Name: 推进活体无标记乳腺癌细胞表型分析的多模态成像框架 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 学习使用共聚焦拉曼显微光谱与断层相位显微技术，对人乳腺癌细胞进行活体无标记多模态成像表型分析。该方法提供快速无偏的形态化学信息，适用于癌症研究与再生医学。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由麻省理工学院-意大利基金会的Progetto Rocca项目、美国国立卫生研究院资助（项目编号：P41EB015871、UH3CA275687、R01DC021326）、韩国首尔Apollon公司以及韩国国家癌症中心（NCC-24H1170）资助。Leonardo Bianchi 感谢获得Progetto Rocca博士后奖学金，以支持其在麻省理工学院与米兰理工大学开展合作研究。

1. 样品制备
<ol>
	<li>将 MDA-MB-231 细胞接种到石英培养皿中。
	<ol>
		<li>将 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞接种至 3.5 cm 石英玻璃底培养皿中。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 环境中孵育，直至细胞完全贴壁（接种后至少 12 小时）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤细胞并准备测量。
	<ol>
		<li>细胞贴壁后，移除培养皿中的培养基。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞，以去除残留的培养基。</li>
		<li>加入新鲜的细胞培养基，并在整个测量过程中保持细胞被培养基覆盖，以确保其活性。 
		注意：本研究使用的培养基为不含酚红的 DMEM/F-12 培养基，添加 5% 胎牛血清（FBS）以及青霉素（100 IU/mL）-链霉素（100 µg/mL）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 高通量拉曼显微镜系统
注意：本研究中用于MDA-MB-231活细胞成像的自制拉曼显微镜的技术细节此前已有描述22。简而言之，所使用的定制高通量拉曼显微镜系统采用由532 nm激光泵浦的785 nm钛宝石激光器（图1A）。785 nm拉曼激发激光耦合至倒置IX83荧光显微镜主体，通过749 nm二向色镜将激发光经UPLSAPO60× 1.2 NA水浸物镜导入样品。偏振器用于调节显微镜后端口处的平均激光功率。白光以类似方式耦合，实现明场成像。系统通过自动切换二向色滤光片在拉曼模式与明场模式之间转换。该系统结合了基于振镜和载物台扫描的方式，实现高通量成像。自定义的MATLAB脚本与开源显微镜控制软件、数据采集（DAQ）板及信号检测系统交互，以自动化数据采集过程。后向散射的拉曼光由同一物镜收集，可见光则被785 nm二向色镜滤除，并导向近红外光谱仪和电荷耦合器件（CCD）探测器。该装置支持多维成像，可在多个位置和z层面上同步采集明场、荧光和拉曼信号2,22。
<ol>
	<li>拉曼成像操作流程
	<ol>
		<li>样品制备与生理条件的维持
		<ol>
			<li>将样品安装到载物台培养箱中以维持生理条件。确保培养箱温度设置为 37 °C，并具有实时反馈调节功能以精确控制温度。</li>
			<li>保持腔室内湿度水平在 &#62;95%，使用装有蒸馏水的内部外周浴槽。设置 CO2 气体控制器用于混合5% CO2 用95%的空气供应至培养箱室。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>自动化的水浸管理
		<ol>
			<li>打开自制的自动浸水式供水装置，通过注射泵和固定在物镜尖端的注射器针头，以 2 µL/min 的流速向物镜提供水。</li>
			<li>定期检查水位，以避免蒸发，确保整个测量过程中成像条件的一致性。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>拉曼光谱数据采集
		<ol>
			<li>打开泵浦激光器，并调节其功率，使样品平面上的激光功率达到75 mW。</li>
			<li>打开 Micro-manager&#160;开源显微镜控制软件。在 配置设置，选择 BF 并点击 活体 在软件窗口左侧选择以查看明场图像。选取待采集拉曼光谱的目标单个细胞，然后点击 停止 以终止明场观察。</li>
			<li>通过在CCD相机上最大化信号计数来设定拉曼成像平面的Z坐标。</li>
			<li>为此，请打开CCD相机控制软件（LightField）；在 实验设置，设置 曝光时间 至1.5秒。然后，单击 运行 在 实验 工具栏，并打开激光束。</li>
			<li>然后，调整Z位置，以最大化指纹区600 cm⁻¹处的信号计数。-1 至 1800 cm⁻¹-1 以优化与生物特征相关的拉曼峰的可视化效果。然后关闭激光器并点击 停止 在 实验 CCD相机软件的工具栏，然后退出软件。 
			注意：在CCD相机上观察到的拉曼信号最大计数与沿Z轴方向相对于成像平面+8 µm的位置相对应&#160;未显示任何与细胞相关的拉曼峰，因为焦点落在石英内部较深位置。该值可能因细胞类型和状态不同而有所变化。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用 MATLAB 脚本启动数据采集过程，该脚本将自动处理多维测量中的拉曼通道，并保存高光谱拉曼数据。</li>
		<li>将视野设置为 50 × 50 µm2，40 × 40 像素，每个像素区域对应 1.25 × 1.25 µm2将每张拉曼光谱的曝光时间设置为1.5 s。 
		注意：定期使用对乙酰氨基酚样品进行波数校准，以标注已知的拉曼峰。通过二次插值法校准拉曼位移轴。 
		警告：请小心操作激光器。在安装和运行过程中，务必佩戴针对激光波长 rated 的适当护目镜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. RS 数据分析
<ol>
	<li>通过基于网络的 RamApp 工具（https://ramapp.io/）对拉曼高光谱图进行后处理：
	<ol>
		<li>登录基于网络的工具。</li>
		<li>导入高光谱数据。在 我的分析 标签，点击 新 上传包含空间和光谱数据变量以及x轴变量（即拉曼位移值）的.mat文件。</li>
		<li>为了将光谱截断至指定的拉曼位移区域，在 裁剪并旋转 下拉菜单，点击 光谱作物 并定义拉曼位移区域的下边界和上边界，其值等于 600 cm⁻¹-1 和 1800 cm⁻¹-1分别。 
		注意：通过执行此光谱截断，可将与培养皿石英材料相关的宽而高幅度的峰从分析中排除。</li>
		<li>为了校正拉曼光谱中的宇宙射线干扰，在去噪选项中，点击 去除尖峰，选择 Z分数 作为 方法，并设置 阈值 等于 8. 
		注意：去尖峰预处理功能有助于解决像素信号中因宇宙射线引起的尖峰问题。</li>
		<li>选择该选项 使用一阶差分 通过计算光谱强度的一阶离散差分来识别异常值，并勾选该选项 校正尖峰信号每个坏像素的光谱将被其邻近像素的中值光谱所替代。</li>
		<li>点击 运行 以校正尖峰信号。</li>
		<li>为了去除对应于每个波数的图谱中的噪声， 去噪 选项，点击 平滑图，选择 中值滤波器，并将滤波器应用于地图每个像素时所考虑的正方形边长设为3像素。然后单击 运行.</li>
		<li>要对每个像素的光谱应用滤波以进行平滑处理，请点击 平滑光谱 在……之内 去噪 选择。选择 Savitzky-Golay 滤膜作为 方法 将滤波器窗口的长度设为7，滤波器的多项式阶数设为2，然后点击 运行. 
		注意：Savitzky-Golay 滤波器需要指定滤波窗口的长度（一个正奇数）和多项式的阶数。</li>
		<li>为了从前景中去除平均背景信号，请打开 光学基底去除 面板并单击 确定底物设置 k均值 作为 方法 且聚类数量等于2。 
		注意：此功能用于分割细胞（细胞 &#34;前景&#34;）及其底物，采用聚类方法进行分析。随后，您可从前景信号中减去平均背景信号，或限制某些步骤仅在前景像素上执行。聚类数量的选择可能因具体样本而异。</li>
		<li>在 高级选项，检查 形态学清洗 去除前景中的一些小斑点（例如，伪影细胞部分等）。然后单击 运行.</li>
		<li>在 光学基底去除 面板，为减去平均背景信号，请单击 移除底物，然后选择 全球平均值（中心95%数值的均值） 并点击 运行. 
		注意：K-means 通常速度更快，但具有非确定性（然而，由于随机种子已固定，在其他条件相同的情况下，每次运行将获得相同的结果）。若前景的某些部分仍被识别为背景，可将聚类数量增加至 2 以上。平均信号强度最低的聚类被定义为背景。</li>
		<li>为了校正基线荧光，打开 基线 面板并单击 正确基线选择 自适应平滑度偏最小二乘法（asPLS） 并将 λ 设为 5000000。然后，点击 运行. 
		注意：共有 7 种可选方法，其中 5 种基于惩罚最小二乘法（PLS）。在这些 PLS 方法中，需要设置一个平滑参数（λ）。λ 值越高，得到的基线越平滑。</li>
		<li>通过除以其弗罗贝尼乌斯范数来归一化每个拉曼高光谱图，请点击 其他 并选择 标准化 选项。然后，选择 弗罗贝尼乌斯 作为 方法，然后单击 运行. 
		注意：使用 Frobenius 范数对整个数据矩阵进行归一化。</li>
		<li>为获得显示亚细胞组分空间分布的伪彩色图像，需在 图像 右侧的面板，位于 强度图像，点击 打开菜单 符号，然后单击 编辑图像 打开编辑面板的选项。</li>
		<li>在编辑面板上，选择 单一条带，然后定义光谱范围（例如，715−725 cm⁻¹）-1 （用于细胞质）。选择 双色 在 颜色图，定义颜色、强度阈值和不透明度，然后单击 确认.</li>
		<li>要下载单点光谱，可点击图像上感兴趣区域的像素以进行选择。然后，在 光谱图例 面板，在 光标 切片，点击 下载光谱对不同的亚细胞组分重复相同的步骤。</li>
		<li>要导出前景和基底的拉曼光谱，在 光谱图例 面板，在 底物鉴定 切片，点击 下载光谱 对于两者 前景 和 底物 切片 
		注意：在先前描述的拉曼光谱（RS）数据分析方案中，已介绍了预处理步骤和单变量分析，用于生成假彩色图像，以展示关键亚细胞成分的空间分布，以及来自前景和基底的拉曼强度光谱和亚细胞结构的单点光谱。尽管下游分析通常根据具体的生物学问题进行定制，本研究现重点介绍可通过以下方式实现的代表性多变量分析与分类方法 地图分析 网络工具所使用部分。这些包括 聚类分析、主成分分析（PCA）、多元曲线分辨（MCR）、N-FINDR 和 光谱拟合光谱拟合可利用基于距离的方法（如皮尔逊相关系数或光谱角制图）对光谱特征进行量化与比较。可采用k均值、小批量k均值或层次聚类等算法进行聚类分析，从而根据光谱相似性实现高光谱数据的分割。主成分分析（PCA）可用于降低数据维度并突出显示方差模式，而多元曲线分辨（MCR）则可将混合信号分解为纯组分光谱。N-FINDR算法通过首先应用PCA降低数据维度，进而提取端元光谱，特别适用于高光谱数据集。这些工具为拉曼光谱数据中编码的生物学模式的下游探索提供了稳健的分析框架。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. TPM 测量方案
<ol>
	<li>准备显微镜装置。
	<ol>
		<li>在显微镜的物镜上滴加一滴蒸馏水。将样品放置在显微镜的平移载物台上。调整样品位置，使其与物镜对齐。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对齐物镜和聚光镜。
	<ol>
		<li>打开显微镜并启动 TomoStudio 成像软件。点击工具栏上的显微镜图标。初始化完成后，点击 Configuration（配置）。在 Job（任务）面板中选择 LiveCell（活细胞），并将 Medium（介质）设置为 PBS（磷酸盐缓冲液）。 
		注意：当介质选择为 PBS 时，Medium（介质）面板中的折射率（RI）值将自动设置为 1.337。</li>
		<li>进入成像软件控制面板中的 Calibration（校准）选项卡。分别选择 Focus（聚焦）和 Surface（表面）来设定物镜和聚光镜的轴向位置。</li>
		<li>点击 Scanning（扫描）模式，手动调节镜头，确保照明图案集中在视场中央且几乎静止不动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定位样品。
	<ol>
