSM以启动远程连接（补充图2H）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行注射设置。
	<ol>
		<li>在菜单中点击注射设置（补充图2F）。</li>
		<li>选择适合注射的斑马鱼幼鱼发育阶段（补充图3A）。 
		注意：对于Cuvier管、卵黄周隙和后脑室的注射，推荐使用在28.5 °C下培养48小时的幼鱼（48 hpf）。</li>
		<li>从提供的选项中选择首选的注射位点（补充图3B）。</li>
		<li>在斑马鱼幼鱼的示意图上选择注射位置。调整幼鱼图示、针尖位置和针头方向，使其与所选注射位点对齐（补充图3C）。 
		注意：不同注射位点的推荐针头位置已在先前发表的论文中提供22。对于Cuvier管（DoC）注射，通常将针头置于DoC中部，因为该区域血流较强。针头方向可为背侧或腹侧。对于卵黄周隙（PVS）注射，建议从该空间边缘开始进针，并以约30–45°角相对于脊索定位。对于后脑室注射，建议从后脑外部开始进针，以防滑脱，针头角度应与眼睛和耳泡之间的连线对齐。</li>
		<li>选择注射宏程序，提供自动和手动两种模式选项（补充图3D）。 
		注意：在自动模式下，注射位点名称表示注射过程由系统自主完成。手动模式下，机器人将自动定位并接近幼鱼，一旦识别到幼鱼，将出现控制界面供用户操作注射过程。</li>
		<li>完成注射设置后，点击继续进行针头校准，以进入针头校准步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>执行针头校准。 
	注意：由于每根针头均存在差异，需校准针尖位置。针头校准的初始界面如补充图3E所示。
	<ol>
		<li>牢固握住针头夹具，逆时针旋转金属部分，将针头夹具从机器人上拆下。</li>
		<li>将已填充液体的针头钝端插入针头夹具的截锥形一侧。</li>
		<li>点击屏幕上显示的移动载物台以安装针头（补充图3E）。载物台将移动至安全位置以便安装针头，并显示标尺（补充图3F）。使用标尺测量针头夹具外部的针头长度，应约为22 mm。</li>
		<li>握住装有液体的针头夹具，顺时针旋转金属部分以牢固拧紧连接（补充图3G）。按下确定继续。</li>
		<li>在弹出界面中，通过调节机器上的两个螺丝（补充图3I），将针头置于圆圈中心（补充图3H）。居中后，点击绿色对勾。</li>
		<li>在下一个弹出界面（补充图3J）中，旋转机器人头部后方的螺丝（补充图3K）以调节针尖焦距。聚焦完成后，点击绿色对勾。机器人将自动校准针头高度，随后旋转针头并在每次旋转时以红点显示注射位置（补充图3L）。</li>
		<li>完成后，点击屏幕右下角的知道了和继续进行液滴校准。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>执行液滴校准。 
	注意：通过在矿物油中注射来校准液滴大小。
	<ol>
		<li>准备一个6孔板，其中一个孔加入10 mL矿物油，另一孔加入10 mL清洗缓冲液（如PBS或水）。将6孔板放置在板架左侧位置。 
		&#8203;注意：请在（整个）实验过程中取下6孔板盖子，以便在针头堵塞或更换新针头时可重复使用。</li>
		<li>点击使用孔板进行校准旁的图标（补充图4A）。</li>
		<li>选择油孔和清洗孔的位置（补充图4B）。</li>
