Name: 基于 CRISPR 的穿梭克隆：一种高通量克隆方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: 了解CRISPR穿梭克隆技术，这是一种无需PCR扩增即可实现DNA片段载体间转移的高通量克隆方法。该技术可显著提高基因工程效率，节省时间与资源，适用于多种载体系统。

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本研究得到了中国国家自然科学基金（32071135）和南华大学衡阳医学院附属南华医院启动资金的资助。我们感谢张锋教授惠赠pX330质粒，感谢蔡晓辉博士提供的技术支持。

1. 确定侧翼cDNA/ORF的最优Cas9/sgRNA切割位点
<ol>
	<li>cDNA/ORF 质粒的制备
	<ol>
		<li>从公共数据库获取 cDNA/ORF 克隆。 
		注意：本实验方案使用来自人类 CCSB-Broad 慢病毒表达文库的基于 pLX304 载体的 ORF 克隆8.</li>
		<li>使用质粒小提试剂盒提取质粒，并用分光光度计测定其浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sgRNA 设计
	<ol>
		<li>访问 CHOPCHOP 网站（https://chopchop.cbu.uib.no/）。将 pLX304 载体骨架中位于 ORF 3' 端侧翼的 20–100 bp 区域序列粘贴至目标输入框中。</li>
		<li>选择 黑腹果蝇 作为 物种 并点击 寻找靶位点选择预测效率超过80%的sgRNA候选序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sgRNA 制备
	<ol>
		<li>合成一条正向引物（5′-TAATACGACTCACTATAGG(N)20GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3′）其中（N）20 代表sgRNA靶向序列，以及一条反向引物sgRNA-REV（5′- AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3′）。 
		注意：建议使用PAGE纯化的引物。</li>
		<li>生成sgRNA的DNA模板 体外 通过PCR进行体外转录（IVT）。准备一个100 µL反应体系，包含5 µL模板pX330（Addgene质粒42230；0.1 ng/µL）、5 µL正向引物（10 µM）、5 µL sgRNA-REV引物（10 µM）、50 µL 2x高保真PCR预混液以及35 µL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的超纯水。</li>
		<li>使用以下程序在PCR扩增仪中进行扩增：98 °C 预变性30 s；5个循环：98 °C 变性8 s，52 °C 退火15 s，72 °C 延伸5 s；30个循环：98 °C 变性8 s，72 °C 延伸20 s；最后72 °C 终延伸2 min。</li>
		<li>在0.8%琼脂糖凝胶上分离PCR产物。切下约120 bp的条带，并使用凝胶回收试剂盒进行纯化。</li>
		<li>准备一个10 µL的体外转录（IVT）反应体系，包含300 ng纯化的DNA片段、3.33 µL NTP缓冲液混合物、0.67 µL T7 RNA聚合酶混合物，以及DEPC处理的超纯水。在37 °C孵育4小时。</li>
		<li>通过分光光度法定量未纯化的sgRNA，用DEPC处理的超纯水稀释至20 ng/µL，并分装后于-80 °C保存。 
		注意：无需进行DNase处理，因为残留的DNA不会干扰下游反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sgRNA 评估
	<ol>
		<li>使用限制性内切酶消化含有pLX304载体骨架的cDNA/ORF质粒。通过0.8%琼脂糖凝胶分离所得DNA片段。使用凝胶回收试剂盒纯化DNA底物。</li>
