一种多模态成像框架推动无标记活体乳腺癌细胞表型分析

在本实验方案中，我们介绍了利用共聚焦拉曼显微光谱与层析相位显微技术进行多模态成像，以实现对处于天然生理环境中的乳腺癌细胞进行快速且无偏倚的形态化学表型分析。结合拉曼显微光谱与层析相位显微技术，可在生理条件下实现无标记成像，提供细胞的生化与形态学信息，克服了传统扰动性方法（如荧光标记或化学固定）的局限性。我们的结果表明，该多模态方法在乳腺癌细胞形态化学表型分析方面具有很高的应用潜力。此外，其多功能性、可重复性与非侵入性使其成为从基础细胞生物学研究到临床诊断等广泛生物医学应用中极具前景的工具。

我们的目标是创建一个光学生物标志物图谱，用于类器官模型中的无创胚胎质量控制、细胞衰老检测和药物筛选，以推动再生医学和疾病研究的发展。

[讲师] 首先，将 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞样品放入载物台上的培养箱中。为水浸物镜加入水滴。开启自动水浸进水系统，以向物镜提供水源。定期检查水位，防止蒸发，确保在整个测量过程中成像条件稳定。现在，打开泵浦激光器，并调节其输出，使样品平面上的激光功率达到 75 毫瓦。启动 Micro-Manager 显微镜控制软件。在配置设置中，选择明场（BF），然后点击软件窗口左侧的“实时”按钮。选择目标单个细胞后，点击“停止”以结束明场观察。打开 CCD 相机控制软件。在实验设置中，将曝光时间设为 1.5 秒。点击实验工具栏上的“运行”按钮，并打开激光束。接下来，调节 Z 轴位置，以最大化指纹区（600 至 1,800 cm⁻¹）的信号计数，然后关闭激光。点击实验工具栏上的“停止”按钮，并退出软件。使用 MATLAB 脚本启动数据采集过程，该脚本可自动管理多维测量中的拉曼通道并保存数据。将视场设为 50 × 50 微米的正方形，分辨率为 40 × 40 像素，每个像素覆盖 1.25 × 1.25 微米的面积。将每条拉曼光谱的曝光时间设为 1.5 秒，然后运行 MATLAB 脚本。对于拉曼高光谱图的后处理，启动基于网页的 RamApp 工具。通过点击“我的分析”标签页中的“新建”并上传包含空间和光谱数据变量以及 X 轴变量的 .mat 文件，导入高光谱数据。为截取光谱，在“裁剪与旋转”菜单中选择“光谱裁剪”。将拉曼位移区域的下限和上限分别定义为 600 和 1,800 cm⁻¹。为校正宇宙射线干扰，进入“去噪”模块，点击“去尖峰”，选择 Z-score 作为方法，并将阈值设为 8。勾选“使用一阶差分”和“校正尖峰”选项，然后点击“运行”以应用校正。为去除图像中的噪声，点击“平滑图像”，选择中值滤波器，将方形滤波窗口大小设为 3 像素，然后点击“运行”。为平滑每个像素的光谱，选择 Savitzky-Golay 滤波器。将滤波窗口长度设为 7，多项式阶数设为 2，然后点击“运行”。为减去平均背景信号，打开“光学基底去除”功能，点击“识别基底”，选择 k-means 方法并设置为两个聚类，然后点击“高级选项”。选择形态学清洗以去除前景中的小斑点，然后点击“运行”。为去除平均背景信号，点击“去除基底”，选择“全局平均”或“中心 95% 数值的均值”方法，然后点击“运行”。为校正基线荧光，打开基线面板，点击“校正基线”，选择自适应平滑 PLS 方法，将 lambda 设为 500 万，然后点击“运行”。对每幅拉曼高光谱图进行归一化处理时，进入“杂项”模块，选择“归一化”，采用 Frobenius 方法，然后点击“运行”。为生成显示亚细胞分布的伪彩图像，在“图像”面板中，点击“强度图像”下方的打开菜单符号，然后点击“编辑图像”。在编辑面板中，选择“单波段”并定义光谱范围。然后在调色板中选择“双色”，定义颜色、强度阈值和不透明度后点击“确认”。为下载单点光谱，选择感兴趣像素，然后在光谱图例面板中点击“下载光谱”。最后，为导出前景和基底光谱，进入光谱图例面板，分别点击前景和基底部分的“下载光谱”。在显微镜物镜上滴加一滴蒸馏水。将样品放置在显微镜的平移载物台上，调节样品位置使其与物镜对齐。打开显微镜并启动成像软件。点击工具栏上的显微镜图标。初始化完成后，点击“配置”，在任务面板中选择“活细胞”，介质选择 PBS。接下来，进入成像软件控制面板中的校准标签页。通过分别选择“聚焦”和“表面”来设定物镜和聚光镜的轴向位置。然后点击“扫描模式”，手动调节镜头，确保照明图案居中且几乎静止。选择“正常模式”，调节平移载物台使细胞进入视野并对样品聚焦。调节平移载物台以定位无细胞区域。选择“校准”以在不同照明角度下采集多个二维全息图。调节平移载物台使细胞居中，然后进入“采集”标签页，选择“3D 快照”以获取细胞的断层图像。为可视化全息断层图，在数据导航面板中选择数据，右键点击并选择“打开”。在数据管理面板中，点击“RI 断层图”。在体可视化面板中，选择 RI，并在 RI 画布内绘制四个矩形颜色框。为每个颜色框设置 RI 范围的最小值和最大值，并分别为每个框关联不透明度和颜色。点击“保存”以存储定义的 RI 范围和颜色框。为获得细胞形态的定量描述，使用分析界面。在分割面板中选择“手动”，将 RI 阈值设为 1.3450，然后点击“应用”。点击“保存”以保存计算出的形态学指标。拉曼光谱成像揭示了单个 MDA-MB-231 细胞内胞质、细胞核、苯丙氨酸和脂质的空间分布。在 600 至 1,800 cm⁻¹ 的指纹区，确认了对应于胞质、细胞核、苯丙氨酸和脂质的特征拉曼光谱峰。单细胞的折射率热图揭示了亚细胞组分在轴向 XY 平面、矢状 YZ 平面和冠状 XZ 平面上的内部分布。三维断层重建识别出对应于内部亚结构的体积折射率区域。对单个 MDA-MB-231 细胞的定量形态学测量显示了不同的形态学参数，总体积为 4024.189 立方微米，表面积为 2383.707 平方微米，平均折射率为 1.356。