Name: 病毒学中的扫描透射电子显微镜断层扫描：高压冷冻、冷冻替代样品的 3D 成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学习使用高压冷冻和冷冻替代技术进行病毒学扫描透射电子显微镜断层扫描三维成像方法。该方案可全面观察病毒感染细胞的超微结构变化，为病毒学和癌症治疗研究提供新见解。

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本出版物属于全球发展技术战略的一部分，并得到勃林格殷格翰开发CMC生物部门全球技术管理的支持。感谢Renate Kunz和Jana Apolloni在样品制备方面提供的出色技术支持和有益讨论。感谢Reinhard Weih在技术问题和设备维护方面提供的出色协助。感谢Torsten Friedrich在显微镜搭建过程中提供的有益讨论和帮助。Clarissa Read、Julia LaRoche和Jan Münch的工作获得了德国研究基金会（SFB1279）合作研究中心项目的资助。

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<li>Walther, P., Schmid, E., Höhn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+imaging+techniques%2C+methods+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell imaging techniques, methods and protocols.</a> Methods Mol Biol. 931, 525-535 (2012).</li>
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<li>Sosinsky, G. E., Crum, J., Jones, Y. Z., Lanman, J., Smarr, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+chemical+fixation+procedures+with+high-pressure+freezing+and+freeze+substitution+preserves+highly+labile+tissue+ultrastructure+for+electron+tomography+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The combination of chemical fixation procedures with high-pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications.</a> J Struct Biol. 161 (3), 359-371 (2008).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Rauch-Wirth, L., Schuetz, D., Groß, R., Rode, S., Glocker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+enhancing+EF-C+peptide+nanofibrils+are+endocytosed+by+macropinocytosis+and+subsequently+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Transduction enhancing EF-C peptide nanofibrils are endocytosed by macropinocytosis and subsequently degraded.</a> Biomaterials. , 317(2025).</li>
<li>Tonnemacher, S., Folly-Klan, M., Gazi, A. D., Schaefer, S., Pénard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+H7-protein+is+required+for+the+organization+of+the+viral+scaffold+protein+into+hexamers%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus H7-protein is required for the organization of the viral scaffold protein into hexamers.</a> Sci Rep. 12 (1), 13007(2022).</li>
<li>Villinger, C., Gregorius, H., Kranz, C., Hoehn, K., Münzberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIB%2FSEM+tomography+with+TEM-like+resolution+for+3D+imaging+of+high-pressure+frozen+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FIB/SEM tomography with TEM-like resolution for 3D imaging of high-pressure frozen cells.</a> Histochem Cell Biol. 138 (4), 549-556 (2012).</li>
<li>Hackstadt, T., Chiramel, A. I., Hoyt, F. H., Williamson, B. N., Dooley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+Golgi+apparatus+and+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+the+SARS-CoV-2+replication+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Disruption of the Golgi apparatus and contribution of the endoplasmic reticulum to the SARS-CoV-2 replication complex.</a> Viruses. 13 (9), 1798(2021).</li>
<li>Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+scanning+electron+microscopy+%28S3EM%29+on+silicon+wafers+for+ultra-structural+volume+imaging+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues.</a> PLoS ONE. 7 (4), e35172(2012).</li>
<li>Lewczuk, B., Szyryńska, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-emission+scanning+electron+microscope+as+a+tool+for+large-area+and+large-volume+ultrastructural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Field-emission scanning electron microscope as a tool for large-area and large-volume ultrastructural studies.</a> Animals. 11 (12), 3390(2021).</li>
<li>Höög, J. L., Schwartz, C., Noon, A. T., O'Toole, E. T., Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+interphase+microtubules+in+fission+yeast+analyzed+by+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography.</a> Dev Cell. 12 (3), 349-361 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Lin, H., Fu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mitochondrial+ultrastructure+of+Drosophila+indirect+flight+muscle+revealed+by+serial-section+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3D mitochondrial ultrastructure of Drosophila indirect flight muscle revealed by serial-section electron tomography.</a> J Vis Exp. (130), e56567(2017).</li>
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<li>Welsch, S., Miller, S., Romero-Brey, I., Merz, A., Bleck, C. K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+three-dimensional+architecture+of+the+dengue+virus+replication+and+assembly+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites.</a> Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).</li>
<li>Cortese, M., Goellner, S., Acosta, E. G., Neufeldt, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+characterization+of+Zika+virus+replication+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural characterization of Zika virus replication factories.</a> Cell Rep. 18 (9), 2113-2123 (2017).</li>
<li>Milrot, E., Lazar, S., Schuster, O., Makdasi, E., Schmaya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+infection+cycle+of+VSV-%CE%94G-spike+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Insights from the infection cycle of VSV-ΔG-spike virus.</a> Viruses. 14 (12), 2828(2022).</li>
<li>Schauflinger, M., Bergner, T., Neusser, G., Kranz, C., Read, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+permanganate+is+an+excellent+alternative+to+osmium+tetroxide+in+freeze-substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Potassium permanganate is an excellent alternative to osmium tetroxide in freeze-substitution.</a> Histochem Cell Biol. 157 (4), 481-489 (2022).</li>
</ol>