		<li>点击 Normal（常规）模式，并调节平移载物台，使细胞位于视场内。通过调节物镜的轴向位置对样品进行聚焦，直至屏幕上的样品边界几乎不可见。</li>
		<li>调节平移载物台，找到无细胞区域，确保视野无遮挡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>校准系统。
	<ol>
		<li>在成像软件中选择 Calibrate（校准），以在不同照明角度下采集多个二维全息图。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取三维折射率（RI）断层图像。
	<ol>
		<li>调节平移载物台，使细胞位于视场中心。进入 Acquisition（采集）选项卡，选择 3D Snapshot（三维快照）以采集细胞的断层图像。 
		注意：单个细胞的三维折射率断层图像采集时间显著更短（数量级为秒级），远低于拉曼光谱（RS）数据所需的采集时间；因此，通常无需为 TPM 系统配备载物台上的培养箱。然而，若需对大量细胞进行测量，或在特定条件下进行实验，可使用专用的商用培养室，这些培养室可提供生理条件并集成至 TPM 系统中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. TPM 数据分析
<ol>
	<li>使用 TomoStudio 软件对 TPM 图像进行后处理。
	<ol>
		<li>为了可视化全息断层图像，在 数据导航 面板中选择数据，右键单击该数据，然后点击 打开。研究 选项卡将自动打开以进行进一步分析。在 数据管理器 面板中，点击 RI 断层图像。</li>
		<li>在 体可视化 面板中，选择 RI，并在 RI 画布内绘制四个矩形颜色框。 
		注意：每个颜色框可在 显示 面板上显示的断层图像中，将特定颜色关联到由 RI 画布中该框所标识的 RI 范围表征的细胞组分。每绘制一个颜色框后，相关的信息将自动出现在 RI 画布下方的表格中。</li>
		<li>在 RI 画布下方的面板中，为每个颜色框设置 RI 范围 的最小值和最大值（例如，第一个颜色框：MinRI = 1.3450，MaxRI = 1.3499；第二个颜色框：MinRI = 1.3506，MaxRI = 1.3571；第三个颜色框：MinRI = 1.3586，MaxRI = 1.3650；第四个颜色框：MinRI = 1.3688，MaxRI = 1.3866）。为每个框设置不透明度值和颜色（通过双击每个框并选择颜色）。这使得能够根据三维 RI 分布来可视化断层图像。</li>
		<li>点击 保存 以保存定义的 RI 范围和颜色框。 
		注意：RI 范围应根据具体样本进行调整。</li>
		<li>为了获得细胞形态的定量描述符（即体积 [V]、表面积 [S]、投影面积 [A]、平均 RI、密度 [D]、干质量 [DM] 和球形度 [Φ]），请使用 分析 界面。 
		注意：有关定量参数理论计算的详细信息可参见此处2,23。
		<ol>
			<li>在工具栏中点击 分析。在右侧的 分析 面板中，于 分割 面板选择 手动，并将 RI 阈值 设置为 1.3450，然后点击 应用。 
			注意：请确保 RII（fl/pg）和基线 RI 的值分别为 0.19（折射率增量，该值在先前研究中已被广泛确立24）和 1.3370（用于 PBS 背景校准的 PBS 的 RI）。成像软件将根据设定的 RI 阈值对目标细胞进行体积分割，并计算形态学指标（V、S、A、平均 RI、D、DM 和 Φ），并将结果报告在 测量 面板的输出表格中。</li>
			<li>点击 保存 以保存计算得到的形态学指标。 
			注意：除了所使用的软件外，还有多种开源工具可用于从 TPM 数据中量化形态特征。CellProfiler（https://cellprofiler.org/）提供图像分析工具，包括适用于相位对比图像的分割和特征提取功能。Fiji（https://fiji.sc/）是一款开源软件，具有用于分割和计算形态参数的插件25。Napari（https://napari.org/）是一个支持集成机器学习模型用于分割和分析的多维图像查看器。Ilastik（https://www.ilastik.org/）提供基于机器学习的分割工具，而 DeepImageJ（https://deepimagej.github.io/）将深度学习模型与 ImageJ/Fiji 集成，用于高级分析。此外，MorphoLibJ（https://imagej.net/plugins/morpholibj）为 Fiji 提供了用于二维和三维形态学操作的工具。Cellpose326 是另一种基于深度学习的细胞分割工具，可应用于相位对比成像。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gosnell, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+non-invasive+cell+characterisation+and+discrimination+based+on+multispectral+autofluorescence+features%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features.</a> Sci Rep. 6 (1), 23453(2016).</li>
<li>Bresci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+morpho-molecular+phenotyping+of+living+cancer+cells+by+combined+Raman+spectroscopy+and+phase+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Label-free morpho-molecular phenotyping of living cancer cells by combined Raman spectroscopy and phase tomography.</a> Commun Biol. 7 (1), 1-13 (2024).</li>
<li>Rocha, R. A., Fox, J. M., Genever, P. G., Hancock, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+phenotyping+and+heterogeneity+assessment+of+mesenchymal+stromal+cells+using+label-free+Raman+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Biomolecular phenotyping and heterogeneity assessment of mesenchymal stromal cells using label-free Raman spectroscopy.</a> Sci Rep. 11 (1), 4385(2021).</li>
<li>Vicar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+segmentation+methods+for+label-free+contrast+microscopy%3A+review+and+comprehensive+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Cell segmentation methods for label-free contrast microscopy: review and comprehensive comparison.</a> BMC Bioinform. 20 (1), 360(2019).</li>
<li>Kang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+confocal+Raman+and+quantitative+phase+microscopy+system+for+biomedical+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Combined confocal Raman and quantitative phase microscopy system for biomedical diagnosis.</a> Biomed Opt Express. 2 (9), 2484-2492 (2011).</li>
<li>Pandey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+diffraction+phase+microscopy+and+Raman+imaging+for+label-free+morpho-molecular+assessment+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Integration of diffraction phase microscopy and Raman imaging for label-free morpho-molecular assessment of live cells.</a> J Biophotonics. 12 (4), e201800291(2019).</li>
<li>Zhao, W., Sun, D., Yue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+multimodal+non-linear+optical+imaging+of+three-dimensional+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Phys%22%5BJournal%5D)">Label-free multimodal non-linear optical imaging of three-dimensional cell cultures.</a> Front Phys. 10, 1100090(2023).</li>
<li>Hanna, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy%3A+current+applications+in+breast+cancer+diagnosis%2C+challenges+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy: current applications in breast cancer diagnosis, challenges and future prospects.</a> Br J Cancer. 126 (8), 1125-1139 (2022).</li>
<li>Dodo, K., Fujita, K., Sodeoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+for+chemical+biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy for chemical biology research.</a> J Am Chem Soc. 144 (43), 19651-19667 (2022).</li>
<li>Puppels, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+single+living+cells+and+chromosomes+by+confocal+Raman+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Studying single living cells and chromosomes by confocal Raman microspectroscopy.</a> Nature. 347 (6290), 301-303 (1990).</li>
<li>Elumalai, S., Managó, S., De Luca, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+microscopy%3A+progress+in+research+on+cancer+cell+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Raman microscopy: progress in research on cancer cell sensing.</a> Sensors (Basel). 20 (19), 5525(2020).</li>
