Name: 基于 BRET 的 G 蛋白生物传感器，用于测量活细胞中 G 蛋白偶联受体活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学习使用基于BRET的生物传感器在活HEK293细胞中实时测量G蛋白偶联受体活性。该方法可精确检测配体诱导的G蛋白激活信号，有助于发现偏向性配体并优化药物筛选流程。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HEK-CB1 细胞由 M. Guzman（西班牙马德里康普顿斯大学）惠赠，β2-肾上腺素能受体质粒由 D. Perrais（法国波尔多神经科学跨学科研究所 IINS）惠赠。Gi3-CASE 和 Gs(short)-CASE 由 Gunnar Schulte 惠赠（Addgene 质粒 # 168122；Addgene 质粒 # 168124）。部分示意图使用 BioRender.com 制作。本研究得到法国高等教育与研究部以及法国国家科研署（ANR）PolyFADO（ANR-21-CE44-0019）、AlzCaBan（ANR-24-CE44-4647）和 SCHIZOLIP（ANR-22-CE44-0034）项目的资助。

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 培养板接种（第1天）
注意：所有细胞培养操作均须在无菌的层流罩内进行，以维持无菌条件。使用白色孔板并配以透明平底，以便观察细胞生长和存活情况。请使用完整的白色孔板，避免在步骤 3.2.1 中使用贴纸。
<ol>
	<li>酶标板包被 
	注意：可使用预包被板以跳过此步骤。
	<ol>
		<li>将约 6 mL 经无菌过滤的聚-L-赖氨酸（PLL）溶液（0.01%）倒入多通道储液槽中。使用多通道移液器，向 96 孔白色酶标板的每孔加入 60 µL PLL 溶液。</li>
		<li>将酶标板置于避光处，孵育 20 分钟。</li>
		<li>在孵育期间，按照步骤 1.2.1–1.2.3 的描述开始细胞制备。</li>
		<li>用多通道移液器吸除 PLL 溶液，并将溶液转移至 15 mL 离心管中，于 4 °C 保存。</li>
		<li>用 DPBS 洗涤酶标板三次，以去除未结合的 PLL，避免其可能导致细胞降解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞制备与接种
	<ol>
		<li>在含 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 HEK293 细胞。 
		注意：在培养基中添加 FBS 是为了提供细胞正常存活所需的营养物质和生长因子。</li>
		<li>吸除培养基，并用 2 mL DPBS 冲洗细胞。</li>
		<li>加入 0.5 mL 胰蛋白酶，于 37 °C 孵育 3–5 分钟，以使细胞脱落。</li>
		<li>向培养瓶中加入 4.5 mL DMEM 以中和胰蛋白酶，然后反复吹打使细胞完全脱落并重悬。</li>
		<li>将脱落的细胞转移至 15 mL 离心管中，在室温（RT）下以 1000 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 2 mL DMEM 中。</li>
		<li>使用 Malassez 血细胞计数板对细胞进行计数，配制 9 mL 浓度为 300,000 个细胞/mL 的细胞悬液。将其加入多通道储液槽中，使用多通道移液器每孔加入 100 µL 进行接种（最终密度为 30,000 个细胞/孔）。</li>
		<li>将酶标板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育约 24 小时。 
		注意：为实现高效转染，细胞汇合度应达到约 70%–80%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 质粒转染（第2天）
注意：细胞转染可在第1天进行，即在悬浮细胞铺板前的步骤1.2.7中完成，数据采集则在第3天进行。
<ol>
	<li>将所需质粒 DNA（例如，在 HEK wt 细胞中加入 5 µg β2-肾上腺素能受体和 5 µg Gs(short)-CASE，或在 HEK CB1 细胞中仅加入 10 µg Gi3-CASE）10 µg 与 20 µL 脂质体转染试剂（Lipofectamine）分别加入含有 500 µL Opti-MEM 培养基的离心管中。室温孵育 5 分钟。
	<ol>
		<li>作为阴性对照，将 β2-肾上腺素能受体替换为相同浓度的空载体质粒 pcDNA 3.1。将上述两种溶液合并至同一管中并混匀，得到转染混合液（总体积 1 mL）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将转染混合液于室温孵育 20 分钟。</li>
	<li>从步骤 2.2 中取 10 µL 转染混合液逐滴加入每孔，并轻轻前后摇动培养板以确保充分混匀。 
	注意：每孔最终 DNA 浓度为 100 ng。</li>
	<li>将微孔板置于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中孵育 24 小时。</li>
</ol>
3. 数据采集（第3天）
<ol>
	<li>配体准备 
	注意：Hank's 平衡盐溶液（HBSS）缓冲液：NaCl 140 mM，氯化钾 5 mM，氯化钙 1 mM，七水合硫酸镁 0.4 mM，六水合氯化镁 0.5 mM，二水合磷酸氢二钠 0.3 mM，磷酸二氢钾 0.4 mM，D-葡萄糖（右旋糖）6 mM，碳酸氢钠 4 mM，pH 7.4，经 0.22 µm 滤膜过滤。
	<ol>
		<li>在适合各配体溶解的溶剂中，配制尽可能高浓度的储备液（在本方案中，异丙肾上腺素溶于 mQ H2O，WIN-55.212-2 溶于 DMSO）。 
		注意：配体储备液的浓度需根据配体的溶解度及其已知解离常数（Kd）进行调整。</li>
		<li>从该储备液中，用相应的溶解溶剂配制围绕配体 Kd 值的系列稀释液，每份体积为 10 µL。将此系列稀释液储存于 -20 °C。 
		注意：根据配体的不同，该系列稀释液在发生降解前可冻融最多十次。同时配制仅含配体溶解溶剂的溶液，用于设置溶剂对照组（在本方案中为 H2O 或 DMSO）。</li>
		<li>对每种配体浓度及溶剂对照组，取 1.3 µL 加入至总体积 130 µL 的 HBSS 中，进行 1/100 稀释。最终体系中溶剂浓度为 1%。 
		注意：此最终稀释系列用于实验时，每孔加入 10 µL 以达到 100 µL 总体积，此时各孔中溶剂终浓度为 0.1%。130 µL 体积对应填充一块 96 孔板一行所需的量：(10 × 12) ± 10%。每一行对应不同配体浓度，最后一行为溶剂对照。</li>
		<li>从原液配制 980 µL 的 Furimazine 1/100 稀释液（将 9.8 µL Furimazine 加入 970.2 µL HBSS，总体积为 980 µL）。 