JGW、RH、EP、JSR 和 MD 是勃林格殷格翰制药有限公司（Boehringer Ingelheim Pharma GmbH &amp;#38; Co.KG）的员工，该公司是一家致力于开发和生产病毒类产品的制药企业。上述情况未影响本文的设计，因此我们声明不存在利益冲突。

扫描透射电子显微镜断层扫描（STEM断层扫描）的分辨率可与透射电子显微镜断层扫描（TEM断层扫描）相媲美，同时能够检测厚度达1 µm的样品体积。因此，我们认为该技术非常适合用于成像病毒诱导的细胞内结构变化，例如膜重塑4,6,25、病毒粒子出芽7或内吞作用5。根据具体的研究问题，也可考虑其他体积电子显微技术（VolumeEM）。若需要在相近分辨率下获得更大的视场，我们推荐使用聚焦离子束-扫描电子显微镜断层扫描（FIB-SEM断层扫描）。当对相似体积和分辨率的样品进行成像时，FIB-SEM断层扫描的速度通常慢于STEM断层扫描，因为随着分辨率的提高，成像时间会相应增加。通常情况下，这一问题通过减小成像视场来补偿。此外，使用离子束铣削实现6.8 nm的z轴分辨率（图6）在技术上具有挑战性。因此，FIB-SEM更适合对整个细胞和组织等较大结构进行成像9,10,26,27，尽管其（各向同性）像素尺寸通常为几十纳米。此外，FIB-SEM断层图像不存在典型的由倾斜系列图像重建所产生的“缺失楔形”（&#34;missing wedge&#34;）效应。而且，随着等离子体FIB设备的发展，目前已有更快且仍能实现精确铣削的新技术被引入该领域。
如果z轴方向的高分辨率并非关键，透射电子显微镜（TEM）或扫描电子显微镜（SEM）对连续切片进行成像可作为一种替代方法，能够在短时间内实现对极大视野的观察28,29，但通常具有各向异性的分辨率。在TEM断层成像中，可将来自连续厚切片的不同断层图组合起来30,31。STEM断层成像同样可以实现这一操作；然而，鉴于可检测切片的厚度，通常无需合并多个断层图。在病毒学领域，TEM断层成像常用于表征病毒诱导的膜结构重塑32,33,34,35。尽管TEM断层成像本身已能为病毒复制周期提供重要信息，但大多数应用场景将更受益于STEM断层成像对更厚样本体积的成像能力。这一点对于具有各向异性形态的病毒颗粒尤为明显，例如弹状病毒科（rhabdoviridae），在单个TEM断层图中往往只能捕获少数完整的病毒颗粒35&#160;，或在大小相当于人巨细胞病毒（HCMV）胞质病毒组装复合体（cVAC）的复制区室内对多个包膜病毒颗粒进行成像4。
在低温条件下进行扫描透射电子显微镜（STEM）断层成像可提供进一步的功能信息19，且已有视频方案可供参考20。我们的方案在样品制备流程上有所不同，该流程并非保持样品的天然状态，而是实现接近天然的超微结构保存。尽管对高压冷冻后冷冻置换样品进行的STEM断层成像无法达到低温电镜所实现的超微结构保存水平和原子级分辨率，但其具有设备更简单、样品更稳定以及通量更高的优势。
以下步骤对于该方法的成功至关重要：&#160;
首先，应明确成像实验的目标。由于该技术劳动密集，需要事先制定周密的实验计划，并明确成像目的。应在开展本实验前，通过其他较易操作的方法，获得有关模型系统（包括细胞系和病毒）的详细知识。因此，我们建议在基于光学显微镜的预实验中优化感染效率，并根据具体生物系统调整实验条件。优化参数包括细胞数量、感染复数（MOI）以及依据病毒种类和待观察事件确定的观察时间点。这将确保样本中含有较高比例的可评估细胞。
第二，高质量的样品制备。我们强调样品制备质量的重要性。目前，我们认为对于细胞等厚样品而言，高压冷冻实现的玻璃化是金标准。冷冻置换、包埋以及随后在室温下成像，当与扫描透射电子显微断层成像（STEM tomography）结合时，是一种获得高质量结果的可靠方法。因此，建立稳定的样品制备常规流程至关重要。为此，我们希望重点推荐有关高压冷冻的文献14,21。若需使用毒性较低的冷冻置换溶液，我们建议采用高锰酸钾替代四氧化锇，具体方法如 Schauflinger 等人所述36。
最后，应根据扫描透射电子显微镜（STEM）的用户说明书，建立一个运行顺畅的倾斜系列图像采集工作流程，该流程需基于良好对准的显微镜，并且会因不同显微镜而有所差异。建立顺畅的工作流程还取决于扫描发生器和图像采集软件。

