October 31st, 2025
本文提出了一种协议,用于使用 Stereo-seq 对福尔马林固定石蜡包埋组织切片的宿主、病毒、真菌和微生物组 RNA 进行全面的空间转录组学分析,该协议能够对各种转录组进行高分辨率映射,同时保留组织结构。
我们的研究重点是详细表征卵巢肿瘤微环境,以识别具有预测性和治疗性的生物标志物。例如,我们希望找到预测化疗反应和抗药性的标志物,或为二线治疗寻找新的治疗靶点。实验挑战包括样品处理、样品质量评估以及样品处理时间长度。
在数据分析方面,挑战包括数据稀疏度(类似其他单单元流程)以及区域的映射,尤其是重复区域。在取出立体声序列N芯片包装后,记录芯片识别号。不要接触N芯片表面,用100%乙醇清洁玻璃玻片。
使用微型移液器,小心地在立体测序N芯片边缘涂抹10微升紫外固化陶瓷树脂。用密封泡沫棉棒去除多余树脂,只留下一条细线在剥皮边缘。将滑套放入紫外线固化装置中,确保芯片表面不被触碰。
现在将树脂覆盖的芯片放在405纳米紫外光源上的不透明面罩上,照射玻片背面,并固化五分钟。固化后,使用密封泡沫棉棒浸泡于100%分子级乙醇、70%乙醇,最后用无核酸酶水清洗树脂边缘。用50毫升的锥形管将芯片浸泡在新鲜无核酸酶水中三次。
利用压缩空气,以大约60到80度的角度将芯片吹干,从大约五厘米外斜向移动。接着,均匀涂抹150微升聚L-赖氨酸溶液,并在室温下培养10分钟。然后将聚L-赖氨酸溶液从芯片中取出。
第二次清洗后,小心擦干滑套边缘,但不要接触到切屑表面。如前所述,用压缩空气将芯片牢固干燥。切片FFPE组织时,不要直接接触芯片,只用组织覆盖80%。
在SSC缓冲液中制备两微升单链DNA染色溶液时,将Qubit单链DNA试剂稀释为5倍SSC缓冲液。用1至20稀释的核糖核酸酶抑制剂、1至200稀释的单链DNA溶液,以及剩余体积用5倍SSC缓冲液,制作染色溶液的主混合。向每个芯片加入150微升染色液,并在室温黑暗中孵育五分钟。
然后用吸液器轻轻去除每个缺口角落的染色液。用0.1X SSC缓冲液清洗芯片两次,持续10到15秒后,小心地擦干滑套边缘。在载玻片上加入大约三到五微升的甘油以安装。
从滑套上方约一厘米处放下盖片,保持水平,确保它不接触芯片表面。使用广视场显微镜拍摄单链DNA染色组织的荧光图像,确保图像瓷砖间有10%的重叠。在图像处理软件如ImageJ中,先利用理论重叠生成近似瓦片位置,然后应用像素匹配计算重叠以微调拼贴,从而拼接获得的图像。
在StereoMap软件中处理拼接后的图像,确认图像质量控制通过后再继续。将立体序列滑片浸入30毫升0.1X SSC缓冲液中,直到盖片脱落。确保FFPE脱联试剂处于室温并检查其颗粒。
打开热循环器,设定为30摄氏度以实现平衡,95摄氏度以维持30分钟孵化,无限保持在4摄氏度。组装盒式盒垫,将立体声序列芯片滑块放入盒式磁带。然后将FFPE脱联试剂加入立体测序载玻片盒的槽,封闭胶带并确认磁带密封。
在95摄氏度开始30分钟的孵化。10分钟后,将25毫升甲醇放入50毫升容器中,放入20摄氏度的冷冻室,每片约一毫升用于后续使用。取出热循环器中的芯片后,将滑套盒转移到工作台上,撕下密封胶带。
使用移液器,将盒中的FFPE去交联试剂取出并丢弃。试剂完全清除后,拆下盒和垫圈并丢弃。在无菌排气罩下,干燥滑套边缘,必要时更换硅胶腔室。
从20摄氏度冷冻室中加入500微升冰镇甲醇,确保整个区域浸没。在使用前,将PR溶液预热10分钟,置于37摄氏度的干块上。固定后,在排气柜内擦拭滑套上多余的甲醇,等待芯片上剩余的甲醇蒸发。
组装一个新的飞轮端垫。蒸发完成后,将立体声编排芯片滑块放入磁带中。向芯片中加入200微升预热渗透试剂。
在立体声序列幻灯带上贴上密封胶带,并确保密封紧密。按照此处步骤进行逆转录,然后释放和纯化CDNA。将无核酸酶水预热至37摄氏度。
把芯片上的密封件拆掉。在缺口的每个角落和中心用力移液,覆盖组织,切勿刮擦或触碰。收集芯片中所有互补的DNA释放混合物,并将其转移到1.5或2.0毫升的离心管中。
直接在芯片表面加入350微升预热的无核酸酶水。用较小的移液器用力移液,倾斜尖端以施加纯粹力量,同时避免接触组织或刮伤缺口。将洗涤液与之前收集的400微升互补DNA释放混合物结合,确保仅混合单个芯片的物质。
在芯片上放100微升无核酸酶水。封好立体测序切片,存放在冰箱中直到协议结束。利用SAW管线实现了FFPE切片的单细胞切段,实现了对非多腺苷酸化RNA(如tRNA、TRDMT1)的定位。
使用专有软件StereoMap进行交互式空间可视化,显示了假定的细胞类型,聚集物以不同颜色显示在组织的放大区域。使用StereoPi观察了非多腺苷酸化RNA TRDMT1的全组织表达。该方案的调整解决了我们在脂肪和脆弱组织全转录组空间剖析中存在的问题,改善了组织粘附、RNA可及性以及对这些复杂组织类型的立体测序处理。
目前,立体测序比其他空间转录组方法分辨率更高,分辨率为500纳米,而仅为2微米。它还提供了研究微生物组、病毒和非多腺苷化转录本所需的无偏捕获。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
本文介绍了一种协议,利用Stereo-seq对福尔马林固定石蜡包埋组织切片进行宿主、病毒、真菌和微生物组RNA的全面空间转录组分析,该方法能够在保持组织结构的同时实现多样化转录组的高分辨率映射。
Stereo-seq enables comprehensive spatial transcriptomic profiling of both host and non-host RNA species in FFPE tissues, addressing a critical gap in unbiased, high-resolution mapping of cellular and microbial transcriptomes. This capability supports predictive confidence in target validation and biomarker discovery, particularly in complex tissue microenvironments such as tumors. The method's species-agnostic approach enhances portfolio decision-making by revealing intra- and inter-actome interactions relevant to therapeutic development.
Stereo-seq integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatially resolved, species-agnostic transcriptomic profiling from FFPE tissues, supporting both early discovery and translational research inflection points.