Name: 进入啮齿动物脊髓的硬膜下空间进行治疗 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 了解硬膜下导管植入技术，用于直接向啮齿动物脊髓损伤组织输送治疗药物。该方法绕过血脊髓屏障，提高疗效，为脊髓损伤再生医学研究提供可靠手术方案。

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本工作由 CatWalk 脊髓损伤基金会和 HRC 查尔斯·赫卡斯研究奖学金（BH）资助。本工作还得到了美国国防部卫生事务副部长办公室的支持，并由国防部认可，通过脊髓损伤研究计划（资助编号 HT9425-23-1-0492）提供金额为 534,258 美元的资金支持。图 2A 和 图 3A 中的示意图使用 Biorender.com 生成。&#160;本出版物中使用的生物电子器件由查尔姆斯理工大学的 Maria Asplund 博士和 Lukas Matter 设计并提供。

所有操作均按照奥克兰大学的伦理准则进行，并获得了该校动物伦理委员会（AEC）和大学动物福利官员（AWO）的批准。实验选用体重为240–260 g的雌性Sprague-Dawley大鼠，群体饲养（21 °C；12 h:12 h明暗循环），术前和术后可自由摄取标准啮齿类动物饲料。建议首先在不建立损伤模型的情况下尝试本方案，目的是安全地进入啮齿类动物脊髓的硬膜下腔。这是关键的第一步，用以证明该方案可在不造成损伤的情况下实施，从而更准确地研究目标损伤模型。本方案适用于与各研究团队使用的多种不同损伤模型相结合。因此，本方案未描述特定的损伤操作步骤，因为这些步骤将根据具体应用而有所不同。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 术前准备
<ol>
	<li>对所有器械（补充图1）及相关耗材进行灭菌处理。</li>
	<li>称量次日将接受手术的大鼠体重。</li>
	<li>计算所需给药的适当剂量：布比卡因（镇痛剂），2 mg/kg，剂量为 0.08 mL/100 g；美洛昔康（镇痛剂），2 mg/kg，剂量为 0.04 mL/100 g；丁丙诺啡（镇痛剂），0.03 mg/kg，剂量为 0.1 mL/100 g；恩诺沙星（抗生素），10 mg/kg，剂量为 0.08 mL/100 g12,13。 
	注意：布比卡因在首次切口前，于手术区域沿切口线皮下注射3-4个位点。</li>
</ol>
2.&#160;手术准备
<ol>
	<li>确保麻醉系统已正确安装（检查与氧气和麻醉系统相关的所有管路是否正确连接）。</li>
	<li>根据大鼠体重准备所需注射药物，以及在操作开始前给予的 3 mL 生理盐水注射液。</li>
	<li>确保加热垫（维持温度 37 °C）、照明灯、显微镜和剃毛器均已安装并可正常工作。 
	注意：解剖显微镜无需特定放大倍数，因为放大倍数将根据用户偏好和操作过程中的可视性而调整。 
	注意：操作过程中应确保动物体温不低于 35°C 且不超过 40°C</li>
</ol>
3. 动物准备
<ol>
	<li>确保与麻醉系统和氧气罐相关的所有管路均已连接。若使用本研究中所用的麻醉系统（参见材料表），将异氟烷诱导浓度设为3%，并将动物体重输入麻醉系统，以设定维持麻醉所需的氧气流速（补充图1A）。 
	注意：保持适合每只动物个体的维持麻醉水平，该浓度可能因动物而异，通常在1.3%–2%之间。</li>
	<li>将大鼠放入诱导室，直至其失去自我调节体位的能力，随后切换至所需的异氟烷维持浓度，并将大鼠转移至鼻罩。</li>
	<li>在剃毛前，皮下注射3 mL生理盐水及所需药物。 
