Name: 用于研究磷脂酰肌醇磷酸基团对毒液 PLA2 膜致性作用影响的脂质体膜通透性测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学习利用脂质体膜通透性测定方法研究磷脂酶A2诱导的膜变化，该技术具有高灵敏度和高分辨率优势，为膜生物物理学和毒素相互作用研究提供经济有效的解决方案。

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本文所述研究得到了北京朝阳凯文学校启动基金（E.S.G.）以及美国国家卫生研究院SEPA奖（项目编号：5R25MD019151-03，R.K.D.）的资助。与HDP-2制备相关的工作得到了俄罗斯科学基金会项目（项目编号：24-15-00280，Y.N.U.）的支持。&#160;作者感谢Maryam Barancheshmeh博士在撰写分子对接模拟应用的脚本及制作相关视频过程中所做的贡献，该视频是在本研究论文发表后制作完成的。

1. 计算机模拟 使用分子建模软件模拟HDP-2P与PI及磷脂酰肌醇类分子的相互作用
<ol>
	<li>软件安装与准备
	<ol>
		<li>安装指定的化学绘图编辑器，用于构建配体分子，如补充文件1-补充图S1A所示。</li>
		<li>安装分子建模软件，用于配体与受体的分子对接。</li>
		<li>安装用于配体和受体准备的自动化对接工具。</li>
		<li>由于分子建模模拟软件依赖于Python环境，需安装Python。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配体准备
	<ol>
		<li>首先，使用化学绘图编辑器构建PI、PI-4-P、PI-4,5-P2、心磷脂和磷脂酰丝氨酸分子结构的原子坐标。 
		&#8203;注意：后续配体准备步骤中的示例方案仅以PI为例进行说明。</li>
		<li>使用化学绘图编辑器构建PI的分子结构，如补充文件1-补充图S1B所示，并将文件保存为PDB格式，如补充文件1-补充图S2所示。</li>
		<li>在自动化对接工具软件中打开该PDB文件，如补充文件1-补充图S3A所示。</li>
		<li>添加氢原子，如补充文件1-补充图S3B所示，并选择极性氢或全部氢原子，如补充文件1-补充图S4A所示。 
		注意：在完成PI与HDP-2P的对接后，仅选择极性氢原子，以便简化极性键或氢键的可视化。</li>
		<li>将PI分子设置为自动化对接工具软件中的配体，如补充文件1-补充图S4B所示。</li>
		<li>将配体保存为PDBQT文件，如补充文件1-补充图S5A所示。确保所有键均可旋转。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>受体准备
	<ol>
		<li>下载磷脂酶A2 HDP-2的PDB文件（PDB编号2I0U），该结构包含两个单体，其中一个是酸性、无酶活性的A单体，另一个是碱性、有酶活性的E单体。为删除无酶活性的A单体，将2I0U文件导入分子建模软件（补充文件1-补充图S5B），选中A单体的所有原子（补充文件1-补充图S6A），然后进入编辑菜单并删除A单体的所有原子（补充文件1-补充图S6B）。保留具有酶活性的E单体，该单体现被指定为受体。</li>
		<li>在自动化对接工具软件中打开HDP-2P受体的PDB文件，如补充文件1-补充图S7所示。</li>
		<li>移除所有水分子，如补充文件1-补充图S8A所示。</li>
		<li>添加氢原子，如补充文件1-补充图S8B所示。请注意，在完成HDP-2P与PI的对接后，仅选择极性氢原子，以便简化极性和氢键的可视化。</li>
		<li>将HDP-2P设置为受体，如补充文件1-补充图S9A所示，并将其保存为PDBQT文件。确保受体设置中不含可旋转键。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对接参数设置
	<ol>
		<li>同时打开配体和受体的PDBQT文件。</li>
		<li>进入网格框设置界面，如补充文件1-补充图S9B所示，定义网格框尺寸（x尺寸 = 44.644；y尺寸 = 74.939；z尺寸 = 43.050）和中心坐标（x中心 = 25.626；y中心 = 9.582；z中心 = 41.825），确保完全覆盖受体分子的整个表面，如补充文件1-补充图S10A所示。</li>
		<li>使用当前设置关闭网格框设置界面，如补充文件1-补充图S10B所示，并将对接参数保存为config.txt文件，如补充文件1-补充图S11A所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行分子对接软件
	<ol>
		<li>使用config.txt文件启动分子对接软件，如补充文件1-补充图S11B所示。</li>