<li>Chandra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+the+molecular+secrets%3A+a+comprehensive+review+of+Raman+spectroscopy+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Unveiling the molecular secrets: a comprehensive review of Raman spectroscopy in biological research.</a> ACS Omega. 9 (51), 50049-50063 (2024).</li>
<li>Cacace, T., Bianco, V., Ferraro, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phase+imaging+trends+in+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Laser+Eng%22%5BJournal%5D)">Quantitative phase imaging trends in biomedical applications.</a> Opt Laser Eng. 135, 106188(2020).</li>
<li>Nguyen, T. L., Pradeep, S., Judson-Torres, R. L., Reed, J., Teitell, M. A., Zangle, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phase+imaging%3A+recent+advances+and+expanding+potential+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Quantitative phase imaging: recent advances and expanding potential in biomedicine.</a> ACS Nano. 16 (8), 11516-11544 (2022).</li>
<li>Kuś, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+phase+microscopy+of+living+three-dimensional+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Tomographic phase microscopy of living three-dimensional cell cultures.</a> J Biomed Opt. 19 (4), 046009(2014).</li>
<li>Memmolo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+minimized+data+reduction+in+single-cell+tomographic+phase+microscopy+using+3D+Zernike+descriptors%5BTitle%5D)+AND+%22Intell+Comput%22%5BJournal%5D)">Loss minimized data reduction in single-cell tomographic phase microscopy using 3D Zernike descriptors.</a> Intell Comput. 2, 0010(2023).</li>
<li>Jin, D., Zhou, R., Yaqoob, Z., So, P. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+phase+microscopy%3A+principles+and+applications+in+bioimaging+%5BInvited%5D%5BTitle%5D)+AND+%22JOSA+B%22%5BJournal%5D)">Tomographic phase microscopy: principles and applications in bioimaging [Invited].</a> JOSA B. 34 (5), B64-B77 (2017).</li>
<li>Pirone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stain-free+identification+of+cell+nuclei+using+tomographic+phase+microscopy+in+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">Stain-free identification of cell nuclei using tomographic phase microscopy in flow cytometry.</a> Nat Photonics. 16 (12), 851-857 (2022).</li>
<li>Bresci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+morpho-molecular+imaging+reveals+early+therapy-induced+senescence+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Non-invasive morpho-molecular imaging reveals early therapy-induced senescence in human cancer cells.</a> Sci Adv. 9 (37), eadg6231(2023).</li>
<li>Ghislanzoni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+diffraction+tomography+and+Raman+confocal+microscopy+for+the+investigation+of+vacuoles+associated+with+cancer+senescent+engulfing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Optical diffraction tomography and Raman confocal microscopy for the investigation of vacuoles associated with cancer senescent engulfing cells.</a> Biosensors. 13 (11), 973(2023).</li>
<li>Bischof, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+bioimaging+across+disciplines+and+scales%3A+challenges%2C+opportunities+and+breaking+down+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22npj+Imageing%22%5BJournal%5D)">Multimodal bioimaging across disciplines and scales: challenges, opportunities and breaking down barriers.</a> npj Imageing. 2 (1), 1-6 (2024).</li>
<li>Kobayashi-Kirschvink, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+single-cell+RNA+expression+profiles+in+live+cells+by+Raman+microscopy+with+Raman2RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Prediction of single-cell RNA expression profiles in live cells by Raman microscopy with Raman2RNA.</a> Nat Biotechnol. 42 (11), 1726-1732 (2024).</li>
<li>Popescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), C538-C544 (2008).</li>
<li>Kim, K., Lee, S., Yoon, J., Heo, J., Choi, C., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+label-free+imaging+and+quantification+of+lipid+droplets+in+live+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional label-free imaging and quantification of lipid droplets in live hepatocytes.</a> Sci Rep. 6 (1), 36815(2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Stringer, C., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose3%3A+one-click+image+restoration+for+improved+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose3: one-click image restoration for improved cellular segmentation.</a> Nat Methods. 22 (3), 592-599 (2025).</li>
<li>Talari, A. C. S., Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc+Rev%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy of biological tissues.</a> Appl Spectrosc Rev. 50 (1), 46-111 (2015).</li>
<li>Hobro, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+and+Raman+optical+activity+%28ROA%29+analysis+of+RNA+structural+motifs+in+Domain+I+of+the+EMCV+IRES%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Raman and Raman optical activity (ROA) analysis of RNA structural motifs in Domain I of the EMCV IRES.</a> Nucleic Acids Res. 35 (4), 1169-1177 (2007).</li>
<li>Samuel, A. Z., Sugiyama, K., Ando, M., Takeyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+imaging+of+intracellular+RNA%2C+DNA%2C+and+liquid-liquid+phase+separated+membraneless+organelles+with+Raman+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct imaging of intracellular RNA, DNA, and liquid-liquid phase separated membraneless organelles with Raman microspectroscopy.</a> Commun Biol. 5 (1), 1-9 (2022).</li>