	注意：在生理盐水注射和剃毛后，沿预定切口线的多个位置注射布比卡因。</li>
	<li>在监测动物麻醉深度的同时，于手术区域准备好所有器械（显微镜、工具、无菌巾），在指定区域铺好无菌器械巾，并将器械有序摆放于其上，保持无菌环境。</li>
	<li>剃除动物背部从颈部基部至髋部顶端的毛发。</li>
	<li>使用氯己定清洗液（4% w/v 葡萄糖酸氯己定）对术区进行消毒，随后使用氯己定酊剂（0.5% w/v 葡萄糖酸氯己定和70% v/v 乙醇），以从剃毛区域中心向外画圆的方式重复操作三次，并在眼睛上涂抹润滑剂以防止干燥。</li>
	<li>将大鼠转移至显微镜下的加热垫上，在剃毛区域覆盖一层压边密封巾，并剪开一个足够大以暴露手术视野但又不至于暴露未剃毛区域的孔。</li>
	<li>插入直肠温度探头以监测动物体温，并通过加热垫维持体温在约37 °C。每5–10分钟进行一次动物福利检查。</li>
	<li>实施足底反射测试以确认动物已达到手术麻醉平面，随后开始手术操作。</li>
</ol>
4. 脊柱组织解剖
<ol>
	<li>使用手术刀片，从颈部基部下方开始，沿头侧至尾侧方向做一条直线切口（约6-8 cm）（图2A），延伸至胸背部隆起区域，暴露T9-T13椎体。</li>
	<li>用格拉夫镊子或微型弹簧剪轻轻拨开切口下方的结缔组织，直接暴露脊柱上的肌肉组织。</li>
	<li>通过寻找切口尾侧半段附近的两条白色V形肌腱来确定T13棘突的位置；在动物尾侧方向，位于V形结构头侧的棘突即为T13（图2B）。</li>
	<li>从T13开始向上至T9，在每两个棘突之间的结缔组织上做小切口，先分离各棘突间的组织，以便在清除肌肉过程中保持解剖定位（图2C）。随后使用微型刮匙在棘突两侧的肌肉上切出平行于棘突的沟道。在脊柱两侧均进行此操作，以暴露每个脊髓节段的椎板（图2D）。</li>
	<li>在肌肉壁两侧安装止血夹，以维持对脊柱区域的开放视野。分别在T13两侧、T11/T12交界处以及T11/T10交界处各安装一对止血夹（图2E）。</li>
	<li>当清晰的沟道形成后，使用显微剪刀或咬骨钳切除各棘突之间的结缔组织（图2F）。</li>
	<li>继续清理沟道，直至从T13头侧至T9尾侧的每个椎板上的结缔组织和肌肉均被干净地剥离，从而暴露T10-12节段，为椎板切除术做好准备。手术成功的标志是棘突两侧的椎板清晰可见。 
	注意：第4步无需使用显微镜，但强烈建议使用。</li>
</ol>
5. 椎板切除术
<ol>
	<li>定位与 T13 椎体头侧部分重叠的 T12 椎板尾侧区域，将咬骨钳尖端置于其下方，并按照 JoVE 标准操作规程的建议，轻柔地开始逐块去除椎板14,15 (图 2G). 
	注意：使用镊子夹住每块椎板的棘突以保持稳定，并轻柔操作 &#34;抬起&#34; 使用咬骨钳每次切割时的骨板（图 2G滑动咬骨钳尖端至椎板下方时，应保持向外远离脊髓的压力，以尽量减少可能的损伤。 
	注意：使用咬骨钳进行切割时，切勿过度深入下方，以免损伤硬脊膜和/或脊髓本身。</li>
	<li>从一侧向另一侧移动，持续切除T12椎板的骨质，直至有足够的空间将切口延伸至棘突中线，暴露脊髓，形成一个直径约5 mm的孔洞（图 2H). 
	注意：从脊柱去除骨骼可能导致出血，从而降低手术过程中的视野清晰度。使用棉签或卷状无绒擦拭纸（补充图1B) 在进行椎板切除术时用于管理此情况。</li>
	<li>将咬骨钳插入两侧椎板下方，然后向T12的颅侧部分清理出一条均匀的通道（图 2I). 
	注意：随着每个脊髓节段的椎板部分被移除，脊髓将逐渐显露。</li>
	<li>重复步骤 5.1 至 5.3，以移除 T11 和 T10。</li>
	<li>继续进行椎板切除术，保持两侧切口均匀，向头侧延伸至T9图2J). 
