Name: 双模态分子制图学：将多重 mRNA 检测与蛋白质成像质谱细胞术相结合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T12:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 学习多重mRNA检测与蛋白质成像质谱细胞术相结合的双模态分子制图学方法，用于卵巢癌分子机制研究。该技术有助于发现新的治疗靶点和预测患者生存的生物标志物。

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本研究与流式细胞术和细胞成像核心设施合作完成，该设施部分由美国国立卫生研究院通过M. D. Anderson癌症中心支持基金P30 CA016672资助。本研究还部分得到了M. D. Anderson癌症中心支持基金发展奖、成像质谱流式细胞术空间转录组学项目的资助。 通过 RNAscope，P30CA016672，NIH/NCI，PI - Pisters。JKB 的工作部分由 P30 CA016672 和 NCI 研究专家项目 1 R50 CA243707-01A1 资助。SFB 的工作部分由卵巢癌研究联盟（OCRA 811621 和 891490）、Tina Brozman 卵巢癌研究基金会、MDACC 卵巢癌 SPORE 发展研究项目以及 NIH 1R01CA261952-01A1 资助。SFB、JKB 和 BG 的工作部分由资助项目 1U01CA294459-01 支持。作者谨此感谢 Samuel Mok 对所用样本进行切片并提供样本。