		<li>执行对接计算（约30-90分钟；补充文件1-补充图S12）。</li>
		<li>检查docking_log.txt文件，查看对接得分（结合亲和力）。</li>
		<li>选择能量最低构象的对接结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对接数据分析
	<ol>
		<li>使用自动化对接工具软件打开对接结果的PDBQT文件。</li>
		<li>分析配体-受体结合位点，重点关注受体的活性中心以及分子间相互作用，包括离子、离子-极性、极性和氢键相互作用。制作PI和磷脂酰肌醇的表格，描述其与受体活性位点相互作用时的结合位点亲和力（kcal/mol）、PI/磷脂酰肌醇极性头部的带电和极性基团、参与分子间键合的HDP-2P残基及键的类型，如表1和表2所示。对每一对受体-配体组合重复对接3次，以确保结合位点、结合亲和力、PI/磷脂酰肌醇的带电和极性基团、HDP-2P残基以及键的类型无偏差。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用与游离脂肪酸酰化的辅酶A监测HDP-2P在富含PI、PI-4-P、PI-4,5-P2、PS或CL的PC脂质体中的水解活性
注意：氯仿、甲醇、NH3 和 CuSO4 具有危害性。操作时务必佩戴腈类手套、护目镜和实验服。所有涉及这些试剂的实验步骤均应在通风橱内进行。氯仿应储存于棕色玻璃瓶中。甲醇应储存于易燃品专用柜中，远离氧化剂，并避免接触火焰和火花。所有盛装这些试剂的废液容器均应贴上标签，并根据当地危险废物处理规定进行处置。
<ol>
	<li>通过将 5.55 mg 的 CaCl2 溶解于 0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）中，配制 100 mL 用于 HDP-2P 催化磷脂水解的缓冲溶液。</li>
	<li>将 7.31 g EDTA 溶解于去离子蒸馏水（ddH2O）中，配制 50 mL 的 1.0 M EDTA 储备液。</li>
	<li>在 0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）中配制 0.54 mM 的 HDP-2P 储备液。HDP-2P 的摩尔质量为 13.827 kDa。</li>
	<li>在氯仿/甲醇混合液（体积比 2:1）中配制以下磷脂的 10.0 M 储备液：蛋黄 L-α-磷脂酰胆碱（PC）、牛心 心磷脂（CL）、牛脑 L-α-磷脂酰-L-丝氨酸（PS）、PI、PI-4-P 和 PI-4,5-P2。PC、CL、PS、PI、PI-4-P 和 PI-4,5-P2 的摩尔质量分别为 768 Da、1,466 Da、792 Da、867 Da、962 Da 和 1,057 Da，具体如下所述。</li>
	<li>制备五份 PC 脂质体样品。为制备一份 PC 脂质体样品，将 75 µL 的 PC 氯仿/甲醇储备液加入玻璃试管中，在 10 Pa 真空条件下于 25 °C 干燥 1 小时，直至形成脂质膜。在恒温器中于 25 °C 下用 15 mL 磷脂水解缓冲液水合脂质膜 1 小时。然后，将功率为 100–150 W 的超声波分散仪的钛探头插入置于冰浴中的玻璃试管内的脂质悬浮液中，在 22 kHz 频率下超声处理 10 分钟，功率不超过最大功率的 50%。为去除钛“粉尘”颗粒，在室温下以 200 × g（使用 10 cm 转子时为 1,270 rpm）离心 10 分钟以纯化脂质体。</li>
	<li>通过将氯仿/甲醇磷脂储备液在玻璃试管中混合（PC 60 µL 与 CL、PS、PI、PI-4-P 或 PI-4,5-P2 各 15 µL），按 PC 与其他磷脂摩尔比 4:1 制备含 CL、PS、PI、PI-4-P 或 PI-4,5-P2 的 PC 脂质体样品。随后，在 10 Pa 真空下干燥脂质，或在室温下干燥 3 小时，再用磷脂水解缓冲液水合脂质膜，并按上述方法进行超声处理。 
	注：每种类型的脂质体制备五份样品。</li>
	<li>从上述每种类型的五份脂质体样品中各取 1.0 mL 分别加入不同的试管中，向每支试管中加入 10 µL NEFA 试剂盒中的无色辅酶 A 溶液，然后分别向不同试管中加入 0.00、0.93、1.86、2.79 或 3.72 µL 的 0.54 mM HDP-2P 储备液，使脂质体样品中的 HDP-2P/磷脂摩尔比分别为 0.000、0.001、0.002、0.003 和 0.004。</li>
	<li>在向脂质体中加入 HDP-2P 后立即于 37 °C 恒温条件下孵育 15 分钟，然后加入 100 µL EDTA 储备液终止 HDP-2P 诱导的磷脂水解反应。随后，将样品涡旋振荡 1 分钟。</li>
	<li>通过分光光度计在 550 nm 处测定脂质体样品的光密度，以量化 HDP-2P 的水解活性，该检测反映无色辅酶 A 溶液在与游离脂肪酸发生酰化后变为紫色的程度。</li>