	注意：对于挫伤性脊髓损伤（SCI）操作（参见代表性结果部分），需要清除目标脊髓节段上方足够宽的椎板，以便使用挫伤损伤装置（参见中部扩大的区域） 图 2K）。对于药物递送，椎板切除的范围只需足够宽以观察目标化合物的应用即可。</li>
	<li>轻柔地用生理盐水冲洗硬脊膜囊，并在完成椎板切除、充分暴露T10-T12节段后，准备进行硬脊膜切开术图2K). 
	注意：该操作专门用于暴露脊髓节段（T10-T12），但这些方法也可用于在脊柱不同节段进行椎板切除术。</li>
</ol>
6. 硬脑膜切开以进行治疗应用
<ol>
	<li>使用解剖显微镜进行硬脊膜切开术（硬脊膜切口），以进入脊髓的硬膜下腔（图3A）。 
	注意：根据术者对硬脊膜可视化的偏好调整显微镜放大倍数。</li>
	<li>将27号针头弯成90度角，针尖斜面朝上（图3B）。 
	注意：弯曲针头时，使用持针器或止血钳夹持针体。</li>
	<li>用针尖在脊髓预定穿刺点轻柔刺破硬脊膜（图3B）。 
	警告：注意避免损伤下方的脊髓组织或其中线血管。</li>
	<li>一旦刺破硬脊膜，轻柔地将针头向背侧抬起，在中线血管两侧撕开一个直径不超过2 mm的圆形小孔。成功的硬脊膜切开表现为有少量脑脊液（CSF）从小孔渗出。 
	注意：切口位置应距离椎板切除术末端至少几毫米，以便更易进入硬膜下腔。如有必要，可小心地将针尖重新插入初始穿刺孔以扩大孔径。</li>
	<li>确保所选硬脊膜切口位置及其前方区域无中线血管的分支血管通过。 
	警告：切勿损伤中线血管，否则将导致大量出血，影响手术完成。</li>
	<li>利用硬脊膜上的小孔，将所需治疗物质注入或植入装置置入硬膜下腔。在本方案中，使用鞘内导管输送治疗物，以引导刺激装置就位或注射水凝胶（图3C）。 
	注意：每次完成硬脊膜切开后，应持续清除血液和/或脑脊液，以保持术野清晰。</li>
	<li>在将导管进一步推进脊髓前，应确认导管尖端位于硬脊膜下方可见。成功的操作表现为导管在硬脊膜下平滑地穿过细小的脊髓血管。</li>
	<li>完成所需治疗后（图3D、E），在椎板切除所形成的空腔内放置一块无菌外科明胶海绵，以促进止血、伤口愈合并维持脊柱结构稳定。</li>
	<li>放置明胶海绵后，使用4-0聚对二氧环己酮可吸收缝线缝合脊柱上方的肌肉层和皮肤层。</li>
</ol>
7. 术后护理
<ol>
	<li>每天检查动物，并根据需要给予术后药物（必要时使用布托啡诺；恩诺沙星和美洛昔康最多使用5天）。根据需要皮下注射1-3 mL生理盐水（如果术后24小时内饮水量&#60;体重的10%）。</li>
	<li>根据手术情况，监测膀胱功能、运动功能、面部表情评分以及任何其他动物福利相关指标。</li>
	<li>术后约10-14天拆除皮肤缝线。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍的方法提供了进入脊髓蛛网膜下腔的分步操作指南，并通过两种向脊髓胸段递送治疗的实例，证明了该方法的安全性和可行性11,12。许多研究团队已开发出多种策略，试图通过电刺激或化学干预手段治疗脊髓损伤（SCI）。目前的策略包括用于光遗传学17或电刺激18的可植入装置，以及利用水凝胶的药物治疗方案19,20，这些方法在促进功能恢复和康复方面已显示出不同程度的成效。然而，精准靶向仍是一个关键挑战，因为大多数现有治疗手段均未直接作用于蛛网膜下腔。本文所述技术为直接向脊髓递送干预措施提供了一种有前景的方法，包括实现对蛛网膜下腔的长期通路（补充图2），从而支持对SCI及神经退行性疾病进行持续且靶向的治疗剂递送。该方法对于克服血-脊髓屏障这一脊髓疾病治疗中的主要障碍具有重要意义。
椎板切除术 
尽管啮齿类动物的椎板切除术被广泛应用17,21,22，但本方案中有若干关键点必须注意。上述方案中使用的解剖标志（步骤 4.3；图 2A）可通向脊髓的下胸段，且专用于本课题组的研究。若需应用于不同的脊髓节段，可通过从初始椎骨向头侧或尾侧计数椎体节段来确定目标位置。另一个关键考虑因素是椎板切除的范围。为尽量降低手术过程中对脊髓造成意外损伤的风险，应至少连续切除两个节段的椎板。这样做可为硬脊膜切开提供足够的操作空间，并确保良好的视野。该措施有助于降低导管插入过程中损伤小血管的风险。同时应避免过度切除脊柱侧壁的骨质，以防术后出现不必要的出血或脊柱不稳定。通过在充分暴露与最小组织干扰之间保持平衡，该手术可实现更安全、更精确的治疗操作。
硬膜切开与导管置入 