		<li>点击生成液滴，根据屏幕左侧显示的参数生成液滴（补充图4C）。根据需要调整注射压力、回压和气脉冲持续时间，以达到目标体积。或者，点击自动优化按钮，系统将自动优化参数以实现所需体积。</li>
		<li>若针头堵塞，按下蓝色清洗针头按钮（补充图4C），在盛有水或培养基的孔中启动高压清洗脉冲。</li>
		<li>若针头和液滴图像模糊，使用屏幕右侧第三个按钮调节针头和液滴的焦距（补充图4C）。</li>
		<li>点击绿色对勾关闭界面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>执行板选择。
	<ol>
		<li>点击移动载物台以放置板，机器人将自动将载物台移至适合放置板的位置。</li>
		<li>检查琼脂糖凝胶板底部是否干燥，并将含有麻醉幼鱼的板正确放置在板架右侧位置。</li>
		<li>然后，点击确定并点击继续进行注射，以进入注射流程（补充图4D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>执行注射。
	<ol>
		<li>在注射界面中，点击开始按钮以启动注射过程（补充图4E）。过程开始时，机器人载物台移动，系统扫描琼脂糖板以寻找幼鱼（补充图4F）。识别到幼鱼后，针头将自动导航至指定注射位点，并自动调整至预设角度。</li>
		<li>若选择自动模式，机器人将在选定位置无缝执行注射（补充图4G）。完成当前注射后，机器人将继续扫描板上下一个幼鱼以进行注射。</li>
		<li>若选择手动模式，当针头接近幼鱼时将出现手动控制界面（补充图4H）。使用蓝色和黄色箭头移动针头，并使用屏幕左侧的圆形旋转按钮调节针头方向。当针头进入幼鱼体内后，点击红色液滴按钮执行注射。或者，点击m键以启动宏程序自动完成注射。</li>
		<li>当所有幼鱼均完成注射后，点击停止按钮关闭注射界面。针头将自动移入油孔中。</li>
		<li>小心取下含有已注射幼鱼的板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转移已注射的斑马鱼幼鱼。
	<ol>
		<li>为转移已注射的幼鱼，将板倾斜置于培养皿上方，使用移液器或挤压瓶以可控水流轻轻冲洗出幼鱼。</li>
		<li>从顶部开始，向下移动以实现有效冲洗。</li>
		<li>移除任何死亡的幼鱼，更换为新鲜E3溶液，并将培养皿放入培养箱。 
		注意：若注射了人类癌细胞或临床样本，应将培养皿置于33–36 °C培养；否则，在28.5 °C下培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 关闭机器人
<ol>
	<li>注射完成后，进入针头校准菜单并点击移动载物台以移除针头（补充图3E），随后拔出针头。若需将针头保留在仪器中以备后续使用，请跳过此步骤。</li>
	<li>进入菜单，点击位于左下角的电源按钮（补充图2D）。</li>
	<li>按下停放针头按钮以保存针头（补充图4I）。</li>
	<li>否则，点击确定。仪器将关闭，关机完成后绿色电源按钮的指示灯将熄灭。 
	注意：当机器人处于空闲状态时，应在两个多孔板支架中均放置空的多孔板，以防止灰尘进入仪器内部。</li>
</ol>
7. 去除琼脂糖凝胶并纯化
<ol>
	<li>从制胶板上取下琼脂糖凝胶，并小心地（佩戴护目镜和手套）将玻璃板从制胶架上取下。</li>
	<li>用温水和乙醇彻底清洗玻璃板和制胶架，确保干燥后再重复使用。 
	注意：所有凝胶板应在使用后立即清洗，因为琼脂糖凝胶在湿润状态下更容易去除。</li>
</ol>