	<li>重复上述步骤两次，使平均光密度值来自三次独立实验。 
	注：本实验中获得的每个数据点均为光密度的平均值。理想情况下，实验数据点的标准偏差应在平均值的 ±5% 范围内。</li>
</ol>
3. 通过CuSO&#8203;4溶液中包埋于脂质体内的NH3配体参与的配体置换反应，测定HDP-2P对富含PI、PI-4-P、PI-4,5-P2、PS或CL的PC脂质体膜通透性的影响
注意：氯仿、甲醇、NH3 和 CuSO4 具有危害性。操作时务必佩戴腈类手套、护目镜和实验服。所有涉及这些试剂的实验步骤均须在通风橱内进行。氯仿应储存于棕色玻璃瓶中。甲醇应储存于易燃品专用柜中，远离氧化剂，并避免接触火焰或火花。所有盛装这些试剂的废液容器均需贴上标签，并依照当地危险废物处理法规进行处置。
<ol>
	<li>分别用氯仿/甲醇（2:1 体积比）配制 20 mL 的 0.03 M 六种磷脂储备液——PC、CL、PS、PI、PI-4-P 和 PI-4,5-P2。PC、CL、PS、PI、PI-4-P 和 PI-4,5-P2 的分子量分别为 768、1466、792、867、962 和 1057 Da。</li>
	<li>配制 100 mL 含 0.05 M CuSO4 的 0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）。</li>
	<li>用含 0.05 M CuSO4 的 0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）配制 4 mL 的 1.5 × 10-3 M HDP-2P 储备液。HDP-2P 的摩尔质量为 13.827 kDa。</li>
	<li>配制 100 mL 的 0.5 M NH3 溶液时，使用 25% NH3 溶液（密度为 905 g/L30，相当于 13.30 M [905 g/L × 0.25 M ÷ 17.00 g/L = 13.30 M]）。因此，配制 100 mL 的 0.5 M NH3 溶液需取 3.76 mL 的 25% NH3 溶液：(0.5 M × 1,000 mL ÷ 13.30 M) ÷ 10 = 3.76 mL 的 25% NH3 溶液。将 3.76 mL 的 25% NH3 溶液加入 100 mL 容量瓶中，并用 0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）定容至 100 mL。</li>
	<li>为制备内腔含有 NH3 的脂质体，取 12.5 mL 氯仿/甲醇中的 0.03 M 磷脂储备液置于试管中，在 10 Pa 真空条件下或室温下干燥 3 小时以除去溶剂。将所得磷脂膜在 25 °C 恒温条件下，用 12.5 mL 的 0.5 M NH3、0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）水化 1 小时；然后按照步骤 2.5 所述条件，在 22 kHz 频率下对脂质悬浮液进行超声处理，以制备超声处理后的脂质体。 
	注意：在超声处理后的脂质体溶液中，NH3 存在于脂质体内外两侧。</li>
	<li>为去除脂质体外部的 NH3，使用截留分子量为 1.0 kDa 的透析膜，在室温下以磁力搅拌方式，用 0.10 M Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）对脂质体进行 5 小时透析。 
	注意：透析 5 小时足以完全去除 NH3，因为将 0.5 mL 透析后的脂质体加入 0.5 mL 的 0.10 M Tris-HCl、0.05 M CuSO4 缓冲液后，在 600 nm 处测得的光密度值与未含 NH3 制备的脂质体混合相同缓冲液后的光密度值一致。</li>
	<li>透析完成后，按照步骤 2.5 所述方法，在 200 × g 条件下离心 90 分钟以沉淀脂质体。弃去上清液，用 5.0 mL 的 0.10 M Tris-HCl、0.05 M CuSO4 缓冲液（pH 7.4）重悬脂质体沉淀，并将重悬后的脂质体均分为五个 1.0 mL 的样品。分别向这五个 1.0 mL 样品中加入 80、60、40、20 和 0 µL 的 0.10 M Tris-HCl、0.05 M CuSO4 缓冲液（pH 7.4），再分别加入 0、20、40、60 和 80 µL 的 HDP-2P 储备液，使各脂质体样品中的 HDP-2P/磷脂摩尔比分别为 0.000、0.001、0.002、0.003 和 0.004。</li>
	<li>将脂质体样品在 37 °C 恒温条件下孵育 30 分钟；然后使用分光光度计在 600 nm 处测定各样品的光密度值。对全部六个脂质体样品均按照第 3 节所述步骤进行操作，并重复三次，以确保每个数据点均有三个重复的光密度读数。 
	注意：实验数据点的标准偏差应始终控制在平均值的 ±5% 范围内。</li>
</ol>