		<li>配制5 µL的Cas9切割反应混合液，其中包含0.2 µL的1.22 µM Cas9 S. pyogenes Cas9，0.5 µL 20 ng/µL sgRNA，0.015 pmol DNA底物，0.5 µL 10x Cas9缓冲液，以及DEPC处理的超纯水。37 °C孵育反应1小时。</li>
		<li>使用0.8%琼脂糖凝胶分离切割产物。以未切割的DNA底物作为阴性对照。</li>
		<li>使用数字成像系统观察切割模式，并选择残留未切割底物最少的sgRNA用于后续实验（图2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 更换目的载体的抗生素抗性基因
注意：在本实验方案中，我们以将目的载体 pBID-UASC 中的氨苄青霉素抗性基因替换为氯霉素抗性基因为例，从而构建携带氯霉素抗性的目的载体 pBIDC-UASC。
<ol>
	<li>从 pBID-UASC 中移除氨苄青霉素抗性基因。 
	注意：通过 Cas9 酶切结合两个 sgRNA（f1Ori5-G4（靶序列：5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3'）和 Amp3-G2（靶序列：5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3'））去除 pBID-UASC 的氨苄青霉素抗性基因，得到长度为 7,687 bp 的线性 pBID-UASC 载体骨架。这两个 sgRNA 分别靶向氨苄青霉素抗性基因的 5' 上游和 3' 下游区域。
	<ol>
		<li>配制 10 µL 切割反应体系，包含 0.03 pmol pBID-UASC、0.25 µL 1.22 µM S. pyogenes Cas9、20 ng f1Ori5-G4、20 ng Amp3-G2、1 µL 10x Cas9 缓冲液以及 DEPC 处理的超纯水。37 °C 孵育 1 小时。 
		注意：Cas9 切割后的质粒无需纯化，可直接用于吉布森组装。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 PCR 扩增氯霉素抗性基因。 
	注意：使用引物 f1Ori5-Cam-F（5'-TTACAATTCACTGGCC 
	GTCGCGTATGTGTATGATACATAAGGTT-3'）和 Amp3-Cam-R（5'-AGTGGAACGAAAACTCAC 
	&#8203;GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3'），从质粒 pMartini-Cam6 中扩增出一段 840 bp 的氯霉素抗性基因。
	<ol>
		<li>通过 PCR 扩增制备氯霉素抗性基因。配制 20 µL PCR 反应体系，包含 2 µL pMartini-Cam（0.1 ng/µL）、1 µL f1Ori5-Cam-F（10 µM）、1 µL Amp3-Cam-R（10 µM）、4 µL 5x 缓冲液、0.4 µL dNTPs（10 mM）、0.4 µL 高保真 DNA 聚合酶（2.5 单位/µL）以及 11.2 µL 超纯水。</li>
		<li>使用以下热循环条件进行 PCR：95 °C 预变性 1 分钟，1 个循环；随后进行 5 个循环：95 °C 变性 15 秒，46 °C 退火 15 秒，72 °C 延伸 20 秒；再进行 30 个循环：95 °C 变性 15 秒，61 °C 退火 15 秒，72 °C 延伸 20 秒；最后 72 °C 延伸 2 分钟，1 个循环。在 PCR 仪中进行反应。</li>
		<li>将酶切产物在 0.8% 琼脂糖凝胶上电泳分离，并使用胶回收试剂盒纯化 840 bp 的 DNA 片段。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将氯霉素抗性基因插入线性化的 pBID-UASC 载体骨架中，获得 pBIDC-UASC。