本方案采用未经治疗的高级别浆液性卵巢癌患者接受初次细胞减灭术时采集的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。所有临床数据均来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心妇科肿瘤与生殖医学系的资料库，获取过程遵循经机构审查委员会批准的研究方案。已获得患者的书面知情同意，研究严格按照公认的伦理准则进行。
1. 注意事项与准备工作
<ol>
	<li>始终使用无核酸酶水（NFW）配制所有所需试剂。</li>
	<li>所有步骤均应使用塑料容器，避免使用玻璃器皿，以减少金属与玻璃结合及金属污染。</li>
	<li>保持工作区域高度清洁，使用RNase去污染溶液喷洒台面和移液器，随后用NFW配制的70%乙醇喷洒。</li>
	<li>将巯基化mRNA检测探针（T1-T12）与相应的金属结合 通过 马来酰亚胺连接子，如Schulz等人所述7，进一步详情见 protocol.io 上的 材料表. 
	注意：应选择能够指示细胞在组织内位置的蛋白质靶标（结构性标志物）、确定存在哪些细胞的标志物（表型标志物），以及反映细胞功能活动的标志物（功能性标志物）。由于某些功能性标志物呈瞬时表达，引入mRNA靶标可实现对正在生成这些标志物的细胞的识别。</li>
</ol>
2. 样品制备与预处理
<ol>
	<li>将组织切片置于干燥烘箱中，60 °C 下烘烤过夜。</li>
	<li>进行脱蜡处理：二甲苯处理三轮，每轮 5 分钟；再进行十轮水化处理（100% 乙醇（EtOH）2 次，95% EtOH 2 次，70% EtOH 2 次，50% EtOH 2 次，30% EtOH 2 次），每轮 3 分钟。用 1× Tris 缓冲盐水（TBS）洗涤一次，每次 2 分钟。根据同时处理的样本数量，使用 50 mL 锥形管（最多 2 张载玻片）或 350 mL 免疫组化染色盒（最多 24 张载玻片）。 
	注意：此脱蜡步骤虽为推荐操作，但可根据组织类型选择性执行。</li>
	<li>加入 3.7% 多聚甲醛（PFA）溶液，室温孵育 10 分钟，将组织切片放入 50 mL 管中，并加入足量 PFA 溶液以完全覆盖组织切片。</li>
	<li>微波辅助热诱导抗原修复（HEIR）：使用带温度监控的微波炉，将一个托盘加入 pH 6 的 HEIR 抗原修复缓冲液（350 mL），其余托盘加入无核酸酶水（NFW）。将组织切片放入显微镜载玻片染色架中，并将其置于含抗原修复缓冲液的托盘内。 
	注意：进行抗原修复前，确保抗原修复缓冲液已恢复至室温（RT）。</li>
	<li>在 107 °C 下进行抗原修复 15 分钟，随后将载玻片置于化学通风橱中，室温冷却 20 分钟。</li>
	<li>在抗原修复过程中，将保湿纸用无核酸酶水润湿，放入湿度控制载玻片染色托盘中，并将托盘置于 60 °C 的杂交炉内。</li>
	<li>用无 RNase 的 TBS 溶液冲洗载玻片 3 分钟，随后干燥 3 分钟。</li>
</ol>
3. 蛋白酶处理
<ol>
	<li>使用疏水性屏障笔在每张组织切片周围画出疏水屏障。让屏障完全干燥，约需 2 分钟。</li>
	<li>打开摆动夹，将干燥的载玻片装入湿盒中的载玻片架内。</li>
	<li>滴加足够量的蛋白酶，完全覆盖组织切片。从杂交炉中取出预热的湿控盒（60 °C，步骤 2.6），并将载玻片架插入湿控盒中。重新密封湿控盒，并放回杂交炉。在 40 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>在孵育期间，准备 RNA-ISH 检测所需材料。
	<ol>
		<li>通过将 50 倍浓缩液用 NFW 稀释，配制 500 mL 的 1 倍 RNA-ISH 洗涤缓冲液。可在室温下保存长达一个月。 
		注意：若 50 倍洗涤缓冲液中出现沉淀，请在配制 1 倍洗涤缓冲液前，将缓冲液于 40 °C 加热 10–20 分钟以重新溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 NFW 中加入 5 mL Tween，配制 1 L 的 DTBS-T（0.5% Tween）。</li>
	<li>准备 RNA-ISH ZZ 配对靶标探针：
	<ol>
		<li>将 mRNA 探针原液和 RNA-ISH 稀释液置于 40 °C 干式加热器中温育 10 分钟。涡旋震荡探针后，在台式小型离心机中短暂离心。</li>
		<li>通过将 50 倍原液探针用 RNA-ISH 稀释液稀释，配制 1 倍混合液（最多 12 种探针，表 1），确保最终体积足以完全覆盖整个组织切片。</li>
		<li>充分涡旋混匀，将混合探针和 RNA-ISH 稀释液置于室温下备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从杂交炉中取出湿控盒，并取出载玻片架。将湿控盒放回杂交炉中。</li>
	<li>将载玻片放入已用 NFW 预先清洗过的透明载玻片架中。在 NFW 中轻轻振荡洗涤 5 分钟。</li>
	<li>更换新鲜 NFW，重复洗涤步骤 5 分钟。</li>
</ol>
4. 靶标探针杂交
<ol>
	<li>去除载玻片上的多余液体。将湿度控制盘从烘箱中取出，并将载玻片架放入盘中。</li>
	<li>加入足量的适当探针混合液，完全覆盖每个组织切片。盖上盘盖，放入40 °C烘箱中孵育2小时。</li>
	<li>在孵育结束前30分钟，将RNA原位杂交放大剂1（ZZ尾树，用于T1至T4尾）试剂置于室温平衡，以用于步骤5.2。</li>
	<li>孵育完成后，从杂交烘箱中取出湿度控制盘，并取出载玻片架。将盘放回烘箱中。</li>
	<li>将载玻片放入已用NFW预洗过的透明载玻片架中。在1x洗涤缓冲液中轻轻振荡洗涤2分钟。</li>
	<li>在室温下用新鲜的1x洗涤缓冲液重复洗涤步骤，持续2分钟。</li>