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作者声明无利益冲突。

在本研究中，我们探究了磷脂酰肌醇（PI）中与肌醇环共价结合的磷酸基团是否能够阻止磷脂酶A2（PLA2）对磷脂膜的降解作用。为了评估PLA2水解活性引起的磷脂膜降解进程，我们设计了一种简单但高度敏感且准确的方法，用于测量膜通透性的变化，随着结构降解的进行，膜通透性应会增加。
该方法基于配体取代反应，涉及六水合铜(II)配合物[Cu(H2O)6]2+，其悬浮于磷脂脂质体外的水相环境中，而氨（NH3）则被包封在脂质体内部。氨对Cu2+的亲和力高于水分子，但NH3必须透过脂质体膜进入外部水相，才能取代[Cu(H2O)6]2+中的H2O分子。若脂质体膜的结构完整性因PLA2催化的磷脂水解反应而受损，膜对NH3的通透性将增加，从而促进配体取代反应，导致溶液颜色由[Cu(H2O)6]2+的浅蓝色转变为[Cu(H2O)2(NH3)4]2+的深蓝色。我们通过分光光度法定量监测了该转变过程，记录了600 nm处光密度的变化。
我们先前曾使用1H-NMR结合顺磁性离子铁氰化物[Fe(CN)6]3-，研究HDP-2P24和眼镜蛇毒心脏毒素24,25,26,27,28,39对膜通透性的影响。我们也曾使用一系列荧光和磷光探针，研究眼镜蛇毒心脏毒素对脂质体膜通透性的作用20,23,40。然而，铁氰化物以及荧光/磷光探针均为体积较大的非生理分子实体，仅在膜完整性受到显著破坏时才能穿透脂质膜。相比之下，我们新建立的配体置换检测方法利用NH3&#160;——一种体积小、天然存在的细胞代谢物，可在脂质排列发生微小扰动时即穿透脂质膜。该新型膜通透性检测方法的灵敏度更高，其可在HDP-2P/脂质摩尔比低至0.001时检测到膜通透性的变化，而¹H-NMR/铁氰化物法检测所需的最低摩尔比为0.00423。
在同一项研究中，我们利用二茂铁对赤藓红磷光的猝灭效应，通过检测测试样品中赤藓红寿命（τn）与对照样品中寿命（τ0）的比值变化，评估HDP-2P对膜间脂质交换的影响23。当HDP-2P/脂质摩尔比为0.004时，τn/τ0值下降至0.423，表明膜处于对二价阳离子具有通透性的流动性状态24。因此，我们基于NH3的配体置换实验可在HDP-2P/脂质摩尔比为0.001时检测到膜通透性，而传统实验方法（1H-NMR/铁氰化物法和磷光探针猝灭法）仅在摩尔比为0.004时才能检测到膜通透性。这表明，我们基于NH3的实验方法比传统方法灵敏度高四倍。
基于NH3的检测方法具有极高的灵敏度，所得通透性数据与水解活性测量结果高度一致，仅有一个明显例外：PC+PI-4-P脂质体在未发生通透性变化的情况下表现出可忽略的水解作用，表明局部产生的微量溶血磷脂/脂肪酸并不影响整体脂质排列，因而不会破坏膜的结构完整性和通透性。因此，本研究证明，在复合离子体系中发生的配体取代反应——其中配体被包裹在脂质体内部腔室中——所得结果与HDP-2P的水解活性数据高度吻合。这些发现也与关于PI及磷脂酰肌醇类分子与HDP-2P分子表面结合的计算机模拟（in-silico）研究结果高度一致。