	<ol>
		<li>进行 2 µL 吉布森组装反应：加入 0.008 pmol 的 840 bp 氯霉素抗性基因、0.002 pmol 线性化 pBID-UASC（步骤 2.1.1 所得产物）以及 1.0 µL 2x 吉布森组装预混液。50 °C 反应 1 小时。</li>
		<li>取 1 µL 连接反应产物转化 10 µL E. coli 感受态细胞。在添加 15 µg/mL 氯霉素的 LB 平板上筛选转化子。</li>
		<li>挑取单克隆菌落进行后续细菌培养及质粒小提。通过限制性酶切分析和 DNA 测序验证携带氯霉素抗性基因的目标载体 pBIDC-UASC。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 构建与CRISPRshuttle兼容的载体
注意：CRISPRshuttle 载体包含约 20-40 bp 的质粒骨架序列，位于目标 DNA 片段的 5' 和 3' 两端两侧，其之间含有一个或两个独特的限制性酶切位点。
<ol>
	<li>使用热循环仪对寡核苷酸进行退火，程序如下：94 °C 预变性 2 分钟；70 个循环，每个循环在 (95-N) °C 下持续 52 秒，其中 N 代表循环编号。 
	注意：退火形成的 CRISPRshuttle 窦道含有与 EcoRI 和 XbaI 互补的 5'-突出末端。</li>
	<li>将退火后的 CRISPRshuttle 窦道连接至经 EcoRI/XbaI 消化的目的载体 pBIDC-UASC，构建出兼容 CRISPRshuttle 的目的载体 pBIDC-UASC-pLXvect。 
	注意：该连接反应会消除多克隆位点中的原始 EcoRI 和 XbaI 酶切位点，从而使 CRISPRshuttle 窦道中间的 EcoRI 和 XhoI 位点在最终载体中成为唯一酶切位点。CRISPRshuttle 窦道中的独特限制性酶切位点可用于线性化兼容 CRISPRshuttle 的目的载体。
	<ol>
		<li>配制 5 µL 连接反应体系，包含 14 ng 经 EcoRI/XbaI 消化的 8,451 bp pBIDC-UASC 载体、0.02 pmol 退火后的 CRISPRshuttle 窦道、0.5 µL 10x T4 DNA 连接酶缓冲液和 0.3 µL T4 DNA 连接酶。于 16 °C 过夜孵育。</li>
		<li>取 1 µL 连接反应产物转化 10 µL 的 E. coli 感受态细胞。在添加 15 µg/mL 氯霉素的 LB 平板上筛选转化子，并于 37 °C 培养过夜。</li>
		<li>挑取单克隆菌落进行后续细菌培养及质粒小提。通过限制性酶切分析和 DNA 测序验证 CRISPRshuttle 兼容目的载体 pBIDC-UASC-pLXvect。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用 CRISPRshuttle 生成 UAS-cDNA/ORF 质粒
注意：CRISPRshuttle 实验方案在细菌转化之前，需平行进行两步试管反应（图1）。
<ol>
	<li>试管反应步骤 1
	<ol>
		<li>使用 Cas9 与两种 sgRNA（pLX304-CMV-G16（靶序列：5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3'，位于 pLX304 载体骨架中 ORF 5'端侧翼区）和 pLX304-3'-G1（靶序列：5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3'，位于 pLX304 载体骨架中 ORF 3'端侧翼区））共同作用，从 pLX304-ORF 质粒中切除 ORF。
		<ol>
			<li>按如下方式配制用于指定数量（N）消化反应的主混合液：(N+1) × 0.4 µL 的 1.22 µM S. pyogenes Cas9，(N+1) × 0.5 µL 的 80 ng/µL pLX304-CMV-G1，(N+1) × 0.5 µL 的 80 ng/µL pLX304-3'-G1，(N+1) × 0.4 µL 的 10× Cas9 缓冲液，以及 (N+1) × 1.45 µL 的 DEPC 处理超纯水。</li>