</ol>
5. 杂交RNA-ISH扩增剂1
<ol>
	<li>去除切片上的多余液体，将切片放入湿化盘的切片架中。将切片架插入湿化控制盘内。</li>
	<li>涡旋振荡 RNA-ISH 放大剂 1，使其完全覆盖每个组织切片。盖上湿化盘，放入杂交炉中，在 40 °C 下孵育 30 分钟。将 RNA-ISH 放大剂 2（用于 T5 至 T8 尾部的 ZZ 尾树）试剂置于室温，以备第 6.2 步使用。</li>
	<li>从杂交炉中取出湿化控制盘，取出切片架。将湿化盘放回杂交炉中。</li>
	<li>将切片放入已用 NFW 预先清洗过的透明切片架中。在 1x 洗涤缓冲液中轻轻振荡洗涤 2 分钟。</li>
	<li>在室温下，用新鲜的 1x 洗涤缓冲液重复洗涤步骤，持续 2 分钟。</li>
</ol>
6. 杂交 RNA-ISH 放大剂 2
<ol>
	<li>去除切片上的多余液体。将湿度控制托盘从烘箱中取出，把切片架放入托盘中。</li>
	<li>涡旋振荡 RNA-ISH 扩增液 2，并加入覆盖每个组织切片。盖上托盘，放入杂交炉中，在 40 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>将 RNA-ISH 扩增液 3（用于尾部 T9 至 T12 的 ZZ 尾树试剂）置于室温，以备第 7.2 步使用。将切片架从托盘中取出，再将托盘放回烘箱中。</li>
	<li>将切片放入已用 NFW 预先清洗过的透明切片架中。在 1× 洗涤缓冲液中轻轻振荡洗涤 2 分钟。</li>
	<li>在室温下，用新鲜的 1× 洗涤缓冲液重复洗涤步骤，振荡 2 分钟。</li>
</ol>
7. 杂交 RNA-ISH 放大探针 3
<ol>
	<li>去除切片上的多余液体。从烘箱中取出湿度控制托盘，并将切片架放入托盘中。</li>
	<li>涡旋混匀RNA-ISH扩增剂3，使其完全覆盖每个组织切片。盖上托盘，放入杂交炉中，在40 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>孵育期间，准备步骤8所需的金属寡核苷酸混合液。每种寡核苷酸使用浓度为1:15（从10 μM的储备液稀释），确保最终体积足以完全覆盖整个组织切片。充分涡旋混匀，混合后的金属寡核苷酸置于室温下备用。将湿度控制托盘从烘箱中取出，然后将切片架从托盘中移出，随后将托盘放回烘箱。</li>
	<li>将切片放入预先用NFW清洗过的透明切片架中。在1×洗涤缓冲液中轻轻振荡洗涤2分钟。</li>
	<li>在室温下，用新鲜的1×洗涤缓冲液重复洗涤步骤，振荡2分钟。</li>
</ol>
8. 杂交金属寡核苷酸
<ol>
	<li>从载玻片上移除多余的液体。将湿度控制盘从烘箱中取出，并将载玻片架放入盘中。加入步骤 7.3 中配制的混合金属寡核苷酸（使用前涡旋混匀）。</li>
	<li>盖上盘盖，将其放入杂交炉中，在 40 °C 下孵育 45 分钟。</li>
	<li>从杂交炉中取出湿度控制盘，取出载玻片架。将盘放回烘箱中。</li>
	<li>将载玻片放入预先用 NFW 清洗过的透明载玻片架中。在 1x 洗涤缓冲液中轻轻振荡洗涤 2 分钟。</li>
	<li>在室温下，用新鲜的 1x 洗涤缓冲液重复洗涤步骤 2 分钟。</li>
</ol>
9. 金属偶联抗体
<ol>
	<li>为阻断非特异性位点，加入足量封闭缓冲液以覆盖整个组织切片，室温孵育30分钟。</li>
	<li>孵育期间，将抗体（表1）用抗体稀释缓冲液稀释，配制步骤10.1中使用的抗体混合液。</li>
</ol>
10. 金属偶联抗体孵育
<ol>
	<li>封闭缓冲液孵育后，弃去组织切片上的封闭缓冲液，并加入足量的抗体混合液（来自步骤 9.2），以完全覆盖组织切片区。</li>
	<li>将切片置于湿盒中，在 4 °C 下孵育过夜（约 16 小时）。</li>
</ol>
11. DNA 染色
<ol>
	<li>配制新鲜的Ir-嵌入剂溶液。
	<ol>
		<li>从500 µM的储存液中，用无RNase的TBS配制1:2000的工作液。工作液可分装后于-20 °C保存（避免反复冻融）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将切片放入已用NFW预洗过的透明切片架中，用TBS-T缓冲液轻轻振荡洗涤5分钟。</li>
	<li>在TBS-T中重复洗涤一次。</li>
	<li>用Ir工作液（来自步骤11.1.1）在室温下染色5分钟。</li>
	<li>将切片放入已用NFW预洗过的透明切片架中，用TBS-T缓冲液轻轻振荡洗涤5分钟。</li>
	<li>在TBS-T中重复洗涤一次。</li>
	<li>用TBS洗涤两次，每次5分钟（缓慢搅拌）。</li>
	<li>将切片快速浸入ddH2O中，以防止TBS中的盐在组织上结晶。</li>
	<li>在化学通风橱下干燥10分钟，并于4 °C保存直至成像。</li>
</ol>
12. 图像采集
<ol>
	<li>将载玻片装入IMC的消融室中。</li>
	<li>拍摄全景图像以确定感兴趣区域（ROI）。</li>
	<li>在图像采集软件中划定ROI。</li>
	<li>应用采集模板。</li>
	<li>根据样本类型调整激光功率（消融能量），默认设置为0 dB。 
	注意：建议在多个小组织区域（30 µm × 30 µm）上测试消融能量，每次增加1 dB。选择能够清除样本而不灼伤载玻片的最低消融能量。通常情况下，激光功率为3–4 dB。若组织厚度超过建议值，激光功率偶尔需增至5 dB。</li>
	<li>启动激光消融。系统将激光引导至ROI，消融金属标记的蛋白质，产生气溶胶羽流，随后被转移至电感耦合等离子体（ICP）炬管，在等离子体中羽流被汽化、原子化并离子化。</li>
	<li>检测器测量每种同位素的数量，并将其转换为数据。</li>
</ol>

