病毒学中的扫描透射电子显微镜断层成像：高压冷冻-冷冻置换样品的三维成像

病毒感染可能导致细胞结构发生显著改变。为了以三维形式可视化这些变化，我们采用扫描透射电子显微镜断层成像技术（STEM tomography）对病毒感染的细胞进行成像。该技术耗时较长且劳动强度大。

这对于生物样本（如病毒感染的样本）而言，使最佳的样品制备变得至关重要。传统的扫描透射电子显微镜断层成像技术仅限于厚度约为200纳米的样本。我们的方案能够实现对更厚切片的三维成像。

这使得对病毒感染细胞及其超微结构改变的观察更加全面。许多溶瘤病毒已进入临床试验阶段，因此全球的研究人员和开发者正携手合作，推动癌症治疗的科学前沿不断拓展。诸如电子显微镜和扫描透射电子显微断层成像（STEM tomography）等先进技术为该领域提供了新的见解。我们将继续结合新的样品制备方案及其他显微技术，利用STEM断层成像来解答病毒学中的关键问题。

首先，向液氮盒中加入液氮，以准备将冷冻的蓝宝石圆片从高压冷冻（HPF）样品架转移至储存胶囊中。在冷冻过程中，需在附近放置一个装有液氮的杜瓦瓶，以便随时补充液氮盒中的液氮。同时准备好一对绝缘镊子。

准备用于在高压冷冻（HPF）后盛放蓝宝石载片的样品容器。确保容器带有盖子，并设有多个用于注入液氮的小孔，以及用于防止容器上浮的小重物。将标记好的容器放入液氮盒中，使用前进行预冷却。

然后，将样品放入培养箱中。在开始高压冷冻之前，使用倒置光学显微镜检查蓝宝石圆片，确保细胞数量足够且细胞质量良好。进行高压冷冻时，从培养皿中取出一个蓝宝石圆片，并迅速在滤纸上轻蘸以去除多余的培养基。

将载网放入高压冷冻载样 holder 中，碳膜面朝上，确保数字 2 可读。将金质隔片浸入十六烷中，然后轻轻放置在蓝宝石载片上。将第二片蓝宝石载片置于隔片上方，碳膜面朝下，形成细胞相对的三明治结构，确保无气泡残留。

小心并迅速地关闭高压冷冻（HPF）样品 holder，以减少对样品的应力。将 HPF holder 插入高压冷冻机中。根据制造商的说明将其锁定，并启动冷冻程序。

接下来，将高压冷冻仪样品架转移至液氮盒中。然后将携带蓝宝石载片的尖端转移至预冷的液氮盒内。小心地从样品架中取出载片。

将装有冷冻置换溶液且已封口的冻存管放入预冷至零下90摄氏度的冷冻置换装置中。等待溶液温度降至相同水平。将镊子、手术刀以及钳子或大号镊子浸入液氮中预冷，用于转移蓝宝石载片。

将高压冷冻的样品转移至冷冻置换装置中。在保持液氮环境的条件下，逐个分离蓝宝石片，并迅速将每一片单独转移至含有冷冻置换溶液的低温冻存管中，确保蓝宝石片完全浸没。

关闭冻存管后，立即将其放回冷冻置换装置中。待所有样品放置完毕后，启动置换程序。当样品温度升至20摄氏度时，立即开始后续操作。

用100%丙酮对样品进行三次清洗，每次30分钟。进行样品预包埋时，将样品在三分之一环氧树脂和三分之二丙酮的混合液中孵育1小时。随后，将样品在三分之二环氧树脂和三分之一丙酮的混合液中孵育1小时，之后更换为100%环氧树脂溶液，并在管盖打开的条件下孵育过夜，以使残留的丙酮在次日挥发。随后，将蓝宝石圆片转移至装有新鲜配制环氧树脂的已标记新反应管中。

将圆片水平放置，由管壁支撑，确保有细胞的一侧朝上。然后将管盖打开的反应管放入设定为60摄氏度的烘箱中，使树脂聚合至少48小时。环氧树脂聚合完成后，将已关闭管盖的反应管管尖浸入液氮中约10秒。

轻敲反应管以释放树脂块。蓝宝石圆盘将与碳膜分离，而碳膜仍附着于包埋的细胞上。在包埋样品中选择目标区域，并将样品缩小至该目标区域。

使用带有金刚石刀的超薄切片机，在经多聚-L-赖氨酸处理的带电平行栅格上收集约一微米厚的切片，用于扫描透射电子显微镜（STEM）成像和STEM断层扫描。用胶体金处理切片作为定位标记，并施加碳涂层。切取并检查超薄切片后，样品即可用于成像。

根据研究问题，插入明场探测器、暗场探测器，或两者均插入。启动扫描模式，并获取样品的测试图像。选择高于800,000倍的放大倍数，该倍数应大于最终所需的放大倍数。

在目标区域附近调整焦距并校正像散，同时避免电子束直接照射到样品的关键区域。设置偏心高度，使目标区域（ROI）在整个倾斜范围内保持居中。选择靠近目标区域的一个特征点，将其移至视野中心，调焦并校正像散，然后逐步倾斜样品台至负72度。

选择视野时，返回到感兴趣区域（ROI），将其调至清晰并采集一张概览图像。设定倾转系列采集所需的最终放大倍数。设置自动采集倾转系列图像，倾转角度范围从负72度到正72度，每隔1.5度采集一幅图像。

启动自动倾转系列采集。STEM热图中的代表性虚拟切片展示了病毒颗粒的取向如何影响其在二维视图中特征性子弹状形态的可见性。只有与观察平面平行排列的病毒颗粒才呈现出完整且清晰的子弹状形态，而其他颗粒则根据其倾斜角度呈现为圆形或拉长形状。

为了克服二维成像的方向性限制，采用扫描透射电子显微镜断层成像技术（STEM tomography）对出芽的重组水疱性口炎病毒病毒颗粒的大簇进行成像，从而能够在无方向偏差的情况下评估病毒颗粒的三维形态。热图的侧视图证实了STEM断层成像的体积优势，可在单个600纳米厚的切片内捕获大量完整的病毒颗粒，而相比之下，200纳米的透射电子显微镜（TEM）切片所能采样的范围则十分有限。