			<li>充分混匀后离心收集主混合液。每管分装 3.75 µL 主混合液，再向每管加入 0.75 µL 的 0.03 µM pLX304-ORF 质粒。充分混匀后，在 37 °C 下孵育反应 1 小时。 
			注：使用 DEPC 处理的超纯水将每种 pLX304-ORF 质粒稀释至 0.03 µM 浓度。若浓度低于 0.03 µM，可直接向反应体系中添加质粒 DNA。Cas9 切割后的质粒无需在切割反应后进行纯化，可直接用于后续的 Gibson 组装。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>试管反应步骤 2
	<ol>
		<li>通过 Gibson 组装将切除的 ORF 插入与 CRISPRshuttle 兼容的目的载体 pBIDC-UASC-pLXvect 中，获得 UAS-cDNA/ORF 质粒。
		<ol>
			<li>用 EcoRI 和 XbaI 酶切 pBIDC-UASC-pLXvect。通过琼脂糖凝胶电泳分离线性化的 pBIDC-UASC-pLXvect，并使用凝胶回收试剂盒进行纯化。</li>
			<li>按如下方式配制用于指定数量（N）Gibson 组装反应的主混合液：(N+1) × 0.14 µL 的 3.36 µM 线性化 pBIDC-UASC-pLXvect，以及 (N+1) × 1.8 µL 的 Gibson 组装主混合液。</li>
			<li>充分混匀后离心收集主混合液。每管分装 1.94 µL 主混合液，再向每管加入 1.66 µL Cas9 切割后的质粒。充分混匀后，在 50 °C 下孵育反应 1 小时。 
			注：在 50 °C 孵育前，应将主混合液和反应管保持在冰上。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 Gibson 组装产物转化至 E. coli 中。 
	注：Gibson 组装产物在用于 E. coli 转化前无需纯化。
	<ol>
		<li>将感受态细菌细胞在冰上解冻。每支预冷的 1.5 mL 离心管中分装 10 µL 细胞。 
		注：建议使用转化效率至少为 1 × 108 CFU/µg pUC19 DNA 的细菌感受态细胞。</li>
		<li>轻柔混匀 10 µL 感受态细胞与 1 µL Gibson 组装产物，置于冰上 30 分钟。</li>
		<li>42 °C 热激 1 分钟，随后立即置于冰上冷却 2 分钟。</li>
		<li>向每管加入 100 µL 预热的 SOC 培养基（37 °C），在 37 °C 下以 250 rpm 振荡培养 1 小时。</li>
		<li>将细胞涂布于含 15 µg/mL 氯霉素的 LB 平板上，37 °C 过夜培养。 
		注：大规模进行这些操作通常需要数小时。除非另有说明，应始终将试剂和反应体系保持在冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>UAS-cDNA/ORF 质粒的验证。
	<ol>
		<li>挑取单克隆接种于含 15 µg/mL 氯霉素的 4.5 mL LB 培养基中，37 °C、250 rpm 振荡过夜培养。</li>
		<li>使用质粒小提试剂盒提取质粒 DNA。</li>
		<li>为每个质粒配制 20 µL 限制性酶切反应体系，包含 300–500 ng 质粒 DNA、0.3 µL PvuII、2 µL 10× 缓冲液及超纯水。在 37 °C 下反应 1 小时。</li>
		<li>通过 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段，在紫外光下成像（图 3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

