跨物种转录组的全面空间剖析 通过 Stereo-seq

我们的研究致力于详细表征卵巢肿瘤微环境，以鉴定具有预测性和治疗性的生物标志物。例如，我们希望发现能够预测化疗反应与化疗耐药性的标志物，或为二线治疗提供新的治疗靶点。实验中的挑战包括样本处理、样本质量评估以及样本处理所需的时间长度。

在数据分析方面，挑战包括数据稀疏性问题，这与其他单细胞测序技术类似，以及区域定位的困难，尤其是重复区域的比对。从包装中取出立体测序 N-Chip 后，记录芯片识别编号。切勿触碰 N-Chip 表面，使用 100% 乙醇清洁载玻片。

使用微量移液器，小心地将 10 微升紫外光固化陶瓷树脂涂抹在立体测序 N-芯片的边缘。用密封的泡沫拭子去除多余的树脂，仅在芯片边缘留下一条细线。将载玻片放入紫外光固化装置中，确保不触碰芯片表面。

现在将涂有树脂的芯片放置在405纳米紫外光源上的一块不透光掩膜上，从载玻片背面进行照射，并固化5分钟。固化后，使用浸有100%分子级乙醇的密封泡沫棉签，随后用70%乙醇，最后用无核酸酶水，清洁树脂涂覆边缘周围区域。将芯片置于50毫升锥形管中的新鲜无核酸酶水中，浸没清洗三次。

使用压缩空气，以约五厘米的距离、与表面呈60至80度角，用最大气流强度对芯片表面进行对角吹干。接着，将150微升多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）溶液均匀覆盖在整个芯片表面，在室温下孵育10分钟。随后，将芯片上的多聚赖氨酸溶液移除。

第二次洗涤后，小心擦干载玻片边缘，避免接触芯片表面。使用压缩空气彻底干燥芯片，操作方法如前所述。在切取FFPE组织时，切勿直接触碰芯片，且组织覆盖芯片面积不得超过80%。

在 SSC 缓冲液中配制 2 微升单链 DNA 染色溶液时，需将 Qubit 单链 DNA 试剂用 5X SSC 缓冲液稀释。通过将核糖核酸酶抑制剂按 1:20 稀释、单链 DNA 溶液按 1:200 稀释，并用 5X SSC 缓冲液补足剩余体积，配制染色溶液的主混合液。向每张芯片中加入 150 微升染色溶液，在室温下避光孵育 5 分钟。

然后用移液器从每张芯片的角落轻轻吸除染色液。用 0.1X SSC 缓冲液将芯片清洗两次，每次 10 至 15 秒，随后小心地将载玻片边缘干燥。在载玻片上加入约 3 至 5 微升甘油以封片。

将盖玻片从约一厘米高处水平下落至载玻片上，确保其不接触芯片表面。使用宽场显微镜对单链DNA染色的组织进行荧光成像，图像拼接区域需保证10%的重叠。在图像处理软件（如ImageJ）中拼接所获得的图像，首先利用理论重叠值生成近似的图像块位置，然后通过像素匹配的计算重叠方法精细调整拼接。

在 StereoMap 软件中处理拼接图像，并确认图像质量控制通过后再继续操作。将立体测序玻片浸入 30 毫升 0.1X SSC 缓冲液中，直至盖玻片脱落。确保 FFPE 去交联试剂处于室温，并检查是否存在颗粒物。

打开热循环仪，将其设置为30摄氏度以平衡温度，95摄氏度孵育30分钟，以及4摄氏度无限期保存。组装卡盒垫圈，并将立体测序芯片载玻片放入卡盒中。然后将FFPE去交联试剂加入立体测序载玻片卡盒的孔中，对卡盒贴上封膜，并确认其已紧密密封。

在95摄氏度下开始30分钟的孵育。10分钟后，将25毫升甲醇放入50毫升容器中，并置于20摄氏度的冰箱中，为后续使用每张载玻片准备约1毫升甲醇。从热循环仪中取出芯片后，将载玻片盒转移至实验台，并撕下密封胶带。

使用移液器移除并弃去包埋盒中的石蜡去除试剂。完全去除试剂后，取下包埋盒和垫圈并弃去。在无菌通风橱内，将载玻片边缘干燥，必要时安装新的硅胶腔室。

从 20 °C 冰箱中加入 500 µL 冰冻甲醇，确保整个切片完全浸没。使用前将 PR 溶液在 37 °C 干式恒温块中预热 10 分钟。固定后，在通风橱中用纸巾吸去载玻片上多余的甲醇，并等待芯片上残留的甲醇完全挥发。

组装一个新的盒式末端垫圈。蒸发完成后，将立体测序芯片载玻片放入盒式架中。向芯片加入 200 微升预热的透化试剂。

将密封胶带贴在立体测序载玻片盒上，并确保其密封紧密。按照此处所示步骤进行逆转录，然后进行cDNA释放和纯化。将无核酸酶水预热至37摄氏度。

从芯片上移除封膜。在不刮擦或接触组织的情况下，用力在芯片的每个角落及中心区域上方移液。收集芯片上所有的互补DNA释放混合液，并转移至1.5或2.0毫升离心管中。

将350 µL预热的无核酸酶水直接加入芯片表面。使用较小的移液枪剧烈吹打，倾斜枪头以施加剪切力，同时避免接触组织或刮擦芯片表面。将洗涤液与先前收集的400 µL互补DNA释放液混合，确保仅合并来自同一芯片的材料。

在芯片上加入100微升无核酸酶水。密封立体测序载玻片，并在完成整个实验流程前将其保存在冰箱中。利用SAW流程对FFPE切片进行单细胞分割，从而实现了对非多聚腺苷酸化RNA（如tRNA、TRDMT1）的定位分析。

利用 proprietary 软件 StereoMap 进行交互式空间可视化，展示了组织放大区域中以不同颜色显示的各类推定细胞类型。使用 StereoPi 可视化非聚腺苷酸化 RNA TRDMT1 在整个组织中的表达。本实验方案的改进措施针对我们在对脂肪性和脆弱组织进行全转录组空间分析时遇到的问题，通过增强组织粘附性、提高 RNA 可及性以及优化此类难处理组织在 stereo-seq 中的操作流程，实现了更优的分析效果。

与目前其他空间转录组学方法相比，Stereo-seq 具有更高的分辨率，其分辨率达到 500 纳米，优于两微米的水平。此外，该技术还能实现无偏倚捕获，适用于微生物组、病毒以及非多聚腺苷酸化转录本的研究。