使用 DNA 荧光发光适配子作为信号报告基因进行序列特异性核酸分析的分流杂交探针
2025年7月8日
该协议概述了利用荧光发光适配体 DAP-10-42 作为信号报告基因的分离杂交探针的设计，以及它们在核酸检测和单核苷酸取代靶标之间区分的应用。
我们正在开发用于序列特异性核酸分析的新型荧光杂交探针。最近，杂交分析工具通过利用 CRISPR-Cas 系统的检测进行了扩展。目前，最先进的杂交探针，如TaqMan和分子信标探针，最常用于分析核酸靶标。
准确检测单核苷酸取代和核酸靶标仍然具有挑战性。我们的方案可确保所需的细胞活性水平，同时提供无标记荧光信号读数。首先，设计构成 SLAS 的两条未修饰的 DNA 寡核苷酸链的序列。
使用含有核苷酸的片段来处理 DAP-10-42 的 6 至 39 个。通过去除第 5 位鼓起的胸腺嘧啶，将茎缩短至四个碱基对并添加末端胞嘧啶-鸟嘌呤碱基对，将由核苷酸 1 至 8 和 36 至 42 组成的茎 1 转化为茎 1 引物。在一条 SLAS 链中包括核苷酸 9 至 29，在另一条 SLAS 链中包括核苷酸 30 至 35。
通过添加脱氧GGTCAT将片段的三个主要末端序列与核苷酸9延伸至29。然后用脱氧TGACC延伸30至35片段的五个主要末端序列，形成六碱基对茎2。现在用脱氧 TT 连接子和与核酸靶标互补的 DNA 序列在两条链上延伸茎 1 引物。
这产生了构成探针的链 SLAS-U 和 SLAS-S 序列。使 SLAS-S 与 7 到 10 个核苷酸区域互补。这包括单核苷酸取代位点。
然后确保 SLAS-U 的靶结合臂与 SLAS-S 区域相邻的 15 至 25 个核苷酸片段互补。使用 UNAFold Web 服务器评估目标结合双链体的熔解温度。单击 INAMelt 选项卡。
转到应用程序并选择两态熔化杂交。在左右框中以五个素数到三个素数顺序输入相互作用的序列。然后将测定温度调节至22摄氏度，并将一价和二价阳离子浓度分别输入至20毫摩尔和25毫摩尔离子。
调整相应框中相互作用序列的浓度。按提交并查看相应双链体的吉布斯能量变化、焓、熵和熔化温度值。确认完全匹配的靶标和 SLAS-S 和 SLAS-U 的靶标结合臂的熔解温度高于测定温度 22 摄氏度。
确保 SLAS-S 和不匹配的靶标之间的双链体产生低于测定温度的熔解温度，以保持特异性。如有必要，调整目标绑定臂的长度以满足这些条件。从商业 DNA 供应商处获取最终的 SLAS-U 和 SLAS-S 寡核苷酸链，或使用自动 DNA 合成器在内部合成它们。
制备 Auramine O、SLAS-S、SLAS-U 和测定缓冲液的储备溶液。制备包含除靶标之外的所有测定组分的预混液。将无核酸酶水添加到预混液的最后五乘六体积中。
然后涡旋并旋转预混液。将 50 微升分配到每个样品管中。接下来，将一个样品标记为无目标空白，将一个样品标记为阳性对照。
将 10 微升含靶标样品加入装有预混液的试管中，制成 60 微升样品。对于空白，加入 10 微升无核酸酶水。然后将含有靶序列的 10 微升合成 DNA 寡核苷酸移液到阳性对照管中。
使用微量离心机在离心机中短暂混合所有样品。然后将试管在22摄氏度下孵育10至60分钟。使用荧光分光光度计在 475 纳米激发时测量 540 纳米的荧光。
SLAS 专为靶向 NANOGP8 基因的特定片段而定制。靶标 M 与 SLAS-S 链完全互补，而靶标 MM 具有胞嘧啶核苷酸位置 1， 423，导致与 SLAS-S 不匹配。添加完全互补的靶标 M 后，荧光稳步增加，并在 45 至 50 分钟后趋于稳定。
然而，在10分钟内可以检测到清晰的信号，信白比为10 SLAS显示出完全匹配的靶标的高荧光信号，但对不匹配的靶标或空白则不然。荧光输出随目标浓度线性增加，最高可达 500 纳摩尔，从而能够定量和确定检测限。PCR 扩增样品显示不同水平的信号，只有样品 2 超过荧光阈值 2。
根据校准曲线，样品2中NANOGP8扩增子的浓度估计为124+或13纳摩尔。SLAS信号的荧光检测在台式分光光度计和便携式荧光计上都是一致的。使用紫外线还目视观察到高于 20 的信白比。
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概述
本协议描述了用于特定核酸分析的荧光杂交探针的开发，重点关注DAP-10-42作为信号报告器的使用。它解决了检测单核苷酸替换的挑战。
关键研究组成部分
科学领域
- 荧光杂交探针
- 核酸检测
- 单核苷酸替换
背景
- 当前的杂交分析工具包括TaqMan和分子信标探针。
- 准确检测核酸靶标仍然具有挑战性。
- CRISPR-Cas系统已扩展了杂交分析能力。
- 无标记荧光信号读出对于有效分析至关重要。
研究目的
- 设计分裂杂交探针以增强核酸检测。
- 区分具有单核苷酸替换的目标。
- 在提供准确的荧光信号的同时确保细胞活性。
所用方法
- 设计两个未修饰的DNA寡核苷酸链。
- 利用荧光亮光适体DAP-10-42。
- 在核酸分析中应用分裂杂交探针。
- 评估信号读出效率。
主要结果
- 成功设计分裂杂交探针。
- 有效区分核酸靶标。
- 展示了无标记的荧光信号读出。
- 提高了检测单核苷酸替换的准确性。
结论
- 开发的探针增强了核酸检测能力。
- 它们提供了分析单核苷酸变异的可靠方法。
- 这种方法可以推进核酸分析领域的发展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Sequence-specific nucleic acid analysis using split hybridization probes with DNA fluorescent light-up aptamers (FLAPs) addresses the persistent challenge of detecting single-nucleotide substitutions with high specificity and quantitative confidence. This approach enables label-free, cost-effective, and scalable fluorescence-based readouts, supporting robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery and screening workflows. The method's selectivity and quantitative outputs are directly relevant for portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting single-nucleotide substitutions with high selectivity.