<img alt="比较显微镜设置中分辨率、仪器和操作难度的冷冻STEM断层成像示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68568/68568fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1774324804000" data-alt="图1"> 
图1：不同三维显微技术的比较，考虑了分辨率、仪器、采集时间和操作难度。 这些技术可实现的最大可行体积介于技术要求较高的冷冻透射电子显微断层成像（可达到分子分辨率）与光学显微成像（其分辨率受限于光的衍射极限）之间。缩写：TEM = 透射电子显微镜；STEM = 扫描透射电子显微镜；SEM = 扫描电子显微镜；FIB = 聚焦离子束。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68568/68568fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
与病毒相关的结构和系统所涉及的尺度范围从亚埃级别（例如用于病毒治疗的小分子、分离的病毒蛋白）到数米级别（例如完整的感染生物体）。病毒颗粒的尺寸范围为20–1,000 nm，通常在其生物学背景下进行研究，例如宿主细胞和病毒生产细胞系，这些细胞的尺寸在微米（µm）量级。因此，对特定病毒相关结构的可视化依赖于选择能够提供足够视场和适当分辨率的技术。对病毒感染细胞和组织样本的研究主要依赖显微镜技术（图1）。虽然细胞和组织的概览图像可通过传统的光学显微镜获取，但参与病毒复制的细胞内结构通常采用电子显微镜（EM）进行研究。尽管目前电子显微镜主要用于基础病毒学研究，但它也应用于临床诊断1,2，并在生物制药领域得到了应用3。
通常，经典的透射电子显微镜（TEM）等二维电子显微镜（2D EM）方法无法充分回答特定的生物学问题。在病毒学研究中，当涉及病毒与宿主细胞相互作用的研究时尤其如此，例如病毒粒子的吸附与入侵、病毒工厂的形成或病毒粒子的形态发生4,5,6,7,8,9。因此，电子显微镜断层扫描技术（EM tomography）被用于分析生物样本的三维超微结构。原则上，获取某一特定样本断层图像的方法有两种：1）对连续切片进行逐步成像，随后将图像组合成三维图像序列；或 2）从样本的不同视角获取投影图像，再通过计算方法将这些信息重建为虚拟的三维图像序列。
第一类技术包括通过透射电子显微镜（TEM）或扫描电子显微镜（SEM）对连续切片进行成像（SEM阵列断层成像）、连续块面SEM以及聚焦离子束（FIB）-SEM断层成像。连续切片的SEM和TEM成像在Z轴方向上的分辨率较低，受限于切片厚度，但其具有较大的视场，并依赖于大多数电镜实验室中普遍配备的设备4。FIB-SEM断层成像可实现各向同性的分辨率，但仪器及维护成本较高，且以各向同性分辨率对整个细胞进行成像耗时较长9,10。
第二种断层扫描技术完全依赖于电子束穿过样品的透射。该技术可通过两种不同的成像模式实现：透射电子显微镜（TEM）或扫描透射电子显微镜（STEM）。尽管TEM断层扫描应用更为广泛且易于实施，但其切片厚度受限于约200 nm。因此，对于线粒体、囊泡或病毒颗粒等尺寸超过切片厚度的结构，无法在一个单一的断层图像中完整成像。STEM断层扫描则能够对厚度达1 µm的样品进行成像11,12。然而，该技术需要配备高加速电压（≥200 kV）的STEM，以及支持高倾转角度和小半收敛角的装置13。尽管STEM成像在材料科学中是一种常用技术，但在生物电子显微镜实验室中仍属罕见。
本文介绍了一种以应用为导向的方法，利用扫描透射电子显微（STEM）断层成像技术对病毒学样品进行研究。由于电子显微断层成像技术具有高度复杂性和劳动密集型特点，高质量的样品制备至关重要。尽管低温透射电镜（冷冻电镜断层成像）无疑是分子水平研究的金标准，但在室温下对高压冷冻并经冷冻置换的细胞进行成像，仍能良好地保存并清晰显示细胞的超微结构7,14。简言之，将贴壁细胞培养于蓝宝石圆片上，并按实验需求进行感染或其他处理。随后通过高压快速冷冻使细胞固定，实现细胞内水分的玻璃化。接着在保持样品对比度的同时，将水分逐步替换为溶剂，并缓慢恢复至室温。最后将样品逐步包埋于树脂中。
高压冷冻和冷冻置换的实验方案有多种，这些方案在设备、载体系统以及样品组成上有所不同。已有多个关于高压冷冻的详细实验方案发表，其中包括Walther等人15发表的方案，以及Steyer等人16发布的视频方案，后者重点介绍利用微波辅助增强对比度进行FIB-SEM组织制备的方法。在病毒学研究方面，Read等人17和Romero-Brey18发表了利用蓝宝石盘进行病毒感染细胞高压冷冻制备，并随后通过电子断层扫描技术进行分析的详细实验方案。超薄切片技术也已有先前文献描述15,17。有关这些方法的更多细节，请参考所引用的文献。
本文介绍的工作流程是在先前发表的方案15,17基础上进行改进和更新的版本，并首次配以详细的视频指南。该方案提供了利用高压冷冻、冷冻置换以及环氧树脂包埋进行样品制备的工作流程。使用超薄切片机切割厚度为800 nm–1,000 nm的切片。利用200 kV扫描透射电子显微镜（STEM），结合EM tools软件采集倾转系列图像。本方案针对贴壁细胞进行了优化，提供了完整的工作流程，同时允许针对其他类型的样品（如组织或悬浮细胞）进行适当调整。如需进行低温条件下的STEM断层成像，请参考Michael Elbaum研究团队的工作19,20。