CRISPRshuttle 实验方案中的一个关键步骤是制备线性化的、与 CRISPRshuttle 兼容的载体。为确保完全酶切，应使用过量的限制性内切酶对载体进行消化，并强烈建议对消化后的载体进行凝胶纯化。另一个关键步骤是使用 Cas9 对 cDNA/ORF 质粒进行消化。如果质粒构建失败，可利用琼脂糖凝胶电泳检测是否已有部分 cDNA/ORF 从供体质粒中释放出来。或者，在进行 Gibson 组装前，可通过电泳检测所有质粒的消化情况。只要部分 cDNA/ORF 能够被释放，CRISPRshuttle 通常即可有效发挥作用。如果 cDNA/ORF 几乎无法从供体质粒中释放，则需重新提取质粒。
我们比较了CRISPRshuttle与广泛使用的高通量克隆系统Gateway在构建UAS-cDNA/ORF质粒文库方面的性能，该文库来源于人类CCSB-Broad慢病毒表达文库中已克隆于pLX304载体的ORF。Gateway系统包含两个连续步骤1。首先，通过BP反应构建入门载体，此过程需要针对每个ORF进行定制化操作，包括引物设计与合成、PCR...

利用现有资源构建全基因组质粒文库是采用功能基因组学解析生物学过程的基础和前提。目前的高通量克隆方法，包括Gateway、In-Fusion、Creator和Univector克隆系统，均需要对目标DNA片段进行PCR扩增1,2,3,4,5。这一前提条件涉及针对特定片段的处理流程，包含多项标准化操作，如寡核苷酸引物设计、凝胶纯化以及通过测序进行序列验证等。因此，构建全基因组质粒文库（例如cDNA/ORF过表达文库）已变得费力且耗时，阻碍了功能基因组学的发展。
此前，我们开发了CRISPRmass，这是一种高通量克隆方法，旨在将特定DNA片段（例如UAS模块）整合到多个具有相同载体骨架的质粒中6利用CRISPRmass技术，我们构建了5,500多个基于GAL4/UAS系统的UAS-cDNA/ORF质粒 果蝇 cDNA/ORF文库，该 黑腹果蝇 基因组资源中心（DGRC）黄金文库6然而，CRISPRmass 缺乏在载体之间转移 DNA 片段的能力，限制了其在高通量克隆中的应用。
为解决这些局限性，我们开发了基于CRISPR的穿梭克隆技术（CRISPRshuttle），这是一种新型高通量方法，可将多个目标DNA片段从供体质粒高效转移至目的载体7。该过程仅需两个连续的试管反应，从而避免了对各个特定DNA片段进行单独操作的需要7。
CRISPRshuttle 实验方案包含两个连续的试管内反应（图1）。首先，利用 Cas9/sgRNA 切割供体质粒中共有的载体骨架序列，从而释放目标 DNA 片段。随后，这些片段通过 Gibson 组装连接至 CRISPRshuttle 载体的 CRISPRshuttle 盒中，以生成最终的质粒。CRISPRshuttle 盒包含一段约 20–40 bp 的载体骨架序列，该序列位于来自供体质粒的 DNA 片段的 5' 和 3' 两端侧翼区域，并在这些侧翼序列之间含有一种或两种独特的限制性内切酶识别位点。CRISPRshuttle 兼容载体是通过将 CRISPRshuttle 盒插入目的载体中构建而成，随后通过消化盒内的限制性酶切位点使该载体线性化。目的载体必须携带与供体质粒中不同的抗生素抗性基因；若相同，则必须在使用前将其抗性基因替换为不同的抗性基因。
本文介绍了一种利用CRISPRshuttle构建UAS-cDNA/ORF质粒文库的详细实验方案。该过程包括将人源ORF从CCSB-Broad慢病毒表达文库转移至目标载体中 黑腹果蝇 转基因载体 pBID-UASC8,9CRISPRshuttle 简化了全基因组质粒文库的构建，从而促进了功能基因组学研究。