- Supports functional target validation through quantitative, sequence-specific fluorescence outputs.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing perfectly matched from mismatched nucleic acid targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, label-free assay systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative fluorescence measurements for assay development.
- Enables rapid, scalable, and portable screening readiness using conventional or handheld fluorescence detection platforms.
Translational & Preclinical Research
- Supports translational biomarker alignment by enabling detection of clinically relevant single-nucleotide variants.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation with quantitative, sequence-specific outputs.
- Reduces biological risk by enabling precise discrimination of target variants in complex samples.
Pipeline & Workflow Integration
This split hybridization probe platform integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing, assay development, and translational biomarker validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by enabling sequence-specific nucleic acid detection.
- Screening: Provides reproducible, quantitative fluorescence outputs for reliable compound or target evaluation.
- Analytics: Delivers measurable readouts and statistical discrimination between matched and mismatched targets.
- Translational Research: Aligns with biomarker-driven studies by enabling detection of single-nucleotide variants in disease-relevant samples.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, label-free detection capability adaptable across diverse nucleic acid targets and workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and target validation by enabling single-nucleotide resolution.
- Operational Value: Standardizes and simplifies assay workflows with label-free, scalable detection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid probe design and melting temperature analysis.
- Needs access to fluorescence spectrophotometers or portable fluorometers for quantitative readout.
- Demands cross-team standardization of probe synthesis and assay conditions for reproducibility.
- Adaptable to various nucleic acid targets by customizing complementary sequences and probe arms.
- Specificity depends on careful optimization of probe-target duplex stability and assay temperature.