<table><tbody><tr><td>1-十六碳烯</td><td>默克股份公司</td><td>8220640500</td><td></td></tr><tr><td>200 目带平行条纹的铜网</td><td>Plano GmbH</td><td>G2014C</td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 干燥室</td><td>Binder GmbH</td><td>9010-0323</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>VWR国际有限公司</td><td>20066330</td><td></td></tr><tr><td>DDSA</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>金刚石刀</td><td>Diatome Ltd</td><td>https://www.diatomeknives.com/ultra-35</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Embed-812树脂</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>电子显微镜工具</td><td>TVIPS GmbH</td><td>TVIPS 软件：EM-Tools；https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 100%</td><td>默克股份公司</td><td>1.00983.2511</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>VWR international GmbH</td><td>516-0812</td><td></td></tr><tr><td>11 mL 带旋盖玻璃瓶</td><td>VWR国际有限公司</td><td>548-0625</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15830-25</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM AFS2 冻干置换仪</td><td>Leica Microsystems GmbH</td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/</td><td></td></tr><tr><td>Glod Sol 25 nm</td><td>AURION 免疫金试剂 &amp;和配件</td><td>425.011</td><td></td></tr><tr><td>金针孔 &amp;oslash; 2000 &amp;mu;m</td><td>Science Services GmbH</td><td>GA2000-Au</td><td></td></tr><tr><td>铜质字母网格板</td><td>Plano GmbH</td><td>NH6C</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>MEDAX GmbH &amp;amp; Co. KG</td><td>12501</td><td></td></tr><tr><td>高真空蒸发系统 BAF 300</td><td>BAL-TEC AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压冷冻仪 Wohlwend HPF Compact 01</td><td>工程办公室 M. Wohlwend GmbH</td><td>https://www.wohlwend-hpf.ch/index.html</td><td></td></tr><tr><td>液氮罐</td><td>H.Erben GmbH</td><td>94500</td><td></td></tr><tr><td>氮气（液体）</td><td>VWR国际有限公司</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>NMA</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>ChemPur 高纯化学品与科研用品有限公司</td><td>006051</td><td></td></tr><tr><td>120 烤箱 &amp;deg;C</td><td>Binder GmbH</td><td>9010-0194</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easi-Glow</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>91000</td><td></td></tr><tr><td>0.1% w/v 聚-L-赖氨酸水溶液</td><td>泰德·佩拉公司</td><td>18026</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock 离心管 0.5 mL</td><td>Eppendorf SE</td><td>0030 121.023</td><td></td></tr><tr><td>样品容器（Beem胶囊）</td><td>Plano GmbH</td><td>G360-1</td><td></td></tr><tr><td>蓝宝石圆盘，直径 3 x 0.16 mm</td><td>工程办公室 M. Wohlwend GmbH</td><td>500</td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机 Leica EM UC7</td><td>徕卡显微系统有限公司</td><td>https://www.leica-microsystems.com/de/produkte/em-probenvorbereitung/p/leica-em-uc7/</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Riedel de Ha&amp;euml;n AG</td><td>31697</td><td></td></tr><tr><td>紫外光室</td><td>Dinies</td><td>ELG100S</td><td></td></tr></tbody></table>