<li>Kuhar, N., Sil, S., Umapathy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+Raman+spectroscopic+techniques+to+study+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochim+Acta+A+Mol+Biomol+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Potential of Raman spectroscopic techniques to study proteins.</a> Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 258, 119712(2021).</li>
<li>Park, C., Shin, S., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+quantification+of+three-dimensional+resolution+in+optical+diffraction+tomography+using+the+projection+of+maximal+spatial+bandwidths%5BTitle%5D)+AND+%22JOSA+A%22%5BJournal%5D)">Generalized quantification of three-dimensional resolution in optical diffraction tomography using the projection of maximal spatial bandwidths.</a> JOSA A. 35 (11), 1891-1898 (2018).</li>
<li>Bresci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+monitoring+of+embryonic+development+in+living+colonies+by+combining+Raman+spectroscopy+and+tomographic+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Multiscale+Imaging+Spectrosc+VI%22%5BJournal%5D)">Label-free monitoring of embryonic development in living colonies by combining Raman spectroscopy and tomographic phase microscopy.</a> Multiscale Imaging Spectrosc VI. PC13327, PC1332703(2025).</li>
<li>Baczewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+index+changes+of+cells+and+cellular+compartments+upon+paraformaldehyde+fixation+acquired+by+tomographic+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Refractive index changes of cells and cellular compartments upon paraformaldehyde fixation acquired by tomographic phase microscopy.</a> Cytometry A. 99 (4), 388-398 (2021).</li>
<li>Movasaghi, Z., Rehman, S., Umapathy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc+Rev%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy of biological tissues.</a> Appl Spectrosc Rev. 42 (5), 493-541 (2007).</li>
<li>Butler, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Raman+spectroscopy+to+characterize+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using Raman spectroscopy to characterize biological materials.</a> Nat Protoc. 11 (4), 664-687 (2016).</li>
<li>Allakhverdiev, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+and+its+modifications+applied+to+biological+and+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy and its modifications applied to biological and medical research.</a> Cells. 11 (3), 386(2022).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+cancer+metabolism+through+spontaneous+and+coherent+Raman+spectroscopy+and+stable+isotope+probing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Unveiling cancer metabolism through spontaneous and coherent Raman spectroscopy and stable isotope probing.</a> Cancers. 13 (7), 1718(2021).</li>
<li>Swain, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cell+line+models+of+primary+human+cells+by+Raman+spectral+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Assessment of cell line models of primary human cells by Raman spectral phenotyping.</a> Biophys J. 98 (8), 1703-1711 (2010).</li>
<li>Smith, R., Wright, K., Ashton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy%3A+an+evolving+technique+for+live+cell+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy: an evolving technique for live cell studies.</a> Analyst. 141 (12), 3590-3600 (2016).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman-guided+subcellular+pharmaco-metabolomics+for+metastatic+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Raman-guided subcellular pharmaco-metabolomics for metastatic melanoma cells.</a> Nat Commun. 11 (1), 4830(2020).</li>
<li>Jones, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+techniques%3A+fundamentals+and+frontiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Res+Lett%22%5BJournal%5D)">Raman techniques: fundamentals and frontiers.</a> Nanoscale Res Lett. 14, 231(2019).</li>
<li>Shirokova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possibilities+of+holotomographic+microscopy+for+studying+primary+cell+cultures+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+CNN%22%5BJournal%5D)">Possibilities of holotomographic microscopy for studying primary cell cultures of the brain.</a> Proc IEEE CNN. 208 (211), 208-211 (2024).</li>
<li>Choi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic phase microscopy.</a> Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li>
<li>Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+phase+imaging+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photonics%22%5BJournal%5D)">Quantitative phase imaging in biomedicine.</a> Nat Photonics. 12 (10), 578-589 (2018).</li>
<li>Jung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+non-invasive+quantitative+measurement+of+lipid+contents+in+individual+microalgal+cells+using+refractive+index+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Label-free non-invasive quantitative measurement of lipid contents in individual microalgal cells using refractive index tomography.</a> Sci Rep. 8 (1), 6524(2018).</li>
<li>Debnath, S. K., Park, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+phase+imaging+with+a+spatial+phase-shifting+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative phase imaging with a spatial phase-shifting algorithm.</a> Opt Lett. 36 (23), 4677-4679 (2011).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