进行硬脊膜切开时需精准操作，以避免损伤脊髓。不当的插入可能导致脊髓或硬膜下血管挫伤或撕裂。在硬脊膜上所创建的切口应仅足够容纳预期的治疗策略，在本例中即为鞘内导管的直径，同时不破坏膜的完整性。实施硬脊膜切开时，当硬脑膜被穿刺后可能会有脑脊液渗漏，但渗漏量通常极少。尽管硬脊膜的大面积撕裂可能引发并发症，但既往文献表明，如本方案所述（步骤6.4）所用的小型穿刺孔具有自愈能力。 通过 胶原沉积/血管生成23，术后未观察到可测量的不良反应。置入导管时，必须尽可能与脊髓平行插入，以最大限度降低因直接受力造成损伤的风险。操作过程中需小心谨慎，避免导管弯曲或受压，确保其顺利插入并准确定位。
术后护理 
考虑到啮齿类动物通常在标准条件下群养，手术后的护理是一个重要的考量因素。术后可能出现的攻击性行为或社会互动可能会影响实验结果，具体影响取决于所采用的处理方式。本方案会在动物背部形成一条长6-8 cm的皮肤缝合线。建议术后将动物单只饲养7-10天，以促进伤口愈合并防止笼伴可能将缝线拔除。若为药物递送应用，在切口愈合后，动物可重新放回原先的群体饲养，通常不会出现明显的攻击性行为或与手术相关的并发症。若涉及可植入装置，动物仅可成对饲养。我们发现，将动物以三只或更多为一组饲养时，可能导致与攻击行为相关的并发症，从而影响处理效果。
治疗应用 
尽管本文所述操作主要针对胸段脊髓及两种特定治疗策略，但该方法可适用于脊柱其他区域以及更多治疗用途。类似椎板切除术已在啮齿类动物模型的不同脊髓节段成功实施。然而，啮齿类动物硬膜下腔空间狭小，给治疗实施带来挑战，操作容错空间极小。虽然有经验的实验人员可较容易地完成椎板切除和硬膜切开步骤，但将治疗装置或药物精确置入硬膜下腔而不造成组织损伤，可能需要额外的培训时间。除手术技能训练外，还有若干因素有助于提高治疗实施的准确性。治疗过程中保持清晰的视野至关重要。若采用本研究中所述的鞘内导管，需确保导管在置入硬膜下之前表面光滑，无任何毛刺或粗糙部位。如前所述，硬膜切开的位置极为关键：导管进入点距离残留的头端椎板越远，导管在插入过程中越容易与脊髓保持平行排列。此外，治疗策略实施的时机也需结合损伤时间综合考虑。未来的研究将包括在损伤后不同时间点的动物模型中建立这些操作流程，从而为评估针对慢性脊髓损伤的治疗手段提供可能。本方案代表了脊髓神经系统疾病治疗应用方面的重要进展，提供了一种灵活且精准的直接向脊髓组织递送治疗手段的方法。

脊髓疾病和损伤对全球数百万人具有毁灭性影响，导致重大的社会、经济和医疗负担1,2。脊髓损伤和神经退行性疾病可导致慢性运动、感觉和自主神经功能障碍，降低患者的生活质量和独立性。目前的治疗方法，如手术干预和药物治疗，主要集中在减轻初始创伤和管理继发性并发症3。然而，这些方法很少能实现显著的神经再生或功能恢复，因此迫切需要开发更有效的干预手段，以靶向其根本机制。
当前治疗策略的一个主要关注点是治疗的定位与递送方式。神经调节或药物干预等治疗手段能够影响神经元活动，促进功能恢复，并有可能重建受损脊髓回路中的连接4。脊髓刺激可改善运动控制并减轻疼痛5。然而，这些策略目前仅限于对损伤组织的间接递送，主要集中在硬膜外腔，未考虑脊髓硬脑膜屏障的影响6,7,8。尽管硬膜外治疗已显示出一定的临床益处，但由于对目标神经元群体的间接接触，可能导致治疗剂的效果减弱。
本研究团队致力于克服与硬膜外给药策略相关的上述局限，探索在脊髓损伤（SCI）模型中直接进行蛛网膜下腔治疗给药的潜力。将导管插入蛛网膜下腔可使治疗物质直接作用于脊髓，增强与受损神经组织的相互作用9,10。蛛网膜下腔给药还可减少硬脑膜的屏障效应，提高电刺激和靶向药物递送系统的有效性11,12。该方法有望提升治疗的精确性和有效性，从而改善功能恢复的治疗效果。
本文介绍了一种安全进入啮齿类动物脊髓硬膜下腔的逐步操作方案。该手术主要针对脊柱胸段区域（T10-T12），但也可根据需要在脊髓的其他部位实施。文中明确了相关解剖学标志，用于定位目标区域，并详细描述了椎板切除术、硬脊膜切开术以及穿透硬脊膜的具体操作步骤。本文还展示了该方案的两种应用实例，包括植入电刺激装置以及递送水凝胶药物递送系统（图1）。对于具备啮齿类动物外科手术经验的研究人员而言，所述步骤易于重复实现。本方案以脊髓挫伤模型（SCI）为背景撰写，但具体损伤模型可根据预期实验结果进行调整。此处描述的技术不仅有望推动脊髓损伤治疗的发展，还可能为未来通过精确、局部干预手段开展脊髓修复与再生研究提供一个可行平台。