病毒学中的扫描透射电子显微镜断层成像：高压冷冻-冷冻置换样品的三维成像

Scanning Transmission Electron Microscopy Tomography in Virology: 3D Imaging of High-pressure Frozen, Freeze-substituted Samples

电子显微镜（EM）尤其是三维（3D）EM技术，已成为结构病毒学中的成熟方法。研究病毒引起细胞超微结构的改变，例如寨卡病毒（ZIKV）诱导的复制工厂或冠状病毒的复制细胞器，需要进行三维成像。尽管透射电子显微镜（TEM）断层扫描是一种广泛应用的方法，但其仅限于厚度不超过200 nm的样品。聚焦离子束-扫描电子显微镜（SEM）断层扫描能够以各向同性的方式获取更大体积的三维数据，尽管其分辨率通常较低。其他技术，如块面-扫描电子显微镜（BF-SEM）、SEM阵列断层扫描或连续超薄切片的TEM成像，也可用于大体积样本的成像。然而，与前述技术相比，这些方法在样品Z轴方向上的分辨率显著降低。一种能够在样品厚度达1 µm的情况下提供各向同性、分辨率达数纳米的三维信息的技术是扫描透射电子显微镜（STEM）断层扫描。
本文介绍了一种用于制备高压冷冻、冷冻置换并树脂包埋的病毒学样品，并利用扫描透射电子显微镜断层成像技术（STEM tomography）对其进行分析的实验方案。该方法在室温下成像，兼具保留生物超微结构近天然状态的优势。我们展示了两个可通过STEM断层成像技术解答科学问题的代表性实例。首先，应用该方案研究重组水泡性口炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV）的病毒粒子形态发生过程。STEM断层图像提供了有关重组VSV出芽过程的信息，而这些信息无法通过传统的二维成像技术获得。其次，我们展示了结合荧光共振能量转移（Foerster resonance energy transfer, FRET）成像与STEM断层成像技术（FRET-3D-CLEM）的关联光镜与电镜（correlative light and electron microscopy, CLEM）分析，用于研究EF-C肽纳米纤维。这一近期发表的技术组合为感染增强型肽纳米纤维的细胞摄取与解聚过程提供了新的见解，尤其得益于STEM断层成像可获取较大体积的三维结构信息。