总体而言，本研究中的 AutoDock 模拟结果显示，在已鉴定的九个结合位点中，PI 在其中四个位点与活性中心结合，而 PI-4-P 仅在一个预测位点与活性中心结合。HDP-2P 在 PC+PI-4-P 脂质体中的水解活性比在 PC+PI 脂质体中低约 5 倍。此外， 计算机模拟 研究预测PI-4,5-P无结合能力2 到HDP-2P的活性中心。一致地，PLA2 活性测定和配体取代反应实验表明，PI-4,5-P2 完全抑制了磷脂水解和膜通透性的增加，而PI-4-P的水解活性较低，且无显著性，完全阻止了膜通透性的改变。这些观察结果与 体外 人细胞质型、钙非依赖型及分泌型磷脂酶A2活性研究2 酶对PI、PI-4-P和PI-4,5-P的特异性235这些研究表明，只有IVA型胞质PLA2 对PI和PI-4-P表现出相对较高的催化活性，而对PI-4,5-P的活性较低2 几乎无法检测到。所有其他测试的PLA2 酶对PI-4,5-P无活性235这种活性的缺乏归因于肌醇环上高度亲水的磷酸基团，这些基团干扰了膜表面与PLA之间的有效相互作用2 酶35我们推测，肌醇环上的磷酸基团向外延伸至溶液中，并能够与HDP-2P沟槽状空腔中的残基形成离子-极性相互作用和氢键，这很可能阻碍HDP-2P足够接近膜表面，从而抑制其水解活性，稳定细胞膜，减少HDP-2P对磷脂膜的降解作用。而HDP-2P介导的膜降解可能通过激活细胞死亡通路对细胞造成损害。该机制似乎与磷脂酰肌醇在涉及异常酶活性的疾病状态下可能发挥的保护作用相一致。
膜通透性检测、水解活性测定与in silico分子对接研究所得结果之间存在强相关性，这凸显了配体取代反应方法的可靠性。该方法利用包裹在脂质体内的配体，被证明是一种准确且有效的工具，可用于评估由磷脂稳定双层结构发生结构扰动所引起的膜通透性变化。尽管我们承认本文中采用AutoDock进行的分子对接研究尚不能全面揭示磷脂如何以动态和纵向方式与HDP-2P相互作用，未来仍需开展分子动力学研究，以进一步阐明HDP-2如何使由不同磷脂组成的磷脂双层发生通透化的其他分子机制。需要注意的是，开展分子动力学研究需要高性能计算机和计算集群等高算力资源，而许多资源有限、科研经费不足的学术机构尚不具备此类条件。最后，我们承认本技术论文中采用了刚性受体（HDP-2P），且缺乏溶剂/膜环境。然而，我们希望强调的是，使用刚性受体对HDP-2P与多种磷脂进行分子对接是开展初步对接研究的常规方法，可用于初步筛选出可能的结合构象；待未来确定催化位点中与底物结合的关键氨基酸残基后，可进一步聚焦于这些可被设为柔性的分子区域，在溶剂化环境中开展基于柔性受体的后续分子对接研究。因此，与拥有更丰富资源的其他机构开展合作，有助于验证AutoDock提供的部分初步发现，并进一步揭示底物-酶相互作用的其他分子机制。
总之，本研究的结果表明，配体取代反应方法利用封装在脂质体内的配体，可有效应用于多种膜介导过程中膜通透性的研究。这些过程包括配体-受体相互作用、脂质-蛋白质相互作用、膜间交换、膜融合与裂变以及神经肌肉收缩等。此外，该方法在研究膜靶向药物方面也具有重要潜力。与此同时，我们认识到，尽管模型膜中的新方法对于解析膜相互作用的特定机制极为宝贵，但其固有的简化特性限制了其完全复制生物膜在结构、组成和功能上的复杂性。 体内因此，必须谨慎解读来自模型系统的数据，并尽可能利用细胞或整体生物模型对研究结果进行验证。

磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol, PI）是一种阴离子磷脂，由磷脂酸骨架通过磷酸基团连接肌醇（一种六羟基六元碳环）构成。肌醇可在2、3、4、5和6位碳原子上通过可逆的磷酸化反应转化为磷脂酰肌醇磷酸酯（phosphoinositides）1磷脂酰肌醇及其磷脂酰肌醇衍生物存在于动物、植物和微生物等多种细胞的质膜和细胞器中。自Mable和Lowell Hokin发现这些物质以来已有七十年2,3,4，PI及磷脂酰肌醇类分子仍是广泛研究的对象，旨在阐明其分子机制及其在人类健康中的作用5,6,7.
除了脑组织外，磷脂酰肌醇通常含量较低，约占质膜内小叶总脂质的0.5%至1%。已有研究数据表明，在生理条件下，磷脂酰肌醇（PI）不太可能发挥主要的结构作用1。然而，在疾病状态下，PI和磷脂酰肌醇的水平会升高，并翻转至质膜的外小叶，提示这些磷脂可能与疾病抵抗相关1。尽管长期以来认为PI在生理功能中的作用较磷脂酰肌醇次要，但新出现的证据强调了PI-4-P和PI-4,5-P2在多种生理过程中的重要性1。这些过程包括细胞内信号传导、细胞间信号转导8,9,10、膜运输11,12,13、基因表达的调控1，以及细胞增殖14和存活1。尽管如此，PI和磷脂酰肌醇驱动这些过程的分子机制仍不清楚。
磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰肌醇磷酸酯在脑组织细胞中含量丰富，约占总磷脂的10%，尽管其水平可能在脑部疾病的早期阶段短暂升高，提示磷脂酰肌醇磷酸酯可能对抗由异常PLA2活性引发的轴突脱髓鞘所导致的神经病理学变化1，例如多发性硬化症和阿尔茨海默病15,16,17。这些酶属于多个类别和组别，包括IIA型分泌型磷脂酶A2（sPLA2）15。在多发性硬化症和阿尔茨海默病患者的脑脊液中可检测到该类酶水平升高，其参与髓鞘膜的降解，导致脱髓鞘15。另有报道指出，蛇毒中的sPLA2可抑制神经肌肉突触的信号传递18,19，引起中枢神经系统紊乱，并对周围神经肌肉系统产生不利影响20。
本研究探讨了磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰肌醇磷酸盐是否能够保护模型磷脂膜免受异常表达的sPLA2酶的影响。模型膜由磷脂酰胆碱（PC）构成，PC是所有哺乳动物细胞膜中最丰富的磷脂21，并添加了摩尔比为20%的PI、PI-4-P或PI-4,5-P2。为了模拟异常表达的sPLA2酶对模型膜的作用，我们采用了IIA型分泌型蝰蛇毒液神经毒性PLA2酶的基本亚基HDP-2P22，其水解活性此前已在模型髓鞘膜上进行过研究23。
在本研究中，我们开发了一种新方法，用于研究HDP-2P对脂质体膜通透性的影响。该新方法基于脂质体外CuSO4溶液中发生的配体置换反应，其中脂质体内包裹有NH3配体。若HDP-2P诱导的膜通透性导致NH3从脂质体中泄漏，释放出的氨将通过以下反应定量取代水合铜离子中的四个水分子：[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) <img alt="静态平衡；ΣFx=0；矢量图；力，平衡，物理，分析。" src="/files/ftp_upload/68594/68594eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程1"> [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)。该配体交换反应会产生特征性的溶液光密度升高，可通过分光光度法（λ = 600 nm）进行测量，作为我们定量评估膜通透性变化的读数。与传统的1H-NMR23,24,25,26,27,28和离子转运实验29等技术相比，我们基于配体置换的方法在评估膜通透性方面表现出更高的灵敏度，同时还具有无需昂贵仪器的优点。这一简单且经济高效的方法，结合HDP-2P水解活性的测定以及PI、PI-4-P和PI-4,5-P2与HDP-2P分子表面结合的in silico模拟，使我们得出结论：PI肌醇环上的磷酸基团可消除HDP-2P对富含PI-4-P或PI-4,5-P2的PC膜的破坏作用。若该发现能在后续研究中得到证实，则PI肌醇环磷酸基团抵御异常活性细胞蛋白有害影响的能力，可能有助于在涉及蛋白质异常活性的疾病状态下维持膜的稳定性，从而为开发治疗阿尔茨海默病和多发性硬化等神经系统疾病的新药铺平道路。

