双模态分子图谱：整合多重mRNA检测与蛋白质成像质谱流式技术

我们专注于特殊生物学研究，以进一步了解卵巢癌的分子机制，希望发现新的治疗靶点和生物标志物，用于预测患者生存率。目前成像质谱流式（IMC）技术面临的一些挑战包括低丰度蛋白的解析、抗体验证与滴定的工作量，以及分析过程中复杂且耗时的像素分类。首先，从制备好的FFPE切片上移除多余的液体。

从烘箱中取出湿度控制托盘，将载玻片架放入托盘中。然后充分涡旋振荡 RNA-ISH 扩增剂 3，加入足量试剂以完全覆盖载玻片上的每张组织切片。盖上托盘，放入杂交烘箱中，在 40 °C 下孵育 30 分钟。

孵育期间，通过将每种寡核苷酸按1:15的比例稀释来配制金属寡核苷酸混合液。充分涡旋振荡金属寡核苷酸混合液，室温下放置备用。现在，从烘箱中取出湿度控制托盘。

将载玻片架从托盘中取出，并将托盘放回烘箱中。然后，将载玻片放入已用无核酸酶水预清洗过的透明载玻片架中。在轻微振荡条件下，用洗涤缓冲液洗涤载玻片2分钟。

从载玻片上除去多余液体后，将湿度控制托盘从烘箱中取出，并将载玻片架放入托盘中。加入先前配制的混合金属寡核苷酸，以完全覆盖每个组织切片。然后，将托盘完全封闭，并放入杂交炉中，在 40 摄氏度下孵育 45 分钟。

从杂交炉中取出湿度控制托盘，拿出切片架，并将空托盘放回炉内。为阻断非特异性结合位点，加入足量的封闭缓冲液以完全覆盖载玻片上的每张组织切片，并在室温下孵育30分钟。在切片孵育的同时，使用抗体稀释缓冲液稀释抗体，配制抗体混合液。

孵育结束后，弃去组织切片上的缓冲液，加入足量预先配制的抗体混合液，完全覆盖组织切片。随后将切片放入湿盒中，在4摄氏度下孵育过夜。为配制新鲜的铱嵌入剂溶液，使用无RNase的TBS将500微摩尔的储存液按1:2,000稀释。

将切片放入已用无核酸酶水预洗过的透明切片架中，用TBS-T缓冲液轻轻振荡洗涤五分钟。然后，向切片中加入配制好的铱工作液进行染色，在室温下孵育五分钟。之后，将切片转移至另一个已用无核酸酶水预洗过的透明切片架中。

用 TBS-T 缓冲液轻轻振荡洗涤载玻片两次，每次五分钟。然后将载玻片迅速浸入重蒸水中，以防止组织上残留 TBS 中的盐结晶。将载玻片在化学通风橱中干燥 10 分钟，并于 4 摄氏度保存，直至进行图像采集。

将制备好的载玻片放入成像质谱流式系统的消融室中。对载玻片拍摄全景图像以确定目标区域。使用图像采集软件在全景图像上标记所需的目标区域。

在图像采集软件中应用采集模板，并根据样本类型调整激光功率。现在，开始激光消融过程。

使用检测器测量每种同位素的数量，检测器将数据转换为数字形式以供分析。通过在 mRNA 和蛋白质水平上共检测颗粒酶 B 以及干扰素-γ 阳性，评估 CD8 T 细胞的活化状态。结果显示，一种癌症相关成纤维细胞表达 MFAP5 蛋白和 POSTN mRNA，二者均为癌症相关成纤维细胞侵袭性的标志物。

显示一个CD4 T细胞共表达IL17A和IL6 mRNA，符合TH17细胞特征。观察到CD4 T细胞表达IL13 mRNA。在CD8 T细胞附近发现角蛋白阳性且CD47阳性的肿瘤细胞。

已证明活化的CD8 T细胞表达CD25蛋白。在金属偶联和荧光标记方案之间，THBS2和CD47的mRNA染色结果相当。