<ol><li>Goetz, L. H., Schork, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+medicine%3A+motivation%2C+challenges%2C+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Personalized medicine: motivation, challenges, and progress.</a> Fertil Steril. 109 (6), 952-963 (2018).</li>
<li>Jorgensen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+years+with+personalized+medicine%3A+Past%2C+present%2C+and+future+of+individualized+pharmacotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Twenty years with personalized medicine: Past, present, and future of individualized pharmacotherapy.</a> Oncologist. 24 (7), e432-e440 (2019).</li>
<li>Ashley, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Towards precision medicine.</a> Nat Rev Genet. 17 (19), 507-522 (2016).</li>
<li>Binotto, M., Reinert, T., Werutsky, G., Zaffaroni, F., Schwartsmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health-related+quality+of+life+before+and+during+chemotherapy+in+patients+with+early-stage+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ecancermedicalscience%22%5BJournal%5D)">Health-related quality of life before and during chemotherapy in patients with early-stage breast cancer.</a> Ecancermedicalscience. 14, 1007(2020).</li>
<li>Nalla, L. V., Kanukolanu, A., Yeduvaka, M., Gajula, S. N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+single-cell+proteomics+and+mass+spectrometry-based+techniques+for+unmasking+cellular+diversity+in+triple+negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Advancements in single-cell proteomics and mass spectrometry-based techniques for unmasking cellular diversity in triple negative breast cancer.</a> Proteomics Clin Appl. 19 (1), e202400101(2025).</li>
<li>Lindahl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+tumour+xenograft+models%3A+a+prognostic+approach+to+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precis+Oncol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish tumour xenograft models: a prognostic approach to epithelial ovarian cancer.</a> NPJ Precis Oncol. 8 (1), 53(2024).</li>
<li>Duan, X. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+clinical+trial+design+in+precision+medicine%3A+discovery%2C+development+and+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">New clinical trial design in precision medicine: discovery, development and direction.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 57(2024).</li>
<li>Research and development in the pharmaceutical industry. , Congressional Budget Office. 
 <a target="_blank" href="https://www.cbo.gov/publication/57126">https://www.cbo.gov/publication/57126</a> (2021).</li>
<li>Dusetzina, S. B., Oberlander, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+price+of+progress%3A+Managing+prescription+drug+spending%5BTitle%5D)+AND+%22J+Health+Polit+Policy+Law%22%5BJournal%5D)">The price of progress: Managing prescription drug spending.</a> J Health Polit Policy Law. 47 (6), 621-628 (2022).</li>
<li>Nagar, S., Rand, L. Z., Kesselheim, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+should+US+policymakers+learn+from+international+drug+pricing+transparency+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+J+Ethics%22%5BJournal%5D)">What should US policymakers learn from international drug pricing transparency strategies.</a> AMA J Ethics. 24 (11), E1083-E1090 (2022).</li>
<li>You, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+in+cancer+target+identification+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence in cancer target identification and drug discovery.</a> Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 156(2022).</li>
<li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Avatar-test+forecasts+clinical+response+to+chemotherapy+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Avatar-test forecasts clinical response to chemotherapy in patients with colorectal cancer.</a> Nat Commun. 15 (1), 4771(2024).</li>
<li>Ali, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+patient-derived+xenograft+models+predict+lymph+node+involvement+and+treatment+outcome+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish patient-derived xenograft models predict lymph node involvement and treatment outcome in non-small cell lung cancer.</a> J Exp Clin Cancer Res. 41 (1), 58(2022).</li>
<li>Rouhi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+metastasis+model+in+embryonic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).</li>
<li>Grissenberger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+drug+screening+in+zebrafish+xenografts+reveals+high+efficacy+of+dual+MCL-1%2FBCL-X%28L%29+inhibition+against+Ewing+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-X(L) inhibition against Ewing sarcoma.</a> Cancer Lett. 554, 216028(2023).</li>
<li>Pascoal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+zebrafish+larvae+as+a+xenotransplantation+model+to+study+Ewing+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using zebrafish larvae as a xenotransplantation model to study Ewing sarcoma.</a> Methods Mol Biol. 2226, 243-255 (2021).</li>
<li>Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+avatars+towards+personalized+medicine-A+comparative+review+between+avatar+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Zebrafish avatars towards personalized medicine-A comparative review between avatar models.</a> Cells. 9 (2), 293(2020).</li>
<li>Costa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Avatars+of+rectal+cancer+patients+validate+the+radiosensitive+effect+of+metformin%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Avatars of rectal cancer patients validate the radiosensitive effect of metformin.</a> Front Oncol. 12, 862889(2022).</li>
<li>Tavares Barroso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+pancreatobiliary+cancer+zebrafish+avatars+for+chemotherapy+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening.</a> Cells. 10 (8), 2077(2021).</li>
<li>Holland, I., Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automation+in+the+life+science+research+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Automation in the life science research laboratory.</a> Front Bioeng Biotechnol. 8, 571777(2020).</li>
<li>Brito, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+to+enhance+rigor+and+reproducibility+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gigascience%22%5BJournal%5D)">Recommendations to enhance rigor and reproducibility in biomedical research.</a> Gigascience. 9 (6), giaa056(2020).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microinjection+for+zebrafish+xenograft+models%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biomed+Innov%22%5BJournal%5D)">Automated microinjection for zebrafish xenograft models.</a> NPJ Biomed Innov. 2, 13(2025).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Martinez-Lopez, M., Povoa, V., Fior, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+zebrafish+larval+xenografts+and+tumor+behavior+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis.</a> J Vis Exp. (172), e62373(2021).</li>
<li>Groenewoud, A., Yin, J., Snaar-Jagalska, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ortho-+and+ectopic+zebrafish+xeno-engraftment+of+ocular+melanoma+to+recapitulate+primary+tumor+and+experimental+metastasis+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ortho- and ectopic zebrafish xeno-engraftment of ocular melanoma to recapitulate primary tumor and experimental metastasis development.</a> J Vis Exp. (175), e62356(2021).</li>
<li>Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+behavior+of+human+breast+cancer+cells+in+embryonic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish.</a> J Vis Exp. (122), e55459(2017).</li>
</ol>