<table><tbody><tr><td>来自 V. nikolskii 蝰蛇毒液 PLA2 的基本亚基 HDP-2P，HDP-2，纯度 98.5%&amp;nbsp;</td><td>莫斯科生物有机化学研究所</td><td></td><td>根据 PMID:18083205 中的方案分离得到 HDP-2。HDP-2P 通过 DEAE Sephadex A-50 从 HDP-2 中纯化获得&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>心磷脂（心脏来源，牛）（钠盐），&gt;99%</td><td>麦克林</td><td>C916138</td><td></td></tr><tr><td>辅酶 A，FUJIFILM Wako&amp;rsquo;s NEFA 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>美国马萨诸塞州列克星敦</td><td></td><td></td></tr><tr><td>截留分子量为 1.0 kDa 的透析袋纤维素膜</td><td>Sigma Aldrich 贸易有限公司，中国上海&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>数字控制水浴恒温器&amp;nbsp;</td><td>中国北京永光明医疗仪器有限公司&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子高精度分析天平 FA2004&amp;nbsp;</td><td>中国上海迈伊有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>精华 752 紫外-可见分光光度计&amp;nbsp;</td><td>中国上海精华仪器有限公司，上海</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-磷脂酰胆碱（卵来源，鸡），&amp;ge;95%</td><td>麦克林</td><td>L799415</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-磷脂酰肌醇（肝脏来源，牛）（钠盐），&amp;ge;99%</td><td>麦克林</td><td>L780292</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（脑组织来源，猪）（铵盐），&amp;ge;99%</td><td>麦克林</td><td>L996223</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-磷脂酰肌醇-4-磷酸（脑组织来源，猪）（铵盐），99%</td><td>麦克林</td><td>L970250</td><td></td></tr><tr><td>L-&amp;alpha;-磷脂酰丝氨酸（脑组织来源，猪）（钠盐），&gt;99%</td><td>麦克林</td><td>L864755</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器 JB-3&amp;nbsp;</td><td>上海雷磁 JB-3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 计 PHS-3C&amp;nbsp;</td><td>中国上海仪电科学仪器股份有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGL-16B 微量离心机&amp;nbsp;</td><td>中国上海三安亭公司，上海</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超声波分散仪 Yt-JY96-IIN&amp;nbsp;</td><td>中国上海叶拓科技有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空泵 TW-1M</td><td>中国温岭挺威有限公司</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究磷脂酰肌醇磷酸基团对毒液pla2膜向性作用影响的脂质体膜通透性检测方法