<table><tbody><tr><td>1 mL 和 3 mL 注射器</td><td>Amtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1ml 结核菌素注射器</td><td>BD</td><td>302100</td><td></td></tr><tr><td>2 把 Graefe 镊子</td><td>FST</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>用于给药的 25G 针头</td><td>Nipro</td><td>SH811</td><td></td></tr><tr><td>用于硬脑膜切开的 27G 针头</td><td>Nipro</td><td>SH816</td><td></td></tr><tr><td>6 个组织止血夹</td><td>FST</td><td>18051-28</td><td></td></tr><tr><td>70 % 乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baytril 5 mg/kg</td><td>Elanco</td><td>KV04UHU</td><td></td></tr><tr><td>Biogel 外科医生乳胶手套</td><td>Molnlycke</td><td>822775-01</td><td></td></tr><tr><td>布比卡因 2 mg/kg</td><td>Aspen New Zealand</td><td>2023-02</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺 0.05 mg/kg</td><td>Ceva (Vetergesic)</td><td>9000320</td><td></td></tr><tr><td>氯己定与乙醇酊剂</td><td>Perrigo</td><td>K076A</td><td></td></tr><tr><td>氯己定擦洗液</td><td>Schulke</td><td>LBL11258</td><td></td></tr><tr><td>弯头咬骨钳</td><td>FST</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 镊子</td><td>FST</td><td>11294-00</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam，无菌可吸收明胶海绵</td><td>GELFOAM</td><td>09-0342-04-015</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器</td><td>Hamilton</td><td>80314</td><td></td></tr><tr><td>加热垫 (37 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C)</td><td>Kent scientific</td><td>SF-01</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>FST</td><td>13004-14</td><td></td></tr><tr><td>Infinite Horizon 撞击器及配套软件</td><td>Precision systems and instrumentation (PSI)</td><td>IH-0400</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Medsource</td><td>unknown</td><td></td></tr><tr><td>美达辛（Metacam）2 mg/kg</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>D02818</td><td></td></tr><tr><td>不可吸收缝线（Ethilon 4-0，P-3）</td><td>Ethicon</td><td>1603G</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omax 外科显微镜</td><td>Jacobs Digital</td><td>W43DPT</td><td></td></tr><tr><td>用于铺巾的 Press and Seal 塑料薄膜</td><td>Glad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>10 