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<li>Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry+under+the+influence+of+pH+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies.</a> J Histochem Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).</li>
<li>Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuncan%2C+JS+%22In+situ+hybridization+methods%22">In situ hybridization methods</a>. , Springer. New York, NY. (2015).</li>
<li>Rivest, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+sequential+immunofluorescence+%28seqIF%29+for+hyperplex+spatial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics.</a> Sci Rep. 13 (1), 1-12 (2023).</li>
<li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+transcriptomics+of+intraductal+papillary+mucinous+neoplasms+of+the+pancreas+identifies+NKX6-2+as+a+driver+of+gastric+differentiation+and+indolent+biological+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential.</a> Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).</li>
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</ol>

Jared K. Burks 是 Standard BioTools 的顾问。

多重多组学是所采集数据的关键演进，旨在研究影响疾病进展和治疗的细胞间及细胞与微环境间的相互作用。在同一样本乃至同一细胞中分析这些数据至关重要，因为许多蛋白质靶标呈瞬时表达，或其mRNA与蛋白质表达水平存在差异，因此将靶向mRNA检测与蛋白质检测相结合，有助于检测那些难以发现或表达差异的靶标21。近年来，RNA原位杂交（RNA-ISH）技术与成像质谱流式技术（IMC）的整合取得了新进展，实现了在同一张组织切片上进行多组学分析22,23,24,25，从而可在单细胞分辨率下直接整合转录组学与蛋白质组学信息。
为确保检测的可靠性，采用 Schultz 等人所述的方法实施了严格的对照策略，最初使用荧光团和金属对探针进行双重标记7。如<stron...

不同患者中的癌症表现出结构和功能上的多样性。由正常细胞和恶性细胞组成的肿瘤微环境（TME）在不同患者之间具有异质性。转移是原发性肿瘤残留物以细胞簇或单个细胞形式逃逸进入血液所致，这为疾病进展和治疗反应提供了线索1,2。这些微环境的复杂性亟需被深入理解1。尽管肿瘤包含多种细胞类型，临床标准仍主要基于单一标志物进行组织学判断，但这一现状正开始改变1,2。多重成像技术为病理学研究提供了新的方向。目前，已可在单细胞或接近单细胞分辨率下实现对人类癌症的空间分辨蛋白质组学、基因组学、代谢组学和脂质组学分析3,4,5,6。
这些技术能够解析肿瘤中异质性细胞的空间定位及其相互作用。采用合适的单细胞生物成像方法，可对患者活检样本中多种与疾病相关的蛋白质生物标志物进行谱型分析，从而为癌症治疗方案的设计提供依据。来自空间细胞图谱的研究见解将有助于指导联合治疗策略的选择，以高效清除肿瘤，同时减少脱靶效应、耐药性和复发。1问题在于如何将这些多种多样的技术整合起来，而这些技术通常在同一组织切片上无法协同工作。7. 本方案在视觉上概述于 图1，能够在同一组织切片和同一细胞中，以高于同时进行的荧光蛋白与RNA原位杂交（fluorescent protein+RNA-ISH）所能实现的多重性，对蛋白质组学和特定mRNA子集进行空间分析8这也可以作为平行分析的桥梁3,4,6，旨在对数据进行解卷积分析。尽管存在双重检测，但仍可观察到某些细胞已快速启动mRNA的合成，然而由于直接标记的一抗检测方法本身灵敏度有限且缺乏信号放大机制，导致分泌的蛋白质无法被检测到，这使得分泌分子的检测尤为困难。以下方案改编自一种12重荧光/显色检测方法，适用于基于金属的检测技术 通过 用于IMC中同时检测的巯基还原修饰探针