<table><tbody><tr><td>琼脂粉</td><td>Chembase</td><td>KBS-001H</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sangon</td><td>A600014-0100</td><td></td></tr><tr><td>全自动数字凝胶图像分析系统</td><td>Tanon</td><td>Tanon-2500B</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sangon</td><td>A100230-0010</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. 凝胶回收试剂盒</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. 质粒DNA小提试剂盒 I</td><td>Omega</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 快速高效RNA合成试剂盒</td><td>NEB</td><td>E2050</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621X</td><td></td></tr><tr><td>PCR扩增仪</td><td>LongGene</td><td>T20</td><td></td></tr><tr><td>Platinum SuperFi II DNA聚合酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S. pyogenes&lt;/em&gt; Cas9</td><td>GenScript</td><td>Z03386</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>Zhichu</td><td>ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Shimadzu</td><td>BioSpec-nano</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trans &lt;/em&gt;10 化学感受态细胞</td><td>TransGen</td><td>CD101-02</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

基于crispr的穿梭克隆：一种高通量克隆方法

CRISPR-based Shuttle Cloning: A High-throughput Cloning Method

利用现有的基因组文库构建全基因组范围的质粒文库，是系统性功能表征多种生物学过程中基因的关键前提。然而，目前用于质粒间DNA片段转移的高通量方法通常需要在克隆前对目标序列进行PCR扩增，使得全基因组规模质粒文库的构建在技术上具有挑战性且耗时较长。通过使用CRISPRshuttle盒，我们开发了一种新的高通量克隆方法——基于CRISPR的穿梭克隆（CRISPRshuttle克隆），该方法能够在无需对DNA片段进行PCR扩增的情况下，将多个具有相同骨架序列的供体质粒中的DNA片段转移到CRISPRshuttle兼容载体中。本文中，我们提供了一套CRISPRshuttle的操作方案。该方案在细菌转化前包含两个连续的试管反应步骤：首先，通过Cas9介导的切割，从供体质粒中共有的载体骨架序列上切除目标DNA片段；其次，通过Gibson组装将切除的DNA片段插入线性化的CRISPRshuttle兼容载体中。实验结果表明，CRISPRshuttle的克隆效率超过94%，两名研究人员可在7天内利用该方法构建约300个质粒。CRISPRshuttle实现了载体间高效、灵活且低成本的DNA片段转移，显著简化了全基因组质粒文库的构建流程。

我们利用CRISPRshuttle构建了一个覆盖1,397个在Drosophila中保守的人类基因的UAS-cDNA/ORF质粒文库7。限制性酶切分析显示，CRISPRshuttle在使用含有两个重复序列的CRISPRshuttle兼容性目的载体时效率达到94.5%，在使用不含重复序列的目的载体时效率为96.1%7。我们的数据表明，通常情况下，两名研究人员可在7天内通过CRISPRshuttle构建约300个质粒7。通过诊断性限制性酶切验证了CRISPRshuttle介导的cDNA/ORF片段转移的成功率。酶切反应产生CRISPRshuttle兼容性目的载体（pBIDC-UASC-pLXvect）骨架特异性片段（PvuII酶切产生1,072 bp和1,820 bp片段）的结果被视为阳性（图3）。这些经验证的UAS-cDNA/ORF构建体随后进行了全面的限制性酶切图谱分析，以确认质粒的完整性。限制性酶切分析的代表性结果如...

我们介绍一种高通量克隆方法——基于CRISPR的穿梭克隆（CRISPRshuttle cloning）的实验方案，该方法能够在无需对目标DNA片段进行PCR扩增的情况下，实现DNA片段在不同载体之间的转移。

基于CRISPR的穿梭克隆：一种高通量克隆方法

利用现有基因组资源库构建全基因组范围的质粒文库，是开展系统性功能研究的关键前提……

我们描述了高通量克隆方法CRISPRshuttle的方案。这涉及在载体之间转移目标 DNA 片段，而无需对 DNA 片段进行 PCR 扩增。现有技术，如门户输注和单载体克隆 PCR 扩增。这种方法需要特定片段的程序，包括初级设计和分泌验证。这些标签是劳动密集型且耗时的。CRISPR 穿梭消除了 PCR，同时将载体之间的目标 DNA 片段转移到连续的试管反应中。该方法超越了对特定片段处理的需求，从而加快了样品的构建。[旁白]首先，通过组合屏幕上显示的试剂，为给定数量的消化反应制备预混液。将正确标记的 0.2 毫升管放在冰上的铝制冷却块中。通过混合适量的 CAS9、sgRNA、10、CAS9 缓冲液和 DEPC 处理水，制备用于 N 次反应的预混液。将预混液彻底混合并旋转。将 3.75 微升预混液等分到每个反应管中。将 0.75 微升 0.03 微摩尔 PLX 304 ORF 质粒加入每个彻底混合的试管中，并将试管在 37 摄氏度下孵育一小时。通过混合 0.14 微升 3.36 微摩尔线性化 pBIDC-UASC-pLXvect 和 1.8 微升 Gibson 组装预混液来制备预混液。将预混液彻底混合并旋转。现在将 1.94 微升预混液等分到每个试管中。将 1.66 微升 CAS9 切割质粒加入每个试管中。充分混合并在 50 摄氏度下孵育一小时。在冰上解冻细菌感受态细胞。将 10 微升解冻的细胞等分到每个预冷的 1.5 毫升管中。轻轻地将 10 微升感受态细胞与 1 微升 Gibson 组装产物混合。将试管放在冰上 30 分钟。在 42 摄氏度下对试管进行热电击一分钟，然后在冰上冷却两分钟。将 100 微升预热的 SOC 培养基加入每个试管中，并在 37 摄氏度下以 250 RPM 摇动一小时。最后，将细胞置于含有每毫升氯霉素15微克的LB琼脂平板上，并在37摄氏度下孵育过夜。该图显示了使用 CRISPRshuttle 系统生成的 UAS-cDNA/ORF 质粒限制性分析的代表性结果。在该分析中，对 15 个 UAS-cDNA/ORF 构建体的 PVU2 限制性酶切表明，所有样品在大约 1072 个碱基对和 1,820 个碱基对处表现出预期的片段模式。