		注意：Furimazine 溶液需新鲜配制，并静置孵育至少 3 分钟，然后在检测前立即加入。不宜过早配制，因其信号在室温下半衰期约为 120 分钟。为克服此限制，可使用长效 Furimazine 衍生物，如 vivazine 和 endurazine，这些底物可维持稳定的 BRET 信号长达 48 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>板读数 
	注意：使用多功能酶标仪。根据研究条件和重复次数调整检测参数。此处数据采集分为三次读数，每次读取 4 列，共 32 孔。所有读数均采用顶部光学检测，并加盖透明封板膜以防止缓冲液蒸发。每次读数前需调整检测增益。本研究中增益固定为 3600。可通过酶标仪配备的自动进样器或注射系统实现配体的自动化添加，避免手动操作。
	<ol>
		<li>移除 96 孔板前 4 列的培养基，每孔用 100 µL HBSS 清洗一次，再加入 80 µL HBSS。在板底面贴上白色标签，以增强荧光和/或生物发光信号的检测。</li>
		<li>记录 G 蛋白发光光谱：将 96 孔板放入酶标仪中，使用 535/30 nm 单色器检测 cpVenus173 的发射光，并在 500 至 600 nm 范围内以 2 nm 分辨率测量发光信号。 
		注意：此步骤为对照，用于确认 cpVenus173 激发后有荧光发射。</li>
		<li>记录 G 蛋白发光光谱：使用 450/40 nm 单色器检测 Nluc 发射强度，并在 400 至 600 nm 范围内以 5 nm 分辨率测量发光信号。 
		注意：此步骤为对照，用于确认在加入 Nluc 底物 Furimazine 前无生物发光信号产生。</li>
		<li>将板从酶标仪中取出，使用多通道移液器向每孔加入 10 µL 前一步骤（3.1.4）配制的 Furimazine 溶液。</li>
		<li>重复步骤 3.2.3。 
		注意：此步骤为对照，用于确认加入 Furimazine 后产生生物发光信号。检测后应立即进行步骤 3.2.6，以避免因 Furimazine 消耗和/或降解导致信号变化。BRET 信号的变化可能由 Furimazine 消耗和/或降解，以及激动剂刺激后发生的调控过程（如信号终止机制）引起。为克服此限制，可使用 GRK 抑制剂（CMPD101）、内吞抑制剂（dynasore），或使用基因编辑技术敲除 GRK 或 arrestin 的细胞模型。</li>
		<li>记录 G 蛋白基础 BRET 值：在加入 GPCR 配体前，分别使用 450/40 nm 和 535/30 nm 单色器检测 Nluc 和 cpVenus173 的发射强度。进行 3 个循环，每个循环 60 秒，检测间隔时间为 0.30 秒（总读数时间为 3 分钟）。 
		注意：将检测间隔时间延长至 0.90 秒通常可显著提高信噪比，但会大幅延长读数时间。实验者应根据具体应用需求权衡时间分辨率与信噪比的重要性。</li>
		<li>将板从酶标仪中取出，使用多通道移液器向每列各孔分别加入 10 µL 前一步骤（3.1）配制的 GPCR 配体系列稀释液。其余三列按相同方法操作。</li>
		<li>记录 G 蛋白配体诱导的 BRET 信号：分别使用 450/40 nm 和 535/30 nm 单色器检测 Nluc 和 cpVenus173 的发射强度。进行 16 个循环，每个循环 60 秒，检测间隔时间为 0.30 秒（总读数时间为 16 分钟）。 
		注意：设置检测参数时应按列顺序读取各孔。重复孔之间的检测时间差为 2.4 秒。</li>
		<li>对接下来的四列重复步骤 3.2. 共两次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
注意：将每次读数的数据分别收集到不同的数据电子表格文件中。
<ol>
	<li>对照读数
	<ol>
		<li>绘制发射强度随波长变化的曲线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基础BRET读数
	<ol>
		<li>对每个孔，计算三次读数的BRET比值。BRET比值定义为受体发射/供体发射。 
		<img alt="BRET比值方程，535/30&lt;sub&gt;em&lt;/sub&gt;除以450/40&lt;sub&gt;em&lt;/sub&gt;，用于发射分析。" src="/files/ftp_upload/68463/68463eq001.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1778558422000" data-alt="方程1"></li>
		<li>对每个孔，计算加配体前三次BRET比值的平均值。该值称为配体刺激前的基础BRET比值：Ratiobasal。</li>
		<li>为归一化所有孔的先前BRET比值，对每项三次测量，分别从相应时间点的BRET比值中减去溶剂对照孔计算得到的BRET比值。 
		注：所分析的数据对应于加配体前的时间点。由于已知添加配体的孔，因此可相应地识别溶剂对照孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>G蛋白配体诱导的BRET读数
	<ol>
		<li>对每个孔，按照第4.2.1节所述方法计算每次读数的BRET比值。这些值称为Ratiostim。</li>
		<li>为量化配体诱导的变化，将每个孔的每个Ratiostim以相对于基础值的百分比形式计算ΔBRET。为此，使用第4.2.2节中先前计算得到的相应Ratiobasal。 
		<img alt="BRET变化公式，ΔBRET计算，发光检测的比值分析，方程，教学用途。" src="/files/ftp_upload/68463/68463eq002.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1778558422000" data-alt="方程2"></li>
		<li>计算ΔBRET(%)以归一化每个孔的ΔBRET值。为此，减去相应溶剂孔的ΔBRET值。</li>
		<li>为在数据表格中可视化ΔBRET动力学，将第4.2.3步中归一化的三个基础BRET读数置于第4.3.3节中计算得到的每个孔对应的ΔBRET(%)值之前。</li>
		<li>将上述数据对读数时间作图，获得动力学曲线。</li>
		<li>当达到平台期时，选取某一特定时间点的ΔBRET(%)值，并将其对所用配体浓度作图，因为每个孔对应不同的配体浓度，从而获得剂量-反应曲线。 
		​注：平台期通常在配体刺激后约5分钟达到。在本方案中，绘制的是配体刺激15分钟后获得的数值。为比较不同实验的数据，应根据激活动力学调整时间点。</li>
		<li>在分析软件中绘制上述数据，并使用基于以下方程的三参数S型剂量-反应拟合进行拟合： 