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;https://www.protocols.io/view/oligonucleotide-polymer-conjugation-for-imaging-ma-dm6gpjz91gzp/v2.</td><td>Protocols.IO</td><td>dx.doi.org/10.17504/protocols.io.dm6gpjz91gzp/v2</td><td>用于成像质谱流式的寡核苷酸-聚合物偶联 V.2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10x TBS 无RNA酶</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>J62780.K7</td><td>用于各步骤间的间歇性洗涤</td></tr><tr><td>ACD HybEZ II 杂交系统</td><td>ACD Biotechne</td><td>321711</td><td>用于烘烤组织切片的烤箱</td></tr><tr><td>抗体稀释液</td><td>Dako</td><td>S0809&amp;nbsp;</td><td>抗体稀释缓冲液</td></tr><tr><td>抗体：B7-H3</td><td>Bethyl</td><td>A700-025CF, A700-026CF</td><td>克隆号：BLR025F, BLR026F</td></tr><tr><td>抗体：B7-H4</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-5949-82</td><td>克隆号：H74</td></tr><tr><td>抗体：BRD4(6F11)</td><td>Bethyl</td><td>A700-005CF</td><td>克隆号：BL-151-6F11</td></tr><tr><td>抗体：CCR6</td><td>R&amp;D</td><td>MAB195-100</td><td>克隆号：53103</td></tr><tr><td>抗体：CD11b</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>ab209970</td><td>克隆号：EPR1344</td></tr><tr><td>抗体：CD25</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>ab215378</td><td>克隆号：EPR6452</td></tr><tr><td>抗体：CD278/ICOS</td><td>CST&amp;nbsp;</td><td>89601BF</td><td>克隆号：D1K2T</td></tr><tr><td>抗体：CD31</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>ab207090</td><td>克隆号：EPR3094</td></tr><tr><td>抗体：CD33</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>ab238784</td><td>克隆号：SP266</td></tr><tr><td>抗体：CD3e&amp;nbsp;</td><td>CST</td><td>85061BF</td><td>克隆号：D7A6E</td></tr><tr><td>抗体：CD4</td><td>Abcam</td><td>ab181724</td><td>克隆号：EPR6855</td></tr><tr><td>抗体：CD44</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>MA1-10225</td><td>克隆号：IM7</td></tr><tr><td>抗体：CD45</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-9457-82</td><td>克隆号：CD45-2B11</td></tr><tr><td>抗体：CD8a</td><td>CST&amp;nbsp;</td><td>85336BF</td><td>克隆号：D8A8Y</td></tr><tr><td>抗体：CXCL13</td><td>R&amp;D</td><td>AF801</td><td>克隆号：多克隆</td></tr><tr><td>抗体：CXCR5</td><td>R&amp;D</td><td>MAB190-100</td><td>克隆号：CXCR5</td></tr><tr><td>抗体：gamma-H2AX</td><td>Bethyl</td><td>A700-053CF</td><td>克隆号：BLR053F</td></tr><tr><td>抗体：颗粒酶B</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8022 x</td><td>克隆号：2C5</td></tr><tr><td>抗体：KAP1</td><td>Bethyl</td><td>A700-014CF</td><td>克隆号：BL-248-2G6</td></tr><tr><td>抗体：Ki67</td><td>Bethyl</td><td>A700-021CF</td><td>克隆号：BLR021E</td></tr><tr><td>抗体：LCK&amp;nbsp;</td><td>CST</td><td>2984BF</td><td>克隆号：D88</td></tr><tr><td>抗体：MFAP5</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PMID: 31332047 / 克隆号：130A&amp;nbsp;（注：定制设计）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗体：SMA</td><td>CST</td><td>56856BF</td><td>克隆号：1A4</td></tr><tr><td>抗体：VEGF</td><td>STB-Fluidigm</td><td>3163028D</td><td>克隆号：G153-494</td></tr><tr><td>抗体：VISTA</td><td>CST</td><td>64953BF</td><td>克隆号：D1L2G</td></tr><tr><td>AZ-AR1 Elegance Citra&amp;nbsp;</td><td>BioGeneX</td><td>HK546-XAK</td><td>抗原修复缓冲液</td></tr><tr><td>100% 乙醇（200 proof）</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td>用于脱蜡</td></tr><tr><td>EZ &amp;ndash; Retriever IR</td><td>BioGeneX</td><td>MW016-IR</td><td>用于FFPE组织切片的抗原修复系统</td></tr><tr><td>HybEZ II 杂交系统</td><td>ACD Biotechne</td><td>321710</td><td>系统组成：HybEZ烤箱（货号 321710/321720）、湿度控制托盘（货号 310012）、HybEZ加湿纸（2张，货号 310025）、EZ-Batch洗涤托盘（货号 321717）、EZ-Batch切片架（货号 321716）</td></tr><tr><td>ImmEdge 疏水屏障PAP笔&amp;nbsp;</td><td>VectorLabs</td><td>H-4000</td><td>疏水屏障笔</td></tr><tr><td>Ir嵌入剂溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>NC1038184</td><td>用于识别有核细胞</td></tr><tr><td>KERATIN 8/18</td><td>CST&amp;nbsp;</td><td>4546BF</td><td>克隆号：C51</td></tr><tr><td>金属寡核苷酸</td><td>多种</td><td>多种</td><td>金属标签从T1到T12不等，根据需要选择</td></tr><tr><td>无核酸酶水（NFW）</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>46-000-CM&amp;nbsp;</td><td>用于清洁和准备所有设备，必要时作为稀释剂使用</td></tr><tr><td>RNAscope蛋白酶Plus&amp;nbsp;</td><td>ACD Biotechne</td><td>322331&amp;nbsp;</td><td>用于通透样本的细胞膜</td></tr><tr><td>RNAscope EZ-Batch切片架</td><td>ACD Biotechne</td><td>310017</td><td>设计用于高效手动批量处理最多20张切片</td></tr><tr><td>RNAscope HiPlex12试剂盒 v2&amp;nbsp;</td><td>ACD Biotechne</td><td>324409</td><td>RNAScope用试剂</td></tr><tr><td>RNAscope HiPlex探针 - 靶标探针</td><td>ACD Biotechne</td><td>各种</td><td>根据需要选择T1至T12范围内的探针</td></tr><tr><td>RNaseZap RNase去污染溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9782</td><td>一种可破坏RNase的表面去污染溶液</td></tr><tr><td>染色架显微镜切片篮式支架 24位 耐化学塑料</td><td>Optimal Scientific</td><td>3028</td><td>用于对多个切片进行染色</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>AAJ20605AP</td><td>用于各步骤间的间歇性洗涤</td></tr><tr><td>Ultravision 蛋白封闭液</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>TA125PBQ</td><td>封闭缓冲液</td></tr></tbody></table>