A Liposome Membrane Permeability Assay for Investigating the Effects of Phosphatidylinositol Phosphate Groups on Membranotropic Action of Venom PLA2

我们开发了一种基于脂质体内腔包封配体的配体置换反应的新型、低成本且高灵敏度的检测方法，用于评估脂质体膜的通透性，并将该方法与水解活性检测（利用辅酶A酰化）及分子模拟相结合，以研究磷脂酰肌醇肌醇环上的磷酸基团是否能够保护膜免受异常表达酶的损伤作用。磷脂酶A2（PLA2）的异常表达会导致轴突脱髓鞘，进而引发多发性硬化症和阿尔茨海默病。为模拟异常表达PLA2的作用，我们采用了蝰蛇毒液PLA2的基本亚基HDP-2P。该HDP-2P被用于测试含有磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI-4-P）或磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI-4,5-P2）的磷脂酰胆碱（PC）脂质体。尽管HDP-2P在PC脂质体中表现出极低的水解活性且仅轻微增加通透性，但在PC脂质体中添加PI则显著增强了水解作用和通透性。值得注意的是，PI-4-P和PI-4,5-P2&#160;显著抑制了HDP-2P的水解活性，并完全降低了膜通透性。分子模拟结果显示，磷脂酰肌醇肌醇环上的磷酸基团通过空间位阻阻碍磷脂进入HDP-2P的活性位点，从而阻止水解反应的发生。体外（in vitro）和计算机模拟（in silico）数据均表明，磷酸化的磷脂酰肌醇与PLA2&#160;活性降低相关，提示其可能作为一种减轻过度PLA2活性的潜在机制——可能是保护细胞膜免于退化的生理手段。

我们提出了一种经济高效的方法，用于评估脂质体膜通透性，其灵敏度和分辨率优于传统技术。该方法利用一种新型的包封配体取代反应，可检测磷脂酶A2诱导的模型膜变化。此方法易于与标准分析整合，是一种便捷的技术，可提高研究膜生物物理学及毒素相互作用的分辨率。

一种用于研究磷脂酰肌醇磷酸基团对毒液PLA2膜向性作用影响的脂质体膜通透性检测方法

我们开发了一种基于配体取代反应的新型、低成本且高灵敏度的脂质体膜通透性检测方法……

a-liposome-membrane-permeability-assay-for-investigating-effects

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科研

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基于荧光的磷脂翻转酶活性检测方法

本文介绍了一种基于微流控平台的支撑脂双层，用于通过基于pH调节的无标记方法研究蛋白质与磷脂酰肌醇之间的相互作用。...

基于芯片的PIP研究：蛋白质-磷脂酰肌醇相互作用的无标记分析

本文描述了利用荧光脂质探针和脂质体来确定某种蛋白质是否提取并转运磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇4-磷酸的实验方案 体外.

基于荧光的膜间磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇-4-磷酸交换测量方法

本方案描述了模拟细胞的单脂质和多脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层的制备方法。这些 体外 模型可进行调整以包含多种脂质类型，并可用于研究各种分子和大分子间的相互作用。...

用于研究分子相互作用的模拟细胞支撑及悬浮脂双层模型的构建

本文介绍了一种从海葵中获取粗毒提取物并检测其溶血活性和磷脂酶活性的实验方案。...

通过简易生物测定法鉴定海葵粗提物中的溶血活性与磷脂酶活性

学习利用脂质体膜通透性测定方法研究磷脂酶A2诱导的膜变化，该技术具有高灵敏度和高分辨率优势，为膜生物物理学和毒素相互作用研究提供经济有效的解决方案。

一种用于研究磷脂酰肌醇磷酸基团对毒液PLA₂膜向性作用影响的脂质体膜通透性检测方法

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