		<img alt="剂量-反应曲线方程，Y=Bottom+X*(Top-Bottom)/(EC50+X)，公式表示。" src="/files/ftp_upload/68463/68463eq003.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1778558422000" data-alt="方程3"> 
		其中，X为所用配体的浓度，Y为ΔBRET(%)值，Top和Bottom代表平台值，EC50为达到最大效应50%所需的配体浓度。由此可获得Emax 和EC50。</li>
		<li>使用非参数Mann-Whitney检验比较对照条件的数据。当p &lt; 0.05时，结果被认为具有显著性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="使用BRET进行G蛋白分析；示意图；细胞接种、转染、光谱记录、荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68463/68463fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1778558422000" data-alt="图2"> 
图2：进行BRET检测的关键步骤。 本方案中所述的三个主要实验步骤（细胞接种、细胞转染和BRET信号采集）的概览，以及数据采集的详细分步指南。实验设置：第1天，将细胞以每孔30,000个细胞的密度接种于经PLL预包被的白色96孔板中，该板具有平坦透明的底部。第2天，用选定的G蛋白传感器与所研究的GPCR或pcDNA3.1质粒共同转染细胞。经过24小时孵育后，在加入配体后通过生物发光和荧光读数检测G蛋白传感器的活性。数据采集：细胞经HBSS洗涤后，向各孔中加入80 µL HBSS，并使用535/30 nm单色器在500 nm至600 nm范围内测量cpVenus173的荧光发射(1)。接着，使用450/40 nm单色器在400 nm至600 nm范围内测量Nluc的生物发光，分别在加入furimazine之前(2)和之后(3)进行。最后，分别使用450/40 nm和535/30 nm单色器，在3分钟内（3个周期，每个周期60秒，测量间隔0.30秒）(4)和16分钟内（16个周期，每个周期60秒，测量间隔0.30秒）(5)测量基础状态及配体诱导的G蛋白活性的BRET信号。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68463/68463fig2largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs.</a> Mol Pharmacol. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptors+%28GPCRs%29%3A+Advances+in+structures%2C+mechanisms%2C+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptors (GPCRs): Advances in structures, mechanisms, and drug discovery.</a> Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 1-43 (2024).</li>
<li>Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((protein+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">protein pathways.</a> Science. 296 (5573), 1636-1639 (2002).</li>
<li>Chung, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+G+protein+Gs+induced+by+the+%CE%B22+adrenergic+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the G protein Gs induced by the β2 adrenergic receptor.</a> Nature. 477 (7366), 611-617 (2011).</li>
<li>Hepler, J. R., Gilman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">G proteins.</a> Trends Biochem. Sci. 17, 383-387 (1992).</li>
<li>Van Unen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+FRET+sensors+for+robust+measurement+of+G%CE%B1i1%2C+G%CE%B1i2+and+G%CE%B1i3+activation+kinetics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new generation of FRET sensors for robust measurement of Gαi1, Gαi2 and Gαi3 activation kinetics in single cells.</a> PLoS One. 11 (1), 1-14 (2016).</li>
<li>Bünemann, M., Frank, M., Lohse, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gi+protein+activation+in+intact+cells+involves+subunit+rearrangement+rather+than+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Gi protein activation in intact cells involves subunit rearrangement rather than dissociation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (26), 16077-16082 (2003).</li>
<li>Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+activation+of+heterotrimeric+G-proteins+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells.</a> Science. 291, 2408-2411 (2001).</li>