STEM断层扫描技术能够对较厚的切片进行成像，其分辨率在纳米范围内具有各向同性，且与TEM断层扫描相比，可成像更厚的样品；与FIB-SEM断层扫描相比，该技术还提供了相对高效的时间成像流程。在病毒学研究中，这一优势尤为突出，因为它能够在三维空间中对大量超微结构特征进行成像，从而用于统计分析，或用于搜寻罕见事件。本文展示了两个代表性结果，用以说明STEM断层扫描技术在这两个方面的应用方式。
出芽重组水疱性口炎病毒病毒颗粒的可视化
病毒种类繁多，形成的病毒颗粒在形状和大小上各不相同。要分析病毒悬液中病毒颗粒的形态，通常采用负染透射电镜（TEM）等简单方法即可。然而，在细胞环境中表征病毒颗粒的形态则更具挑战性，这一点对于形成各向异性形态颗粒的病毒（如弹状病毒科 rhabdoviridae）尤为突出。VSV 是一种弹状病毒，可形成长度约为 180 nm 的子弹状病毒颗粒。在悬浮细胞中，这些病毒颗粒呈随机取向，因此在二维图像中难以始终辨识其子弹状形态（图 5A-C）。为了准确界定样品中所有重组 VSV 病毒颗粒的子弹状形态，需要一种具有各向同性分辨率的三维成像方法，同时能够对足够大的样品区域提供体积信息。扫描透射电子显微镜（STEM）断层成像可在单个数据集中包含大量完整的病毒颗粒（图 5D、E），从而即使每细胞仅获取一个断层图像，也能对大量病毒颗粒进行成像，用于统计分析。相比之下，对 200 nm 厚切片进行 TEM 断层成像仅能捕获少数几个完整的重组 VSV 病毒颗粒（如 图 5E 中所标注）。
<img alt="蛋白质结构的冷冻电镜显微照片，纳米尺度的结构分析，标注区域 A-E。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68568/68568fig5.jpg" data-altupdatedat="1774324804000" data-alt="图 5"> 
图 5：重组水疱性口炎病毒（VSV）出芽位点的扫描透射电子显微镜（STEM）断层成像。 （A-C）来自厚度为 800 nm 切片的 STEM 断层图像虚拟切片的细节显示，由于（A,B）病毒颗粒取向不同，子弹状形态并不总是可见。（C）只有与观察平面平行取向的病毒颗粒才呈现为轮廓清晰的子弹状。（D）重组 VSV 的出芽位点表现为大量无特定取向的病毒颗粒簇。（E）断层图像的侧面视图展示了利用 STEM 断层成像技术在一个切片中捕获多个完整重组 VSV 病毒颗粒的能力。该虚拟图像堆栈在此位置的厚度约为 600 nm。虚线表示透射电子显微镜（TEM）断层成像典型切片的近似厚度（200 nm），在此厚度下仅能包含少数几个完整的子弹状病毒颗粒。比例尺 = 500 nm（D）。缩写：STEM = 扫描透射电子显微镜；VSV = 水疱性口炎病毒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68568/68568fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