我们提出了一种多模态方法及简明的分析流程，整合了两种先进的无标记成像技术：拉曼光谱（RS）和双光子显微（TPM）。所述工作流程实现了对活体人乳腺癌单细胞（MDA-MB-231）快速、无创的形态-化学表型分析，无需外源性标记。
拉曼光谱（RS）是一种非破坏性技术，可通过检测分子的振动模式来表征生物样品的生化组成9,27,34,35。由于水的拉曼散射信号可忽略不计，RS适用于水相环境。这一优势使得在无需复杂样品前处理的情况下，即可对活细胞在其培养条件下进行精确的分子检测2,36。RS还具备提供多种生物分子（如脂质、蛋白质和核酸）分子指纹的独特能力，这对于确定细胞表型至关重要37</...

细胞鉴定与表型分析是生物医学研究的关键环节1。能够在形态学和分子水平上对细胞进行表征，对于理解细胞功能、分化过程及病理状态至关重要1,2,3。这一技术在肿瘤学领域尤为重要，因为准确的细胞分型对于肿瘤诊断、疾病分期判断以及最终确定治疗靶点具有重要意义2。传统的细胞鉴定方法无法提供时间动态信息，且通常依赖于染色或标记等侵入性技术，这些操作可能干扰细胞的天然状态，并在数据中引入潜在偏差4。因此，迫切需要发展非侵入性策略，以在细胞保持天然、未受干扰的状态下，实现对其准确而全面的表型分析。
在此背景下，无标记多模态成像方法通过结合互补的成像模式，同时获取细胞的形态学和分子信息，从而彻底改变了细胞生物学研究2,5。这些方法能够对细胞进行整合性且非侵入式的表征，而传统的单一技术往往难以实现这一点2,5,6。例如，尽管荧光显微镜等显微技术已广泛应用于细胞形态和功能成像，但其本身存在固有局限性。荧光方法常受到光漂白、光毒性和可靶向分子数量有限等问题的困扰，从而限制了其分析能力4。此外，这些方法通常需要使用外源性标记物或染料，可能干扰细胞的天然状态或导致人为假象7。
多模态成像平台结合了多种成像技术的优势，能够在无需标记的情况下从活细胞中获取不同类型的数据，从而克服了上述局限性。将拉曼光谱（RS）与其他成像方式（如相差显微镜或层析相位显微镜（TPM））相结合，已成为克服单一技术局限性的有效策略。事实上，多模态成像能够更深入地理解细胞表型，特别是在癌症等复杂的生物条件和病理状态下，分子与结构特性对于精确表征至关重要2,5。
无标记拉曼光谱（RS）非常适合细胞的化学成像8。通过检测分子振动模式，RS可提供生化指纹信息，揭示细胞分子组成的深层细节9,10,11。从生物样品获取的拉曼光谱包含多种生物分子的信息，如脂质、蛋白质、核酸和代谢物，这些分子在理解细胞分子特性方面起着关键作用9,12。RS的主要优势之一在于其非侵入性，能够在不改变细胞生理状态的情况下，对处于天然状态的活细胞进行表征。
尽管拉曼光谱技术具有诸多优势，但也存在一些局限性。事实上，虽然拉曼光谱能够提供详细的分子信息，却无法获得关于细胞形态或结构的定量信息2。这正是双光子显微成像（TPM）等互补成像技术发挥关键作用之处。
TPM 是一种定量相位成像（QPI）技术13,14，能够实现对细胞形态的高分辨率、无标记、定量信息的可视化15,16。与传统显微技术不同，TPM 无需使用对比剂，而是通过测量样品折射率（RI）变化所引起的相位偏移来工作17。相位偏移可提供有关细胞结构特性的信息，包括其体积、表面积、形状及内部结构2,18。TPM 可达到纳米级的高空间分辨率，因此是记录活细胞高分辨率形态细节的理想技术。此外，通过重建三维 RI 断层图像，可在活体环境中可视化亚细胞结构18，相比二维投影可提供更准确的信息。然而，TPM 的主要局限之一在于缺乏化学特异性，因为它主要提供细胞形态和相位分布的信息，无法区分不同的化学组分或识别生化特征。
将拉曼光谱（RS）与双光子显微成像（TPM）结合为多模态技术，可在细胞表型分析中提供显著优势。拉曼光谱能够提供丰富的分子信息，而双光子显微成像则补充了结构信息，使得细胞形态得以被详细分析。近年来，已有多个聚焦于癌症研究的研究成功实现了拉曼光谱与双光子显微成像的联合应用2,19,20。例如，先前的研究报道，将拉曼光谱与全息相位显微成像数据进行共定位，可提供互补的分子与形态学信息，从而区分不同类型的细胞以及肿瘤发展的不同阶段2。这些研究凸显了多模态成像在提升细胞表型分析准确性方面的强大能力，尤其在癌症研究中，细胞的分子与结构特征与其恶性程度及生物学行为密切相关2,20。
尽管多模态成像技术近年来取得了进展，但在数据处理与分析方面仍存在诸多挑战21。多模态成像技术产生的大量数据往往难以分析，必须采用简便直接的方法来提取有意义的信息。为应对这一挑战，需建立用户友好的数据处理流程，以应对数据的复杂性，并最大限度减少分析过程中的人为偏差。此类流程对于实现结果的准确性与可重复性，以及将这些方法转化为临床和诊断应用至关重要。
本研究旨在展示将拉曼光谱（RS）与双光子显微成像（TPM）相结合，用于无标记、高速且非侵入性地对活体单个癌细胞进行表型分析的潜力。通过融合这两种强大的成像技术，我们对人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）的分子和形态学特性进行了全面而定量的表征。本研究还强调了建立无人为偏差的数据处理流程的重要性，以确保从多模态数据集中提取的信息准确可靠。在此，我们致力于构建一个可用于癌细胞表型分析的稳健平台，并可推广至其他类型的细胞。该方法具有高度的通用性和灵敏性，有望广泛应用于从基础细胞生物学研究到临床诊断在内的多种生物医学领域。