<li>Galés, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+activation-promoted+structural+rearrangements+in+preassembled+receptor-G+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the activation-promoted structural rearrangements in preassembled receptor-G protein complexes.</a> Nat Struct Mol Biol. 13 (9), 778-786 (2006).</li>
<li>Schihada, H., Shekhani, R., Schulte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+constitutive+G+protein-coupled+receptor+activity+with+BRET-based+G+protein+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of constitutive G protein-coupled receptor activity with BRET-based G protein biosensors.</a> Sci Signal. 14 (699), eabf1653(2021).</li>
<li>Zhou, Y., Meng, J., Xu, C., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+GPCR+functional+assays+based+on+resonance+energy+transfer+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple GPCR functional assays based on resonance energy transfer sensors.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 611443(2021).</li>
<li>Scott-Dennis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+membrane-based+Gi-CASE+biosensor+assay+for+profiling+compounds+at+cannabinoid+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a membrane-based Gi-CASE biosensor assay for profiling compounds at cannabinoid receptors.</a> Front Pharmacol. 14, 1158091(2023).</li>
<li>Violin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+signaling+and+desensitization+elucidated+by+quantitative+modeling+of+real-time+cAMP+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor signaling and desensitization elucidated by quantitative modeling of real-time cAMP dynamics.</a> J Biol Chem. 283 (5), 2949-2961 (2008).</li>
<li>Scarpace, P. J., O'Connor, S. W., Abrass, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+and+isoproterenol+modulation+of+beta-adrenergic+receptor+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Temperature and isoproterenol modulation of beta-adrenergic receptor characteristics.</a> Life Sci. 38, 309-315 (1985).</li>
<li>Thomas, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+receptor+binding+analyses+of+cannabinoid+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Comparative receptor binding analyses of cannabinoid agonists and antagonists.</a> J Pharmacol Exp Ther. 285 (1), 285-292 (1998).</li>
<li>Schihada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoforms+of+GPR35+have+distinct+extracellular+N-termini+that+allosterically+modify+receptor-transducer+coupling+and+mediate+intracellular+pathway+bias%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isoforms of GPR35 have distinct extracellular N-termini that allosterically modify receptor-transducer coupling and mediate intracellular pathway bias.</a> J Biol Chem. 298 (9), 102328(2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本实验方案描述了使用BRET生物传感器实时测量活细胞中G蛋白在特异性配体刺激GPCR后激活情况的方法。该方法基于生物发光供体-受体能量转移原理，能够检测受体激活后异源三聚体G蛋白的构象变化及其解离过程，为研究GPCR信号转导提供了可靠且灵敏的平台。本方案可适用于多种GPCR家族，包括B类和C类GPCR以及孤儿GPCR10,12。本文以A类GPCR中的β2-AR和CB1R为例报告了实验结果。
G蛋白偶联受体（GPCR）在其相应激动剂的刺激下会招募G蛋白，最终导致其解离为两个亚基：一侧为Gα，另一侧为必需的Gβγ二聚体。在本实验方案中，可通过检测与不同G蛋白组分相连的BRET配对分子所介导的G蛋白解离过程，来监测GPCR的激活状态。
实验结果表明，基于BRET的G-CASE生物传感器在配体刺激β2-AR或CB1R后，可有效检测Gs或Gi</...