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基于 CRISPR 的穿梭克隆：一种高通量克隆方法

基因靶向技术可用于产生带有基因敲除、基因敲入和标记等位基因的转基因小鼠。本文中，我们描述了一种在大肠杆菌（E.

亚克隆加插入（SPI）——一种用于快速构建基因靶向载体的新型重组工程方法

利用DNA组装技术，可在一次克隆反应中并行构建多个CRISPR载体，从而使大量CRISPR载体的构建变得简单。番茄毛状根是验证CRISPR载体和创制突变体材料的优良模型系统。...

高通量CRISPR载体构建及通过番茄毛状根生成对DNA修饰的表征

本文所述的基因分型技术将荧光聚合酶链式反应（PCR）与毛细管凝胶电泳相结合，可实现对核酸酶介导的基因敲除克隆进行高通量基因分型。该方法克服了其他基因分型技术所面临的局限性，且比测序方法更具成本效益。...

使用荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型CRISPR/Cas9介导的敲除突变体

本方案描述了将多个单导向RNA克隆到一个导向RNA串联载体中的步骤，该方法特别适用于利用CRISPR/Cas9技术创建多基因敲除。文中以肠道类器官中双基因敲除的构建为例，展示了该方法的一种可能应用。...

利用CRISPR串联体在小鼠小肠类器官中进行多基因敲除的实验方案

本文概述了一种简单、高效且经济的sgRNA克隆方法。...

用于哺乳动物系统的CRISPR向导RNA克隆

本文描述了一种基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）CRISPR-Cas9...

基于CRISPR-Cas9的竞争性筛选实验探究基因依赖性

本方案描述了使用声波液滴喷射技术在384孔板中对哺乳动物细胞进行高通量质粒转染的方法。耗时且易出错的DNA分配与多重化操作，以及转染试剂的分配，均由软件驱动并通过纳升级分液设备完成。随后将细胞接种至这些预先加样好的孔中。...

利用声波纳米点样技术进行高通量DNA质粒多重化与转染

本方案提供了一种利用CRISPR-CAS9在人类多能干细胞中实现特定杂合或纯合核苷酸改变的方法。...

利用CRISPR-Cas9在人类多能干细胞中产生特定基因组修饰

基于CRISPR-Cas系统与抗CRISPR蛋白的基因数字电路

我们介绍一种基于CRISPR的模块化组装（CRISPRmass）方案，该方法利用公开可获得的cDNA/ORF资源，在黑腹果蝇（Drosophila）中高通量构建UAS-cDNA/ORF质粒文库。CRISPRmass可应用于多种质粒文库的编辑。...

基于CRISPR的模块化组装法用于高通量构建UAS-cDNA/ORF质粒文库

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

了解CRISPR穿梭克隆技术，这是一种无需PCR扩增即可实现DNA片段载体间转移的高通量克隆方法。该技术可显著提高基因工程效率，节省时间与资源，适用于多种载体系统。

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