Y.D.、K.J.v.d.K. 和 J.d.S. 供职于 Life Science Methods 公司，该公司对本出版物中所使用的机器人系统拥有商业权益。其余作者声明无利益冲突。

自动化注射装置的开发与实施代表了斑马鱼肿瘤异种移植在抗癌药物筛选和精准医学领域的一项重大进展。据我们所知，这是首个 commercially available（商业化）的机器人系统，可用于将细胞悬液自动注射到斑马鱼幼鱼中，因此本方案适用于所有涉及高通量此类注射的研究。通过实现注射过程的自动化，该系统进一步减少了操作人员的疲劳，并显著缩短了相比手动注射所需的培训周期，使新建立的实验室能够轻松采用这一原本复杂的技术14。我们此前曾比较了通过传统手动方法与该机器人方法分别向Cuvier管、卵黄囊周隙以及后脑室进行注射的成功率和幼鱼存活率。平均而言，全自动注射系统的成功率达到60%，幼鱼存活率超过70%，与手动方法相当，而注射速度却提高了两倍22。此外，在四个欧洲实验室中开展了系统性评估，使用了多种不同类型的细胞，包括乳腺癌、膀胱癌和胶质瘤细胞系，以及临床患者样本和肿瘤浸润性淋巴细胞22。该系统在所有细胞类型和注射位点均成功完成了注射，证明了其在转化癌症研究中的稳健性和多功能性。下文列出了确保注射操作...

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Erratum: Automating Tumor Implantation in Zebrafish Larvae for Cancer Research and Medicine

随着我们对癌症行为和药物耐药性认识的不断深入，人们日益明确需要更精准地诊断、鉴定和靶向治疗癌症亚型。在过去二十年中，个体化医学（又称精准医学）领域的研究文献持续增多，&#160;精准医疗）的兴起势头正盛1,2精准医学的定义正是基于个体患者的疾病特征来定制医疗方案3。这符合我们目前的认识，即并不存在一种适用于所有人的药物，这一点在癌症治疗中尤为明显和重要。然而目前，大多数癌症患者仍缺乏具有临床相关性的精准医疗手段，因此选择最适宜治疗方案的过程仍依赖于试错法。这导致了&#160;导致显著的延误和不必要的痛苦，生活质量下降，生存期缩短。重要的是，经过数个无效的化疗方案后生活质量下降的患者可能会选择转为姑息治疗4采用合适的个体化筛查方法，可以更精确且及时地进行药物筛选。尽管对癌细胞进行基因组和蛋白质组测序是可行的5，这类分子数据总体上对患者预后的预测能力较差，且通常临床价值有限6在药物开发过程中，尽早采用精准医学方法可显著提高药物研发各阶段关键节点的成功率。事实上，尽早明确哪些候选药物具有最广泛的个体间疗效特征，或明确哪些癌症亚型对特定候选药物尤为敏感，有助于降低风险，并提升后期临床前试验与临床试验的效率。7. 随着制药行业的不断发展&amp;#38;D 成本8，日益增长的降低药价的政治压力9,10以及人工智能驱动的靶点验证技术的进步11在药物开发中，对大规模、高效且以精准医疗为中心的筛选方法的需求比以往任何时候都更为迫切。
在此，斑马鱼进入研究视野，特别是受精后48小时（hpf）的斑马鱼幼鱼。以斑马鱼幼鱼为宿主建立的肿瘤异种移植模型，构成了一种快速的体内筛选平台，可用于预测化疗的临床反应6,12,13,14。斑马鱼肿瘤异种移植模型已发展成为分子精准医学（即通过基因组学或分子病理学方法指导癌症患者治疗方案选择）以及类器官和小鼠异种移植研究在临床前药物开发中的有力替代方案15,16。在斑马鱼肿瘤异种移植模型中，荧光标记的肿瘤细胞（通过遗传或化学方法标记）可高效地移植到斑马鱼幼鱼体内13。对于作用机制相对较快的药物或候选药物（例如，可直接或间接影响靶向肿瘤细胞存活率，如通过激活T细胞毒性作用），可在短短三天内完成筛选，从而快速获得关于抗癌及抗转移药物疗效的功能性读数。随后，可据此选择疗效良好的治疗方案，已有研究表明，这种筛选结果应能转化为患者良好的治疗效果，或显著提高药物研发项目的成功率12,17,18,19。此外，该筛选过程在选择进入后续药物研发管线的化合物方面具有高度相关性。
然而，为了在临床环境中成为一种可行的诊断工具，并在癌症研究和药物开发中实现大规模药物筛选，斑马鱼肿瘤异种移植（ZTX）模型必须具备快速、可靠、可重复且成本效益高的特点。自动化对于实现这些目标至关重要，因为它能够最大限度地减少操作者之间的差异，同时提高通量，并增强肿瘤细胞注射与分析的精确性。通过标准化这些操作流程，我们不仅可以提高数据的可重复性，消除&#160;人为误差，还能借助自动化工作流程实现高通量筛选，使大规模研究成为可能20,21。最近，我们开发了一种自动化注射装置，能够在三个不同的解剖位点注射来自不同来源的液体、颗粒或细胞，其速度、精度和可重复性均达到甚至超过经过训练的斑马鱼研究人员的水平22。本文中，我们介绍了一种对斑马鱼幼鱼进行自动化肿瘤细胞注射的实验方案，实现精确且可控的注射操作。利用先进的图像识别技术，系统可自动定位注射板上的斑马鱼幼鱼，确定其体位，并识别出注射靶点。随后，系统自动引导注射针完成穿刺，软件将判断穿刺是否成功。操作人员仅需经过简单培训，即可使用该系统完成复杂的注射操作，例如在活体斑马鱼幼鱼体内构建微小肿瘤，从而高效地筛选治疗策略。