EF-C 肽纳米原纤维的降解
在基因治疗的背景下，转导增强型肽纳米纤维已成为研究热点。在最近发表的一项研究24中，研究人员采用基于荧光共振能量转移（FRET）成像与扫描透射电子显微镜断层扫描（STEM tomography）的关联成像技术（FRET-3D-CLEM），研究了EF-C肽纳米纤维的细胞摄取与解组装过程。高FRET效率对应于彼此靠近的FRET荧光对，发出红色荧光，代表组装态的纤维；低FRET效率对应于彼此远离的FRET荧光对，发出绿色荧光，代表解组装态的纤维。当细胞处于摄取和降解EF-C肽纳米纤维的过程中时，两种信号均会出现。高FRET效率与低FRET效率共存的区域呈现黄色（图6A）。
<img alt="细胞超微结构分析、电子显微镜图像及分割结果，突出显示核仁。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68568/68568fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1774324804000" data-alt="图6"> 
图6：通过相关FRET成像与扫描透射电子显微断层成像（FRET-3D-CLEM）分析EF-C肽纳米原纤维的降解。（A）用标记了FRET对的EF-C纳米原纤维孵育的细胞的共聚焦显微图像。绿色信号对应于可能已解聚的原纤维，红色信号对应于可能仍完整的原纤维，黄色信号对应于同时检测到红色和绿色信号的区域。Nu表示细胞核。（B）同一细胞800 nm厚切片的STEM概览图。（C）断层成像位置的指示图。该图像由在不同切片上获取的两张图像组合而成，因为细胞在其中一个切片中部分被栅格条遮挡。细胞核在A、B和C中均以Nu标注。（C）来自断层成像的虚拟切片。红色箭头标记与红色荧光信号重叠的区域。STEM断层成像证实了完整原纤维的存在。绿色箭头指向含有解聚原纤维的区域。（D）断层成像的分割结果。一个被内吞的伪足正在从囊泡膜上脱离（白色箭头）。STEM断层成像可检测较大的体积（此处约为：7 µm × 7 µm × 550 nm），使得观察此类稀有事件更为容易。（E）断层成像的第19、24和29号虚拟切片。在像素尺寸为6.8 nm的情况下，各切片之间相隔27.2 nm。本图改编自Rauch-Wirth等24发表的数据。比例尺 = 5 µm（A），1 µm（C）。缩写：STEM = 扫描透射电子显微镜；FRET = 傅里叶共振能量转移。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68568/68568fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
通过这种相关联的方法进行可视化，以确认 EF-C 原纤维被细胞摄取并随后降解。光学显微镜使我们能够选择那些呈现红色和绿色信号的细胞，用于电子显微镜观察，从而比较与不同荧光信号相关的超微结构特征。来自同一细胞的扫描透射电子显微镜（STEM）断层图像显示，红色信号可能来源于仍位于细胞外的原纤维，或看似通过巨胞饮作用刚刚被内化的原纤维（图6C）。此外，CLEM 进一步证实绿色信号确实来源于已降解的原纤维（图6B、C），这些降解产物可存在于溶酶体中（图6C，最大囊泡）。由于 STEM 断层成像可获取较大的体积信息，并能对结构进行三维可视化，因此更容易将光学显微镜的信号与超微结构特征相对应并加以解释。此外，利用该方法还可检测到一些罕见事件，例如溶酶体内出现正在脱落的丝状伪足（图6D、E，白色箭头）。