<a href="https://app.jove.com/t/6664">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/68463">10.3791/68463</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/68463">BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells</a>. The Authors section was updated.

Erratum: BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells

G蛋白偶联受体（GPCR）是最大的跨膜受体超家族，负责将胞外刺激信号转导为胞内信号级联反应，从而引发特定的生物学响应。GPCR是关键的药理学靶点，约30%的上市药物作用于GPCR1。GPCR配体结合会诱导受体发生构象变化，促进其与异源三聚体G蛋白和/或GPCR激酶（GRKs）及β-阻遏蛋白（β-arrestins）相互作用，从而启动下游信号传导或受体内化过程2。
异源三聚体G蛋白是G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导的主要细胞内媒介，由三个亚基组成：Gα、Gβ和Gγ。根据Gα亚型的不同，这些异源三聚体可分为四类——Gi/o、Gs、Gq和G12/13，每类激活不同的信号通路：Gi/o亚型抑制腺苷酸环化酶，而Gs亚型则刺激其活性，Gq亚型激活磷脂酶C-β，G12/13亚型则调控Rho家族GTP酶。
GPCR 的激活会引发其构象重排，从而在亚秒级动力学时间内快速招募 G 蛋白。该过程诱导 G 蛋白发生构象变化，促进 Gα 亚基中的 GDP-GTP 交换。GTP 的结合进一步改变 Gα 亚基的构象，导致其与 Gβγ 二聚体解离，进而实现信号传递。因此，G 蛋白通过调控多种效应蛋白（如腺苷酸环化酶或离子通道）来调节细胞反应的特异性和时间动力学，发挥关键作用3,4,5。
本方案概述了在活细胞中通过G蛋白偶联受体（GPCR）配体刺激后，利用基于生物发光共振能量转移（BRET）的生物传感器检测G蛋白激活或失活的方法。受早期G蛋白生物传感器研究6,7,8,9的启发，Schihada等人提出的G-CASE（G蛋白三顺反子活性传感器）系统10，基于标记的Gα与Gβγ亚基之间的BRET信号，仅需单质粒转染即可实现检测，操作更为简便。该特性提高了检测灵敏度，并避免了共转染编码异源三聚体G蛋白三个亚基（Gα、Gβ和Gγ）的多个质粒所带来的技术难题。这些传感器目前已通过商业途径向学术研究机构提供（见材料表）。
与荧光共振能量转移（FRET）相比，生物发光共振能量转移（BRET）具有显著优势。在BRET中，能量转移发生在生物发光供体与荧光受体之间，无需外部光源激发。这种内在的生物发光特性减少了FRET中常见的问题，如自发荧光和光散射，从而降低了背景信号，提高了检测的灵敏度6,7,11。
BRET无需外部激发，可最大限度地减少光漂白和光毒性效应，从而与FRET相比具有更低的背景信号。因此，BRET检测通常表现出更高的灵敏度，能够检测G蛋白对组成型活性GPCR的激活。BRET检测的高灵敏度有助于发现细微的生物相互作用，在药理学研究中尤为重要，因为在这些研究中精确测量受体活性至关重要。
这些生物传感器可转化为在96孔或384孔板中进行的高通量筛选，正如Scott-Dennis等人最近所证明的那样，他们已开发出一种基于膜的384孔检测方法，利用这些生物传感器分析大麻素受体CB1R和CB2R的活性12。本文描述了在活细胞的96孔板中使用这些生物传感器的方法，通过检测β2-肾上腺素受体（β2-AR）的活性来验证，该受体是A类典型G蛋白偶联受体（GPCR），可结合Gs蛋白；同时还检测了同属A类G蛋白偶联受体的CB1R，其可激活Gi/o家族蛋白。本研究验证了两种G-CASE生物传感器的应用：在HEK 293T细胞中分别使用Gs和Gi3生物传感器，GPCR为瞬时表达（β2-AR）或稳定表达（CB1R）。
需要注意的是，该实验可在多种细胞系中进行，表明该技术在不同细胞环境中的广泛适用性和稳健性。这确保了该方法可应用于多种实验模型，使其成为在不同生理和药理条件下研究G蛋白偶联受体（GPCR）信号转导的有力工具。图1展示了基于生物发光共振能量转移（BRET）的G蛋白活性传感器的工作原理。
<img alt="GPCR激活示意图；BRET生物传感器测量G蛋白偶联；分子相互作用研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68463/68463fig1.jpg" data-altupdatedat="1778558422000" data-alt="Figure 1"> 
图1：基于BRET的G蛋白活性传感器原理。G蛋白传感器由三个亚基组成：Gα、天然Gβ和Gγ。Gα亚基与小而明亮的NanoLuciferase（Nluc）融合，而Gγ亚基则在其N端标记了环状重排的Venus（cpVenus173）。编码这些工程化G蛋白亚基的基因被组合到同一个质粒中。配体与GPCR结合后诱导GPCR发生构象变化，促进G蛋白的招募及其随后的解离，并伴随GTP水解。这种解离破坏了两个组分之间的能量转移，导致BRET信号下降。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68463/68463fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>高级96孔培养板，白色，带透明平底，带盖，Greiner bio-one</td><td>Dutscher</td><td>655983</td><td></td></tr><tr><td>BrightMax ClearLine 白色封膜</td><td>Dutscher</td><td>760245</td><td></td></tr><tr><td>ClarioSTAR LVF</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>不含氯化钙和氯化镁的改良型DPBS，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基（DMEM）GlutaMAX</td><td>Sigma</td><td>D0822</td><td>使用前在37 &amp;deg;C 水浴中预热</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Galpha&lt;sub&gt;i3&lt;/sub&gt;-Nluc-Gbeta1-Ggamma2-Venus</td><td>Addgene</td><td>168122</td><td>https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ &lt;br/&gt;由Gunnar Schulte惠赠</td></tr><tr><td>Galphas（短亚型）-Nluc-Gbeta3-Ggamma1-Venus</td><td>Addgene</td><td>168124</td><td>https://www.addgene.org/Gunnar_Schulte/ &lt;br/&gt;由Gunnar Schulte惠赠</td></tr><tr><td>稳定表达CB1R的HEK-293T细胞（HEK CB1）</td><td></td><td></td><td>由M. Guzman（西班牙马德里康普顿斯大学）惠赠</td></tr><tr><td>野生型HEK-293T细胞（HEK wt）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙肾上腺素</td><td>Sigma</td><td>I6504</td><td>溶于H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O中，储存于&amp;ndash;20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基，含GlutaMAX补充剂</td><td>Fischer</td><td>11564506</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3 Flag β2-肾上腺素受体 C端标签载体（pcDNA3 Flag beta-2-adrenergic-receptor tag FLAG C-ter）</td><td></td><td></td><td>由D. Perrais（IINS，波尔多）惠赠</td></tr><tr><td>pcDNA3.1-(空载体)-TAG</td><td>Addgene</td><td>138209</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液（PLL）</td><td>Sigma</td><td>RNBL7086</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>WIN-55,212-2</td><td>Cayman Chemicals</td><td>10009023</td><td>溶于DMSO中，储存于&amp;ndash;20 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