<table><tbody><tr><td>CCD相机</td><td>Princeton Instruments</td><td>PIXIS 100BR eXcelon</td><td>用于检测拉曼散射信号。</td></tr><tr><td>CCD相机控制软件</td><td>Princeton Instruments</td><td>LightField</td><td></td></tr><tr><td>连续波钛宝石激光器（波长：785 nm）</td><td>Spectra-Physics</td><td>3900 S</td><td>用于拉曼显微成像的激发光源。</td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>ThorLabs</td><td>DMSP750B</td><td>749 nm二向色镜，将785 nm拉曼激发光导向样品，并滤除荧光和明场信号。</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜主体</td><td>Olympus</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>激光器（波长：532 nm）</td><td>Spectra-Physics</td><td>Millennia eV</td><td>作为785 nm钛宝石激光系统的泵浦激光器。</td></tr><tr><td>MATLAB软件</td><td>MathWorks</td><td>2023a</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>近红外光谱仪</td><td>Andror</td><td>Holospec HS-HSG-785-LF</td><td>用于分析背向散射光的光谱。</td></tr><tr><td>物镜（60&amp;times; 1.2 NA，水浸）</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60&amp;times;</td><td></td></tr><tr><td>载物台培养室</td><td>Tokai Hit</td><td>stxg-welsx-set</td><td></td></tr><tr><td>开源显微镜控制软件</td><td>&amp;micro;Manager</td><td>Micro-Manager-2.0</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>无酚DMEM/F-12培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21041025</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10-010-023</td><td></td></tr><tr><td>石英玻璃底培养皿</td><td>Waken B Tech</td><td>SF-S-D12</td><td></td></tr><tr><td>拉曼数据分析软件</td><td>RamApp</td><td></td><td>基于网络的拉曼高光谱数据处理工具。</td></tr><tr><td>sCMOS相机</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>Orca Flash 4.0 v2</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Chemyx</td><td>Fusion 720</td><td></td></tr><tr><td>断层相位显微镜</td><td>Tomocube, Inc.</td><td>HT-2H</td><td>用于获取定量相位图像的商用系统。</td></tr><tr><td>TPM数据分析软件</td><td>Tomocube, Inc.</td><td>TomoStudio</td><td>用于分析断层相位显微镜（TPM）数据的软件。</td></tr></tbody></table>