<table><tbody><tr><td>6孔板&amp;nbsp;</td><td>Greiner bio-one Cellstar&amp;nbsp;</td><td>ref 657160</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>VWR</td><td>#N605-100G</td><td></td></tr><tr><td>自动化注射系统 + 耗材</td><td>生命科学方法</td><td>https://www.lifesciencemethods.com/microinjection_system_for_zebrafish_larvae.html?nocache=1752058717774</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>世界精密仪器公司</td><td>N/A</td><td>1.0 mm 外径，0.78 mm 内径</td></tr><tr><td>细胞计数仪&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Countess 3</td><td></td></tr><tr><td>商用针头&amp;nbsp;</td><td>克伦伯里科学有限责任公司</td><td>&amp;nbsp;#B100-58-20</td><td></td></tr><tr><td>DNase I型&amp;nbsp;</td><td>罗氏</td><td>#11284932001</td><td></td></tr><tr><td>过滤癌细胞</td><td>希森美康 CellTrics™</td><td>04-0042-2316</td><td>30 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>矿物油&amp;nbsp;</td><td>Diapharma</td><td>&amp;nbsp;#330779-1L</td><td></td></tr><tr><td>针头研磨器 ()</td><td>Narishige&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;EG-401</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮 40</td><td>Sigma</td><td>#102420477</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo 组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/gentlemacs-octo-dissociator-with-heaters.html</td><td></td></tr></tbody></table>

自动化斑马鱼幼鱼肿瘤移植用于癌症研究与医学

Automating Tumor Implantation in Zebrafish Larvae for Cancer Research and Medicine

斑马鱼幼鱼注射技术，包括皮下和脑内原位肿瘤异种移植以及静脉给药，已成为基于斑马鱼研究的核心技术。然而，这些操作仍然繁琐、技术要求高，且高度依赖操作者的技能，限制了通量和可重复性。为克服这些局限，我们介绍一种先进的机器人系统，可实现对斑马鱼幼鱼的自动化显微注射，显著提高效率、精确度和可重复性，优于人工注射。本文提供了该自动化注射仪的操作详细方案，该高通量系统能够以高于训练有素的斑马鱼研究人员的精度和速度，向三个不同解剖位点递送液体、颗粒或癌细胞。我们概述了确保最佳性能的关键步骤，包括系统设置、校准、注射程序及故障排除。此外，我们展示了使用该机器人获得的代表性实验结果，并讨论其在大规模幼鱼注射中的应用潜力，包括药物筛选和精准医疗。通过将自动化注射仪整合到工作流程中，研究人员可克服人工注射的局限，加速临床前药物发现和个体化治疗方案的选择。