基于bret的g蛋白生物传感器用于活细胞中g蛋白偶联受体活性的检测

BRET-based G Protein Biosensors for Measuring G Protein-Coupled Receptor Activity in Live Cells

G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的跨膜受体家族，在细胞信号转导中发挥关键作用，可将胞外刺激转化为胞内反应。GPCR的激活会引起构象变化，从而使其能够与异源三聚体G蛋白相互作用。受体激活后，G蛋白α 亚基发生GDP-GTP交换，从而与G蛋白解离βγ 二聚体并触发下游信号级联反应。为研究G蛋白偶联受体（GPCR）介导的G蛋白激活，基于生物发光共振能量转移（bioluminescence resonance energy transfer, BRET）的生物传感器是一种高度敏感且非侵入性的方法。Schihada等人开发的基于G蛋白的三顺反子活性传感器（G-CASE生物传感器）通过检测异源三聚体的解离来间接反映激活状态，可在单质粒转染条件下实现对GPCR活性的实时监测，从而克服了共转染策略的局限性。相较于基于荧光的技术，BRET检测具有背景噪声低、光漂白效应弱以及灵敏度更高等优势。在本实验方案中，基于BRET的G-CASE生物传感器被应用于活细胞体系，并在96孔板中进行检测。具体而言，我们评估了β2-肾上腺素能受体（β2-AR）和1型大麻素受体（CB1R）在G蛋白激活方面的活性。通过瞬时转染β2-AR的HEK 293T野生型细胞以及稳定表达CB1R的HEK293T细胞，验证了Gs 和 Gi3 G-CASE生物传感器已得到验证。本方案支持该方法在药理学研究和高通量GPCR筛选中的应用，以更深入地理解配体激活特定信号通路的能力，例如 通过 偏向性信号转导，从而促进新型治疗化合物的发现。

实验设置与操作的通用示意图详见图2。使用G-CASE生物传感器评估了两种GPCR在配体激活后对Gs或Gi/o家族蛋白的激活情况。首先研究了一个典型的A类GPCR，即在HEK 293T细胞中瞬时转染的β2-肾上腺素受体（β2-AR）。当将激动剂（例如异丙肾上腺素）施加于共表达β2-AR和Gs(short)-CASE蛋白传感器的HEK wt细胞时，观察到BRET信号呈浓度依赖性下降，表明Gs蛋白被激活（图3B）。随着配体浓度增加，ΔBRET值逐渐降低直至达到饱和，配体刺激后约5分钟出现平台期。相比之下，转染空载体pcDNA3.1质粒及Gs(short)-CASE蛋白传感器的HEK wt细胞对异丙肾上腺素刺激表现出微弱且无统计学意义的相反反应（图3B）。在本方案中，绘制的是配体刺激15分钟后获得的数据。为确保结果的一致性和不受时间点选择的影响，应测试其他时间...