一种多模态成像框架推动无标记活体乳腺癌细胞表型分析

A Multimodal Imaging Framework to Advance Phenotyping of Living Label-free Breast Cancer Cells

本文介绍了多模态共聚焦拉曼微光谱技术（RS）与层析相位显微技术（TPM），用于快速对人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）进行形态-化学表型分析。利用这些先进显微技术的非侵入性特点，我们在细胞天然生理环境中，无需标记即可从活细胞中获取详细的形态-分子数据。我们开发了去除了人为偏倚的数据处理流程，用于分析高光谱拉曼图像（覆盖600 cm-1至1800 cm-1的拉曼模式，可特异性表征多种分子键和亚细胞结构），以及三维折射率层析图提供的形态学数据（可在纳米级分辨率下测量细胞体积、表面积、贴壁面积和球形度，同时提供干质量和密度信息）。通过对RS和TPM所提供的丰富单细胞信息进行系统性解析，我们以定量方式展示了这种多模态显微方法在肿瘤性乳腺癌细胞表型分析中的优势。我们的工具还能在无需任何标记的情况下，进一步揭示亚细胞层面的信息。最后，我们研究并讨论了由RS和TPM所获得数据集中的独特特征或相关性信息。我们相信，当生物医学研究需要对培养中的活细胞进行快速且非侵入性的分析时，本研究所提供的工具和定量数据分析流程有望彻底改变表型分析任务，并具有未来向临床诊断应用转化的潜力。

我们描述了一种基于共聚焦拉曼光谱（RS）和双光子显微技术（TPM）的无标记活细胞形态-化学表征工作流程。我们测试了该工作流程获取人乳腺癌细胞系MDA-MB-231分子组成和形态参数的能力（图1）。
将 MDA-MB-231 细胞接种于石英玻璃底培养皿中。使用自行搭建的共聚焦拉曼显微镜（图 1A），在 785 nm 连续激光激发下，采集单个细胞在拉曼位移（Ω）600 cm-1 至 1800 cm-1 范围内的拉曼光谱，即生物物质拉曼振动图谱的指纹区27。每次单细胞拉曼信号采集耗时约 40 分钟。实验过程中采用载物台培养箱以维持细胞的生理状态。此外，为验证本方法的非侵入性，测量后我们持续将细胞传代培养至少两代，并在此期间密切监测细胞增殖情况，未观察到生长异常或非正常脱落现象。所得拉曼光谱以三维 XY-Ω 超立方体形式表示，其中 XY 平面上的每个像素点对应指纹区的一个光谱。</...

本方案介绍了一种多模态方法，结合拉曼光谱与层析相位显微技术，用于无标记、非侵入性地对活体人乳腺癌细胞进行表型分析。该方法包含一个用户友好、无主观偏倚的分析流程，可实现快速、定量的形态-化学分析，为癌症研究和细胞生物学提供详细的分子与结构信息。

我们提出了一种多模态共聚焦拉曼微光谱（RS）与层析相位显微技术（TPM），用于快速进行人乳腺组织的形态-化学表型分析。

在本实验方案中，我们介绍了利用共聚焦拉曼显微光谱与层析相位显微技术进行多模态成像，以实现对处于天然生理环境中的乳腺癌细胞进行快速且无偏倚的形态化学表型分析。结合拉曼显微光谱与层析相位显微技术，可在生理条件下实现无标记成像，提供细胞的生化与形态学信息，克服了传统扰动性方法（如荧光标记或化学固定）的局限性。我们的结果表明，该多模态方法在乳腺癌细胞形态化学表型分析方面具有很高的应用潜力。此外，其多功能性、可重复性与非侵入性使其成为从基础细胞生物学研究到临床诊断等广泛生物医学应用中极具前景的工具。我们的目标是创建一个光学生物标志物图谱，用于类器官模型中的无创胚胎质量控制、细胞衰老检测和药物筛选，以推动再生医学和疾病研究的发展。[讲师] 首先，将 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞样品放入载物台上的培养箱中。为水浸物镜加入水滴。开启自动水浸进水系统，以向物镜提供水源。定期检查水位，防止蒸发，确保在整个测量过程中成像条件稳定。现在，打开泵浦激光器，并调节其输出，使样品平面上的激光功率达到 75 毫瓦。启动 Micro-Manager 显微镜控制软件。在配置设置中，选择明场（BF），然后点击软件窗口左侧的“实时”按钮。选择目标单个细胞后，点击“停止”以结束明场观察。打开 CCD 相机控制软件。在实验设置中，将曝光时间设为 1.5 秒。点击实验工具栏上的“运行”按钮，并打开激光束。接下来，调节 Z 轴位置，以最大化指纹区（600 至 1,800 cm⁻¹）的信号计数，然后关闭激光。点击实验工具栏上的“停止”按钮，并退出软件。使用 MATLAB 脚本启动数据采集过程，该脚本可自动管理多维测量中的拉曼通道并保存数据。将视场设为 50 × 50 微米的正方形，分辨率为 40 × 40 像素，每个像素覆盖 1.25 × 1.25 微米的面积。将每条拉曼光谱的曝光时间设为 1.5 秒，然后运行 MATLAB 脚本。对于拉曼高光谱图的后处理，启动基于网页的 RamApp 工具。通过点击“我的分析”标签页中的“新建”并上传包含空间和光谱数据变量以及 X 轴变量的 .mat 文件，导入高光谱数据。为截取光谱，在“裁剪与旋转”菜单中选择“光谱裁剪”。将拉曼位移区域的下限和上限分别定义为 600 和 1,800 cm⁻¹。为校正宇宙射线干扰，进入“去噪”模块，点击“去尖峰”，选择 Z-score 作为方法，并将阈值设为 8。勾选“使用一阶差分”和“校正尖峰”选项，然后点击“运行”以应用校正。为去除图像中的噪声，点击“平滑图像”，选择中值滤波器，将方形滤波窗口大小设为 3 像素，然后点击“运行”。为平滑每个像素的光谱，选择 Savitzky-Golay 滤波器。将滤波窗口长度设为 7，多项式阶数设为 2，然后点击“运行”。为减去平均背景信号，打开“光学基底去除”功能，点击“识别基底”，选择 k-means 方法并设置为两个聚类，然后点击“高级选项”。选择形态学清洗以去除前景中的小斑点，然后点击“运行”。为去除平均背景信号，点击“去除基底”，选择“全局平均”或“中心 95% 数值的均值”方法，然后点击“运行”。为校正基线荧光，打开基线面板，点击“校正基线”，选择自适应平滑 PLS 方法，将 lambda 设为 500 万，然后点击“运行”。对每幅拉曼高光谱图进行归一化处理时，进入“杂项”模块，选择“归一化”，采用 Frobenius 方法，然后点击“运行”。为生成显示亚细胞分布的伪彩图像，在“图像”面板中，点击“强度图像”下方的打开菜单符号，然后点击“编辑图像”。在编辑面板中，选择“单波段”并定义光谱范围。然后在调色板中选择“双色”，定义颜色、强度阈值和不透明度后点击“确认”。为下载单点光谱，选择感兴趣像素，然后在光谱图例面板中点击“下载光谱”。最后，为导出前景和基底光谱，进入光谱图例面板，分别点击前景和基底部分的“下载光谱”。在显微镜物镜上滴加一滴蒸馏水。将样品放置在显微镜的平移载物台上，调节样品位置使其与物镜对齐。打开显微镜并启动成像软件。点击工具栏上的显微镜图标。初始化完成后，点击“配置”，在任务面板中选择“活细胞”，介质选择 PBS。接下来，进入成像软件控制面板中的校准标签页。通过分别选择“聚焦”和“表面”来设定物镜和聚光镜的轴向位置。然后点击“扫描模式”，手动调节镜头，确保照明图案居中且几乎静止。选择“正常模式”，调节平移载物台使细胞进入视野并对样品聚焦。调节平移载物台以定位无细胞区域。选择“校准”以在不同照明角度下采集多个二维全息图。调节平移载物台使细胞居中，然后进入“采集”标签页，选择“3D 快照”以获取细胞的断层图像。为可视化全息断层图，在数据导航面板中选择数据，右键点击并选择“打开”。在数据管理面板中，点击“RI 断层图”。在体可视化面板中，选择 RI，并在 RI 画布内绘制四个矩形颜色框。为每个颜色框设置 RI 范围的最小值和最大值，并分别为每个框关联不透明度和颜色。点击“保存”以存储定义的 RI 范围和颜色框。为获得细胞形态的定量描述，使用分析界面。在分割面板中选择“手动”，将 RI 阈值设为 1.3450，然后点击“应用”。点击“保存”以保存计算出的形态学指标。拉曼光谱成像揭示了单个 MDA-MB-231 细胞内胞质、细胞核、苯丙氨酸和脂质的空间分布。在 600 至 1,800 cm⁻¹ 的指纹区，确认了对应于胞质、细胞核、苯丙氨酸和脂质的特征拉曼光谱峰。单细胞的折射率热图揭示了亚细胞组分在轴向 XY 平面、矢状 YZ 平面和冠状 XZ 平面上的内部分布。三维断层重建识别出对应于内部亚结构的体积折射率区域。对单个 MDA-MB-231 细胞的定量形态学测量显示了不同的形态学参数，总体积为 4024.189 立方微米，表面积为 2383.707 平方微米，平均折射率为 1.356。