本文介绍了用于癌细胞异种移植的三种最常用注射部位的自动化注射流程。
视频1展示了利用机器人系统对齐氏管（duct of Cuvier, DoC）进行自动注射的过程。机器人首先对培养板进行系统性扫描，从上到下、从左到右移动，以定位斑马鱼幼体。一旦识别到幼体，注射针便会自动接近目标，并根据检测到的齐氏管区域调整至预设的起始位置和针头角度。随后，执行预编程的注射宏程序：针头刺穿皮肤并完成注射。注射完成后，机器人继续扫描培养板以处理下一个幼体。成功的注射可使注入物质通过血液循环分布至全身（图2）。然而，也可能出现错误情况，例如将物质注射至卵周隙或卵黄中，或因针头堵塞导致注射失败，未能注入任何物质（图2）。对于注射失败的幼体应予以弃用。
视频2 演示了将癌细胞自动注射到卵黄囊周隙（PVS）的过程。与DoC注射类似，机器人会扫描培养板以定位斑马鱼幼鱼。一...

本文介绍了一种利用先进的机器人注射系统将肿瘤异种移植物自动植入斑马鱼幼鱼的详细实验方案。此外，我们还提供了注射过程视频及验证数据，以展示该系统的成功运行效果。

斑马鱼幼体注射，包括皮下和脑原位肿瘤异种移植以及静脉给药，已成为……

治疗个体化是提高癌症患者生存率的关键。由于现有的精准医疗无法为大多数患者实现个体化治疗，如何利用新的功能性方法来应对这一挑战？为了促进斑马鱼到斑马鱼异种移植及相关技术的自动化，包括后脑、皮下或静脉给药，我们提供了一套使用自动化注射系统的详细方案。本方案将使基础研究人员和临床实验室能够可靠地建立斑马鱼至斑马鱼的移植模型，并通过静脉给药在体内对抗癌药物的疗效进行功能性测试。首先，使用 E3 溶液润湿琼脂糖凝胶板。将培养板倾斜，使多余的 E3 溶液汇集并流走。将10至20条麻醉后的幼虫小心地放置在湿润的培养皿上，让多余的水分自然沥干。然后将幼虫均匀排列，确保彼此不接触，并与培养皿边缘保持至少10毫米的最小距离。接着使用移液器或吸水纸除去培养皿上多余的液体，同时确保幼虫始终处于湿润状态。接下来，点击界面上的“注射设置”菜单。选择适合注射的斑马鱼幼鱼的正确发育阶段，并从可用选项中选择所需的注射位点。然后，在斑马鱼幼鱼的示意图上选择注射位置。调整幼虫示意图、针尖位置和针头方向，使其与选定的注射位点对齐。根据需要选择提供自动和手动模式选项的注射宏。现在，牢固握住持针器，并逆时针旋转金属部分，将其从机器人上拆下。将装填好的针头的钝端插入针持器的截锥形末端。点击“移动载物台”以开始安装针头。载物台移动到位后，使用标尺测量针头的暴露长度，确保其约为22毫米。然后，用持针器夹住装有缝线的针，并顺时针旋转金属部分，以牢固地拧紧连接。在弹出的屏幕上，将针置于圆圈中心，并调节机器上的两个螺丝。当针正确居中后，点击绿色对勾以确认。在下一个弹出界面中，通过旋转机器人头部后方的螺丝来调整针尖的焦距。当针尖处于焦点时，点击绿色对勾标记。机器人将自动校准针的高度，并在每次旋转时显示注射位置为红色点。校准完成后，点击“Got It”，然后点击屏幕右下角的“Continue to Droplet Calibration”（继续进行液滴校准）。在注射界面中，单击“Start”按钮以启动注射过程。系统将扫描琼脂糖平板以定位幼虫，同时机器人载物台开始移动。一旦识别出幼虫，针头将自动移动至选定的注射位点，并调整方向至预设角度。若选择自动模式，机器人将在指定位置无缝执行注射操作。每次注射完成后，机器人将继续扫描培养板，以定位下一条幼虫并进行注射。所有幼虫注射完成后，点击“停止”按钮以关闭注射界面。此时，针头将自动移至油井位置。然后，小心地提起并移除装有已注射幼虫的培养板。转移已注射的幼虫时，将培养板倾斜置于培养皿上方，使用移液器或挤压瓶以可控的水流轻轻冲洗幼虫。冲洗时应从培养板的上方开始，向下移动，以有效冲出幼虫。对圆背管进行自动化注射时，若注射物质在循环系统中明显分布，则表明注射成功。然而，注射失败会导致物质积聚在卵黄膜周隙，或仅能观察到少量微珠。当荧光标记的癌细胞停留在注射部位时，视为卵黄膜周隙注射成功；