本方案描述了基于BRET的生物传感器在G蛋白偶联受体配体刺激下，对活体HEK293细胞中G蛋白活化进行实时检测的应用。本文以β2-肾上腺素能受体和1型大麻素受体为例，展示了该传感器在多种G蛋白亚型及不同G蛋白偶联受体中的检测效率。

基于BRET的G蛋白生物传感器用于活细胞中G蛋白偶联受体活性的检测

G蛋白偶联受体（GPCRs）是最大的一类跨膜受体家族，在细胞信号转导中发挥关键作用，通过转导...

我们致力于研究 GPCR 信号转导中的关键科学问题，以期发现新的 GPCR 靶点并揭示配体偏向性信号通路。通过生物分子与生物化学方法、冷冻电镜（cryo-EM）、核磁共振（NMR）以及分子动力学模拟，来解析不同效能或偏向性配体对 GPCR 调控的机制。实验开始时，将约六毫升无菌过滤的 0.01% 多聚-L-赖氨酸溶液加入多通道储液槽中。使用多通道移液器将 60 微升该溶液加入 96 孔白色微孔板的每个孔中。将微孔板在避光条件下孵育 20 分钟。孵育结束后，使用多通道移液器从每个孔中吸出聚-L-赖氨酸溶液，并转移至 15 毫升离心管中，在 4 摄氏度下保存。使用多通道移液器用 DPBS 溶液洗涤平板三次。进行细胞准备和铺板时，弃去含有 HEK293 细胞的培养瓶中的培养基，然后用两毫升 DPBS 溶液冲洗细胞。现在，将0.5毫升胰蛋白酶加入培养瓶中。在37摄氏度孵育3至5分钟，以使细胞脱落。加入4.5毫升DMEM中和胰蛋白酶。反复吹打悬浮液，以充分解离并重悬细胞。将细胞悬液转移至15毫升离心管中，于1,000 G离心5分钟。弃去上清液后，用2毫升DMEM重悬细胞沉淀。用移液器取40微升重悬的细胞，加入血细胞计数板中。随后使用血细胞计数板对细胞进行计数。制备10毫升细胞悬液，浓度为每毫升30万个细胞。将此悬浮液倒入多通道储液槽中。然后使用多通道移液器向96孔板的每孔接种100 µL溶液。将微孔板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育约24小时。转染时，将10微克质粒DNA和20微升Lipofectamine分别加入不同的离心管中，每管含有500微升Opti-MEM培养基。室温孵育5分钟后，将两种溶液合并至同一离心管中。轻轻混匀，得到1毫升转染混合液，并进行孵育。将10微升转染混合物逐滴加入96孔板的每孔中。轻轻前后摇动培养板，以确保均匀分布。然后将培养板置于含5%二氧化碳、37摄氏度的湿润培养箱中孵育24小时。第二天，在适当的溶解溶剂中配制配体的系列稀释液，每份10微升，浓度范围以配体的解离常数为中心。将系列稀释液储存于20摄氏度。针对每个浓度及溶剂对照组，通过将1.3微升原液加入128.7微升HBSS中，进行1:100的稀释。然后，通过将9.8微升原液加入970.2微升HBSS中，配制980微升1:100稀释的呋喃唑酮素。进行平板读数时，吸去96孔板前四列的培养基，每孔用100微升HBSS洗涤一次。然后向每个孔中加入 80 µL 的 HBSS。接着在培养板的底部贴上一个白色标签。将 96 孔板插入酶标仪中，开始记录 cp Venus 173 的发射光谱。将单色器设置为535 ± 30纳米，并以2纳米分辨率测量500至600纳米之间的发光发射。通过将单色器设置为450 ± 40纳米，并以5纳米分辨率在400至600纳米范围内扫描，记录最终的Lucia发光强度。从读板仪中取出微孔板。然后使用多通道移液器向每个孔中加入10 µL已配制好的furine溶液。为记录G蛋白基础BRET信号，在添加GPCR配体之前，使用450/40 nm和535/30 nm单色器分别检测Luke和CP静脉173的发射光。随后取出培养板，使用多通道移液器向一列孔中加入10 µL已配制好的GPCR配体稀释液。将酶标板重新插入读板仪，使用相同的单色仪设置，通过测量nluc和CP venous 173的发射来记录配体诱导的BRET信号。在表达β2肾上腺素受体的HEK 293 T细胞中，异丙肾上腺素刺激后，delta BRET值呈浓度依赖性下降，并在约5分钟时达到平台期。在HEK 293 T细胞中未观察到显著的BRET变化。转染空pcDNA3.1载体并在异丙肾上腺素刺激下。在表达β2肾上腺素受体的细胞中，异丙肾上腺素的S型剂量反应曲线显示其EC50约为9.4纳摩尔。在10微摩尔异丙肾上腺素刺激15分钟后，β2肾上腺素受体表达细胞的ΔBRET值显著低于pcDNA对照细胞。在用WIN-55,212-2刺激的HEK CB1细胞中，观察到delta BRET呈浓度依赖性下降，并在约五分钟时趋于稳定。HEK野生型细胞在WIN-55,212-2刺激下未表现出显著的delta BRET变化，证实了CB1受体激活的特异性。WIN-55,212-2在HEK CB1细胞中诱导出S形剂量反应曲线，其EC50约为112纳摩尔。用10微摩尔WIN-55,212-2刺激后15分钟，HEK CB1细胞中的Delta BRET值显著低于HEK野生型细胞。GK的BRET传感器为三顺反子结构，可让我们在活细胞中实时精确测量特定G蛋白的激活状态。利用IPU方法发现偏向性配体，有望推动药理学研究，实现更具疗效的特异性药物筛选。