本视频方案演示了如何对病毒学样本进行扫描透射电子显微镜断层成像。为获得最佳结果，样本需通过高压冷冻及后续的冷冻置换方法进行制备。

电子显微镜技术（EM）尤其是三维（3D）EM技术已成为结构病毒学中的成熟方法。对……的研究

病毒感染可能导致细胞结构发生显著改变。为了以三维形式可视化这些变化，我们采用扫描透射电子显微镜断层成像技术（STEM tomography）对病毒感染的细胞进行成像。该技术耗时较长且劳动强度大。这对于生物样本（如病毒感染的样本）而言，使最佳的样品制备变得至关重要。传统的扫描透射电子显微镜断层成像技术仅限于厚度约为200纳米的样本。我们的方案能够实现对更厚切片的三维成像。这使得对病毒感染细胞及其超微结构改变的观察更加全面。许多溶瘤病毒已进入临床试验阶段，因此全球的研究人员和开发者正携手合作，推动癌症治疗的科学前沿不断拓展。诸如电子显微镜和扫描透射电子显微断层成像（STEM tomography）等先进技术为该领域提供了新的见解。我们将继续结合新的样品制备方案及其他显微技术，利用STEM断层成像来解答病毒学中的关键问题。首先，向液氮盒中加入液氮，以准备将冷冻的蓝宝石圆片从高压冷冻（HPF）样品架转移至储存胶囊中。在冷冻过程中，需在附近放置一个装有液氮的杜瓦瓶，以便随时补充液氮盒中的液氮。同时准备好一对绝缘镊子。准备用于在高压冷冻（HPF）后盛放蓝宝石载片的样品容器。确保容器带有盖子，并设有多个用于注入液氮的小孔，以及用于防止容器上浮的小重物。将标记好的容器放入液氮盒中，使用前进行预冷却。然后，将样品放入培养箱中。在开始高压冷冻之前，使用倒置光学显微镜检查蓝宝石圆片，确保细胞数量足够且细胞质量良好。进行高压冷冻时，从培养皿中取出一个蓝宝石圆片，并迅速在滤纸上轻蘸以去除多余的培养基。将载网放入高压冷冻载样 holder 中，碳膜面朝上，确保数字 2 可读。将金质隔片浸入十六烷中，然后轻轻放置在蓝宝石载片上。将第二片蓝宝石载片置于隔片上方，碳膜面朝下，形成细胞相对的三明治结构，确保无气泡残留。小心并迅速地关闭高压冷冻（HPF）样品 holder，以减少对样品的应力。将 HPF holder 插入高压冷冻机中。根据制造商的说明将其锁定，并启动冷冻程序。接下来，将高压冷冻仪样品架转移至液氮盒中。然后将携带蓝宝石载片的尖端转移至预冷的液氮盒内。小心地从样品架中取出载片。将装有冷冻置换溶液且已封口的冻存管放入预冷至零下90摄氏度的冷冻置换装置中。等待溶液温度降至相同水平。将镊子、手术刀以及钳子或大号镊子浸入液氮中预冷，用于转移蓝宝石载片。将高压冷冻的样品转移至冷冻置换装置中。在保持液氮环境的条件下，逐个分离蓝宝石片，并迅速将每一片单独转移至含有冷冻置换溶液的低温冻存管中，确保蓝宝石片完全浸没。关闭冻存管后，立即将其放回冷冻置换装置中。待所有样品放置完毕后，启动置换程序。当样品温度升至20摄氏度时，立即开始后续操作。用100%丙酮对样品进行三次清洗，每次30分钟。进行样品预包埋时，将样品在三分之一环氧树脂和三分之二丙酮的混合液中孵育1小时。随后，将样品在三分之二环氧树脂和三分之一丙酮的混合液中孵育1小时，之后更换为100%环氧树脂溶液，并在管盖打开的条件下孵育过夜，以使残留的丙酮在次日挥发。随后，将蓝宝石圆片转移至装有新鲜配制环氧树脂的已标记新反应管中。将圆片水平放置，由管壁支撑，确保有细胞的一侧朝上。然后将管盖打开的反应管放入设定为60摄氏度的烘箱中，使树脂聚合至少48小时。环氧树脂聚合完成后，将已关闭管盖的反应管管尖浸入液氮中约10秒。轻敲反应管以释放树脂块。蓝宝石圆盘将与碳膜分离，而碳膜仍附着于包埋的细胞上。在包埋样品中选择目标区域，并将样品缩小至该目标区域。使用带有金刚石刀的超薄切片机，在经多聚-L-赖氨酸处理的带电平行栅格上收集约一微米厚的切片，用于扫描透射电子显微镜（STEM）成像和STEM断层扫描。用胶体金处理切片作为定位标记，并施加碳涂层。切取并检查超薄切片后，样品即可用于成像。根据研究问题，插入明场探测器、暗场探测器，或两者均插入。启动扫描模式，并获取样品的测试图像。选择高于800,000倍的放大倍数，该倍数应大于最终所需的放大倍数。在目标区域附近调整焦距并校正像散，同时避免电子束直接照射到样品的关键区域。设置偏心高度，使目标区域（ROI）在整个倾斜范围内保持居中。选择靠近目标区域的一个特征点，将其移至视野中心，调焦并校正像散，然后逐步倾斜样品台至负72度。选择视野时，返回到感兴趣区域（ROI），将其调至清晰并采集一张概览图像。设定倾转系列采集所需的最终放大倍数。设置自动采集倾转系列图像，倾转角度范围从负72度到正72度，每隔1.5度采集一幅图像。启动自动倾转系列采集。STEM热图中的代表性虚拟切片展示了病毒颗粒的取向如何影响其在二维视图中特征性子弹状形态的可见性。只有与观察平面平行排列的病毒颗粒才呈现出完整且清晰的子弹状形态，而其他颗粒则根据其倾斜角度呈现为圆形或拉长形状。为了克服二维成像的方向性限制，采用扫描透射电子显微镜断层成像技术（STEM tomography）对出芽的重组水疱性口炎病毒病毒颗粒的大簇进行成像，从而能够在无方向偏差的情况下评估病毒颗粒的三维形态。热图的侧视图证实了STEM断层成像的体积优势，可在单个600纳米厚的切片内捕获大量完整的病毒颗粒，而相比之下，200纳米的透射电子显微镜（TEM）切片所能采样的范围则十分有限。

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医学

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