双模态分子图谱：整合多重mrna检测与蛋白质成像质谱流式技术

Dual-modality Molecular Cartography: Integrating Multiplex mRNA Detection with Protein Imaging Mass Cytometry

在同一检测中实现蛋白质和 mRNA 的共检测，有助于我们理解细胞如何为到达特定位置进行预准备，以及在迁移和与周围环境相互作用时接收哪些信号线索。当前高重成像技术已能够同时对空间分辨的 mRNA（空间转录组学）和蛋白质（空间蛋白质组学）进行表征。为避免重复分析，这些分析物可在同一张组织切片中完成检测。尽管已有多种技术可实现多蛋白与少数 mRNA 或相反情况的检测，但由于蛋白质是细胞功能的核心执行分子，本论文重点聚焦于将蛋白质成像质谱流式技术（IMC）与 mRNA 检测相结合。 原位 利用金属探针的原位杂交（ISH）。这使我们能够了解细胞在其微环境中准备传递或正在快速向外界发送哪些信息。同时，该方法克服了仅使用抗体检测分泌蛋白或难以检测的标志物时所面临的局限性，这些标志物通常难以定量和可视化。此外，本方案减少了高重荧光方法中常见的补偿调节或后期处理需求，因为基于金属探针的检测系统不存在荧光光谱溢出问题，也无需考虑组织特异性自发荧光。