bret-based-g-protein-biosensors-for-measuring-g-protein-coupled

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

基于 BRET 的 G 蛋白生物传感器，用于测量活细胞中 G 蛋白偶联受体活性

本文中，我们描述了用于研究趋化性的详细活细胞成像方法。我们介绍了荧光显微镜技术，用于监测迁移细胞中信号事件的时空动态。对信号事件的测量使我们能够进一步理解GPCR信号网络如何实现对趋化因子梯度的感知，并调控真核细胞的定向迁移。...

成像介导趋化性信号事件的G蛋白偶联受体（GPCR）：以盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）为例

我们在G蛋白偶联受体（GPCR）的不同特定位点处基因编码非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸，并展示了叠氮基团在多种应用中的多功能性。这些应用包括一种靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中的残基，以及利用肽表位标签或荧光探针对GPCR进行位点特异性的生物正交修饰。...

基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体

光学生物传感器技术可检测活细胞质膜附近的质量变化，从而能够追踪单个细胞及细胞群体的细胞反应。本方案将介绍利用该方法在完整细胞中检测G蛋白偶联受体对钾离子通道的调控作用。...

使用无标记光学生物传感器检测G蛋白偶联受体对钾通道的调节作用

本文所述的基于荧光的钙流测定法是一种中等通量的反向药理学筛选系统，用于鉴定孤儿G蛋白偶联受体（GPCRs）的功能性激活配体。...

基于荧光的钙离子动员检测法表征G蛋白偶联受体

检测G蛋白偶联受体对G蛋白选择性激活的简便方法，目前仍是细胞信号转导领域尚未解决的挑战。本文通过将G蛋白偶联受体（GPCR）与G蛋白肽段成对锚定，构建了基于福斯特共振能量转移（FRET）的生物传感器，可在活细胞中以可控浓度探测构象变化。...

使用活细胞悬浮荧光计检测法通过FRET传感器测量G蛋白选择性G蛋白偶联受体构象

鸟苷三磷酸（GTP）结合是G蛋白偶联受体（GPCR）激活过程中最早发生的事件之一。本实验方案描述了如何通过检测放射性标记的GTP类似物[35S]鸟苷-5'-O-(3-硫代)三磷酸（[35S]GTPγS）在特定配体作用下的结合情况，来药理学表征特定的GPCR-配体相互作用。...

通过放射性标记GTP结合测量G蛋白偶联受体信号传导

GPCR与β-阻遏蛋白相互作用是GPCR药物发现领域的一个新兴方向。为了在活体系统中监测此类相互作用，亟需准确、精确且易于建立的方法。本文展示了一种结构互补检测法，可用于实时监测活细胞中GPCR与β-阻遏蛋白的相互作用，并且该方法可拓展应用于任何GPCR。...

实时监测活体系统中G蛋白偶联受体与β-阻遏蛋白1/2的相互作用以加速药物发现

鉴于G蛋白偶联受体（GPCRs）是极具潜力的药物靶点，因此GPCR配体筛选对于发现先导化合物以及开展孤儿受体去孤儿化研究至关重要。为此，我们介绍了PRESTO-Tango，这是一个开源资源平台，利用基于TEV的报告基因检测方法，可同时对近300种GPCR上β-阻遏蛋白2（β-arrestin2）的瞬时招募进行分析。...

使用PRESTO-Tango检测技术在全GPCR范围内并行检测β-阻遏蛋白2招募以进行配体筛选

S1P 通过鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PRs）亚家族发挥其多种生理作用。本文描述了一种用于阐明 S1PRs...

研究鞘氨醇-1-磷酸受体结构与信号通路的实验流程

本研究描述了一种用于384孔板的高通量细胞内钙荧光检测方法，可用于在重组G蛋白偶联受体（GPCRs）上筛选小分子文库。该检测以牛蜱Rhipicephalus...

一种用于高通量筛选重组G蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

本研究中介绍的实验方案展示了cAMP差异检测器In...

利用荧光cAMP差异检测器原位监测活细胞中cAMP的实时动态变化

学习使用基于BRET的生物传感器在活HEK293细胞中实时测量G蛋白偶联受体活性。该方法可精确检测配体诱导的G蛋白激活信号，有助于发现偏向性配体并优化药物筛选流程。

基于BRET的G蛋白生物传感器用于活细胞中G蛋白偶联受体活性的检测

探索更多视频