a-multimodal-imaging-framework-to-advance-phenotyping-living-label

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

推进活体无标记乳腺癌细胞表型分析的多模态成像框架

我们描述了一种用于成像抗肿瘤治疗反应的方法 体内...

小鼠乳腺癌模型中肿瘤微环境对药物反应的活体成像

复杂的组织团块，从器官到肿瘤，均由多种细胞成分构成。我们利用多重荧光标记的转基因小鼠，结合多参数免疫荧光染色及光谱解混技术，解析了组织内不同细胞表型的贡献，从而根据蛋白质表达情况确定细胞来源及其特性。...

荧光组织移植后用于可视化细胞来源、类型及相互作用的定量多光谱分析

我们描述了一种利用表达绿色荧光蛋白和荧光素酶报告基因的慢病毒颗粒对患者来源的异种移植瘤（PDXs）进行稳定标记的方法。该方法可用于追踪PDXs在原发部位的生长情况，并能够通过活体成像检测自发性及实验性转移灶。 体内...

用于肿瘤生长与转移研究的乳腺癌患者来源异种移植瘤的可示踪报告标记

我们开发了一种研究异细胞群体在扰动下动态变化的新方案。本文描述了一个基于成像的平台，可稳健地同时对异细胞群体中多种细胞表型进行定量数据采集和特征分析。...

利用定量成像技术鉴别与表征异质细胞群体

本文所述的活体成像方法利用胶原蛋白的二次谐波生成以及代谢辅因子NAD(P)H的内源性荧光，对未标记的肿瘤微环境进行无创分割，将其划分为肿瘤、间质和血管等区域，从而实现对4D活体成像数据的深入分析。...

一种用于活体成像乳腺肿瘤微环境的无标记分割方法

在癌症免疫治疗时代，人们对阐明肿瘤微环境动态的研究兴趣显著增加。本方案详细介绍了质谱成像技术的染色和成像步骤，可实现高度多重的空间分析。...

利用质谱成像技术分析福尔马林固定石蜡包埋组织样本以拓展对肿瘤微环境的理解

本方案描述了一种用于中高通量类器官药物筛选的半自动化方法，以及一种不依赖显微镜型号的自动化图像分析软件，可用于定量和可视化分析多参数的单个类器官药物反应，以捕捉肿瘤内异质性。...

利用宽场活细胞成像进行大规模及单肿瘤类器官分析的多参数类器官药物筛选

多重条形码成像分析技术最近显著改进了对肿瘤微环境的表征，使得能够全面研究细胞组成、功能状态以及细胞间相互作用。本文中，我们描述了一种染色与成像方案，该方案利用寡核苷酸偶联抗体的条形码技术和循环成像，从而实现高维成像 分析技术的应用。...

用于石蜡组织样本单细胞分析中免疫谱型与空间定位特征的多重条形码图像分析

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

本方案提供了针对基于DNA条形码成像的小鼠FFPE黑色素瘤组织，设计多重免疫荧光抗体组合的逐步操作指南。我们还描述了使用开源工具进行图像分析的流程，以获得关于小鼠黑色素瘤肿瘤免疫微环境的空间蛋白质组学见解。...

基于DNA条形码的多重免疫荧光成像分析基因重编程小鼠黑色素瘤的福尔马林固定石蜡包埋样本

本方案详细介绍了在福尔马林固定石蜡包埋组织切片中进行多重 mRNA...

双模态分子图谱：整合多重mRNA检测与蛋白质成像质谱流式技术

学习使用共聚焦拉曼显微光谱与断层相位显微技术，对人乳腺癌细胞进行活体无标记多模态成像表型分析。该方法提供快速无偏的形态化学信息，适用于癌症研究与再生医学。

一种多模态成像框架推动无标记活体乳腺癌细胞表型分析

探索更多视频