在同一项检测中实现蛋白质和 mRNA 的同步检测，有助于我们理解细胞在到达特定位置前的准备状态，以及其在迁移和与环境相互作用过程中所接收到的信号。如代表性数据所示，mRNA 与蛋白质检测是空间生物学研究中的关键环节，因为检测的下限往往受到标记、检测和/或成像步骤流程的限制，具有较大挑战性。仅蛋白酶的引入就可能使联合实验方案中的关键标志物变得复杂，因此，设置重复实验不仅有助于阐明结果，也具有验证意义。
本方案介绍了一种包含28种金属偶联抗体和12种mRNA探针的检测方法（表1）。如图2所示，CD8 T细胞的活化状态具有多样性，可通过不同标志物的组合进行评估。这些组合可用于表征具有不同活化水平的各类细胞亚群。图2A显示一个活化的CD8 T细胞在mRNA和蛋白质水平均表达颗粒酶B，并且表达干扰素γ（IFN-γ）；图2B显示另一个活化的CD8 ...

本方案详细介绍了在福尔马林固定石蜡包埋组织切片中进行多重 mRNA 检测结合蛋白质成像质谱流式技术的方法学。

双模态分子图谱：整合多重mRNA检测与蛋白质成像质谱流式技术

在同一项检测中同时分析蛋白质和mRNA的能力有助于我们理解细胞如何为某种到达做准备，以及在此过程中接收到哪些信号提示……

我们专注于特殊生物学研究，以进一步了解卵巢癌的分子机制，希望发现新的治疗靶点和生物标志物，用于预测患者生存率。目前成像质谱流式（IMC）技术面临的一些挑战包括低丰度蛋白的解析、抗体验证与滴定的工作量，以及分析过程中复杂且耗时的像素分类。首先，从制备好的FFPE切片上移除多余的液体。从烘箱中取出湿度控制托盘，将载玻片架放入托盘中。然后充分涡旋振荡 RNA-ISH 扩增剂 3，加入足量试剂以完全覆盖载玻片上的每张组织切片。盖上托盘，放入杂交烘箱中，在 40 °C 下孵育 30 分钟。孵育期间，通过将每种寡核苷酸按1:15的比例稀释来配制金属寡核苷酸混合液。充分涡旋振荡金属寡核苷酸混合液，室温下放置备用。现在，从烘箱中取出湿度控制托盘。将载玻片架从托盘中取出，并将托盘放回烘箱中。然后，将载玻片放入已用无核酸酶水预清洗过的透明载玻片架中。在轻微振荡条件下，用洗涤缓冲液洗涤载玻片2分钟。从载玻片上除去多余液体后，将湿度控制托盘从烘箱中取出，并将载玻片架放入托盘中。加入先前配制的混合金属寡核苷酸，以完全覆盖每个组织切片。然后，将托盘完全封闭，并放入杂交炉中，在 40 摄氏度下孵育 45 分钟。从杂交炉中取出湿度控制托盘，拿出切片架，并将空托盘放回炉内。为阻断非特异性结合位点，加入足量的封闭缓冲液以完全覆盖载玻片上的每张组织切片，并在室温下孵育30分钟。在切片孵育的同时，使用抗体稀释缓冲液稀释抗体，配制抗体混合液。孵育结束后，弃去组织切片上的缓冲液，加入足量预先配制的抗体混合液，完全覆盖组织切片。随后将切片放入湿盒中，在4摄氏度下孵育过夜。为配制新鲜的铱嵌入剂溶液，使用无RNase的TBS将500微摩尔的储存液按1:2,000稀释。将切片放入已用无核酸酶水预洗过的透明切片架中，用TBS-T缓冲液轻轻振荡洗涤五分钟。然后，向切片中加入配制好的铱工作液进行染色，在室温下孵育五分钟。之后，将切片转移至另一个已用无核酸酶水预洗过的透明切片架中。用 TBS-T 缓冲液轻轻振荡洗涤载玻片两次，每次五分钟。然后将载玻片迅速浸入重蒸水中，以防止组织上残留 TBS 中的盐结晶。将载玻片在化学通风橱中干燥 10 分钟，并于 4 摄氏度保存，直至进行图像采集。将制备好的载玻片放入成像质谱流式系统的消融室中。对载玻片拍摄全景图像以确定目标区域。使用图像采集软件在全景图像上标记所需的目标区域。在图像采集软件中应用采集模板，并根据样本类型调整激光功率。现在，开始激光消融过程。使用检测器测量每种同位素的数量，检测器将数据转换为数字形式以供分析。通过在 mRNA 和蛋白质水平上共检测颗粒酶 B 以及干扰素-γ 阳性，评估 CD8 T 细胞的活化状态。结果显示，一种癌症相关成纤维细胞表达 MFAP5 蛋白和 POSTN mRNA，二者均为癌症相关成纤维细胞侵袭性的标志物。显示一个CD4 T细胞共表达IL17A和IL6 mRNA，符合TH17细胞特征。观察到CD4 T细胞表达IL13 mRNA。在CD8 T细胞附近发现角蛋白阳性且CD47阳性的肿瘤细胞。已证明活化的CD8 T细胞表达CD25蛋白。在金属偶联和荧光标记方案之间，THBS2和CD47的mRNA染色结果相当。