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

在斑马鱼幼虫中自动植入肿瘤，用于癌症研究和医学

本视频介绍了利用斑马鱼异种移植模型评估体内肿瘤形成并研究治疗药物作用的方法。...

斑马鱼异种移植实验：一种评估治疗药物在斑马鱼体内对肿瘤发生抑制效果的方法

本视频展示了将斑马鱼脑肿瘤细胞原位移植到免疫健全的斑马鱼胚胎第四脑室的过程。该方法可实现对肿瘤细胞侵袭行为和长期动态的观察研究。...

斑马鱼胚胎中肿瘤细胞的长期原位移植：一种将肿瘤细胞高效递送至斑马鱼胚胎第四脑室以长期分析肿瘤细胞行为的方法

癌症细胞移植是研究癌症机制和治疗反应的重要工具。目前的技术依赖于免疫缺陷型动物。本文介绍一种将斑马鱼肿瘤细胞移植到免疫健全胚胎中的方法，用于长期分析肿瘤细胞行为 体内...

将斑马鱼儿童脑肿瘤移植到免疫健全宿主中以长期研究肿瘤细胞行为和药物反应

斑马鱼胚胎和幼鱼的显微注射是一种在多种斑马鱼模型中至关重要的技术，但也具有挑战性。本文介绍了一系列微尺度工具，可用于在显微注射和成像过程中辅助稳定和定向斑马鱼样本。...

用于优化斑马鱼幼鱼显微注射与成像的微结构装置

本文介绍了一种设计和制备斑马鱼胚胎排列模板的方案，随后详细阐述了如何利用该模板将斑马鱼胚胎高通量排列至96孔板中的操作步骤。...

一种用于高通量斑马鱼胚胎排列的3D打印模板

该方法旨在通过将哺乳动物肿瘤细胞异种移植到血管带有荧光标记的斑马鱼胚胎中，建立体内肿瘤血管生成模型。通过成像观察异种移植的肿瘤及其相关血管，可定量评估血管生成反应。...

斑马鱼肿瘤异种移植模型中宿主血管生成反应的活体成像与定量分析

斑马鱼异种移植模型可用于在体内微环境中对人源癌细胞进行高通量药物筛选和荧光成像。我们建立了一种工作流程，利用配备自动化荧光显微镜的成像系统，在斑马鱼中对患者来源的白血病样本进行大规模自动化药物筛选。...

斑马鱼中源自患者的原代肿瘤异种移植药物筛选

本文提供了一步一步的操作方案，并附有建立异种移植瘤的技巧，以及肿瘤行为分析、全组织免疫荧光染色和共聚焦成像定量分析的指导原则。...

斑马鱼幼鱼异种移植模型的建立及肿瘤行为分析

我们描述了一种将异种移植物移植到透明斑马鱼胚胎卵黄中的实验方案，该方案通过一种简单快速的分期方法进行了优化。注射后的分析包括检测异种移植细胞的存活情况以及通过流式细胞术评估疾病负荷。...

一种在透明斑马鱼胚胎中进行肿瘤异种移植分析的简单、快速且有效的方法

本实验方案演示了如何在果蝇（Drosophila）眼/触角成虫盘（EAD）中生成带有荧光标记且遗传背景明确的克隆肿瘤。方案详细描述了如何从三龄幼虫中解剖出EAD和脑组织，并对其进行处理，以观察和定量基因表达变化及肿瘤侵袭性。...

Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

了解利用自动化注射系统在斑马鱼幼虫中进行肿瘤异种移植的完整实验方案。该方法支持静脉给药并可在体内功能性地测试抗癌药物疗效，为基础研究和临床实验室提供可靠的癌症模型构建技术。

自动化斑马鱼幼鱼肿瘤移植用于癌症研究与医学

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