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Cancer Research

癌症研究

双模态分子制图学：将多重 mRNA 检测与蛋白质成像质谱细胞术相结合

免疫组织化学是一种用于评估组织内蛋白质定位和表达的强有力实验技术。目前用于定量的半自动化方法往往引入主观性，并常导致结果不可重复。本文中，我们描述了多重免疫组织化学的方法，以及利用多光谱成像对蛋白质表达和共定位进行客观定量的技术。...

使用多重免疫组织化学染色与多光谱成像定量蛋白质表达及共定位

我们展示了一种利用荧光标记抗体的连续结合与洗脱，以单分子精度对异质纳米结构内多种分子进行成像的方法。...

使用 madSTORM 对 T 细胞进行高度多重化的超分辨率成像

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

本文介绍了一种针对空间组学技术中感兴趣区域（ROIs）进行精细优化的实验方案，以更准确地表征肿瘤微环境并鉴定特定的细胞群体。对于蛋白质组学检测，可采用自动化的定制化流程来指导ROIs的选择；而在转录组学检测中，则可利用小至50...

组织中蛋白质与RNA表达的空间分析：优化虚拟显微切割的一种方法

在癌症免疫治疗时代，人们对阐明肿瘤微环境动态的研究兴趣显著增加。本方案详细介绍了质谱成像技术的染色和成像步骤，可实现高度多重的空间分析。...

利用质谱成像技术分析福尔马林固定石蜡包埋组织样本以拓展对肿瘤微环境的理解

多重条形码成像分析技术最近显著改进了对肿瘤微环境的表征，使得能够全面研究细胞组成、功能状态以及细胞间相互作用。本文中，我们描述了一种染色与成像方案，该方案利用寡核苷酸偶联抗体的条形码技术和循环成像，从而实现高维成像 分析技术的应用。...

用于石蜡组织样本单细胞分析中免疫谱型与空间定位特征的多重条形码图像分析

本方案概述了一种全面的质谱流式细胞术（飞行时间质谱流式细胞术...

肝细胞癌中系统性与局部免疫应答的质量细胞术分析

本报告介绍了一种在自动化载片染色机上进行多重免疫荧光（mIF）检测的自动化方案。该方案展示了在标准高通量组织自动染色机和全片荧光成像系统上实现空间蛋白质组学的高度可重复性，非常适合在转化研究中对大量组织切片进行定制化的mIF检测。...

用于转化研究的高通量自动化多重免疫荧光检测方法

本方案提供了针对基于DNA条形码成像的小鼠FFPE黑色素瘤组织，设计多重免疫荧光抗体组合的逐步操作指南。我们还描述了使用开源工具进行图像分析的流程，以获得关于小鼠黑色素瘤肿瘤免疫微环境的空间蛋白质组学见解。...

基于DNA条形码的多重免疫荧光成像分析基因重编程小鼠黑色素瘤的福尔马林固定石蜡包埋样本

肿瘤细胞的原位颅内注射已广泛应用于癌症研究，以探讨脑肿瘤的生物学特性、进展过程、演化规律及治疗反应。本文介绍了肿瘤异种移植模型的荧光分子断层成像技术，该技术可实现临床前胶质母细胞瘤模型中肿瘤组织的实时活体成像与定量分析。...

荧光分子断层成像技术 在体 内 胶质母细胞瘤异种移植瘤的成像

学习多重mRNA检测与蛋白质成像质谱细胞术相结合的双模态分子制图学方法，用于卵巢癌分子机制研究。该技术有助于发现新的治疗靶点和预测患者生存的生物标志物。

双模态分子图谱：整合多重mRNA检测与蛋白质成像质谱流式技术

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