号手术刀片</td><td>Amtech Medical</td><td>SH070</td><td></td></tr><tr><td>Somnoflow 诱导套件</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-01</td><td>低流量麻醉系统</td></tr><tr><td>无菌吸收垫和脱脂棉</td><td>Swisspers</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签（标准型 + 尖头型）</td><td>help@hand</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>无菌生理盐水 0.9%</td><td>实验室自制并高压灭菌</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>卷起的 Kim Wipe 无菌条状纸</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>温度探头</td><td>Kent scientific</td><td>SF-01</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪</td><td>FST</td><td>15903-08</td><td></td></tr><tr><td>水性润滑剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>任意品牌</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

获取啮齿类动物脊髓硬膜下腔用于治疗给药

Accessing the Subdural Space of the Rodent Spinal Cord for Treatment Delivery

治疗脊髓疾病或损伤具有挑战性，部分原因在于难以开发出可直接应用于脊髓的有效疗法。例如，目前对脊髓损伤（SCI）的治疗方法主要是硬膜外治疗。然而，硬膜外疗法无法与脊髓直接相互作用，从而降低了潜在的治疗效果。本文提出一种在啮齿类动物模型中进入硬膜下腔的方法，以实现治疗手段对脊髓更直接的作用。通过采用所述方案，成功实现了生物电子器件在硬膜下腔的植入，用于脊髓记录/刺激，同时也安全地植入了负载神经营养因子-3（neurotrophin-3）的水凝胶。在上述两种应用中，接受该操作的动物在术后未出现后肢或前肢功能改变，且在术后长达12周内均未出现功能障碍。尽管本文所展示的示例非常具体，但该方案可广泛应用于多种场景，以实现对脊髓神经系统疾病的更有效局部治疗。

本方案已在两种不同的实验条件下应用。所展示的数据代表了未受伤组，目的是证明在未建立损伤模型的情况下，本方案中描述的硬膜下操作不会影响功能。在6至8周龄的Sprague-Dawley大鼠中植入了生物电子器件（图1A）或递送了水凝胶（图1B）。这些动物的运动功能与接受假手术但未进行硬膜下操作的对照组动物进行了比较，评估采用BBB运动功能评分量表。本研究包含了多组动物，以展示每种操作的可行性和安全性。每项操作后，所有动物均保持正常的运动功能，在术后7天各组之间的BBB评分无差异，表明所述方案的安全实施。此外，还展示了一组显示后肢运动功能受损的动物（图4C），以便与硬膜下操作组进行对比，进一步证明实验组未出现不良影响。该组动物接受了175 kdyn冲击装置造成的挫伤性脊髓损伤（SCI）操作，具体方法见既往文献12,13所述。
生物电子植入物 
在设备植入过程中，该方案包括创建两个硬脑膜切口位点——一个用于导管进入，另一个用于导管穿出——以促进导引导管在硬脑膜下移动，并实现设备的可控定位。该生物电子设备由两个分叉臂组成，连接至一个印刷电路板（PCB）接口，并由生物相容性封装外壳包裹。分叉臂暂时连接于细小的鞘内导管。 通过 使用7-0丝线缝合以辅助植入物的定位。将导管缓慢穿过头端的硬膜切口，沿硬膜下方向滑行，再通过治疗部位尾端的硬膜切口引出。随后将连接的植入臂分别穿过切口，并置于脊髓的每侧半部分。植入物的尾端用缝线固定于附着在T13突起上的肌肉。将外壳缝合于椎板切除部位头端的斜方肌/背阔肌上。最后将皮肤在装置外壳基部周围缝合，以提供外部通路。
水凝胶处理 
对于水凝胶递送，仅需一个进入点。水凝胶被递送 通过 与刺激装置位于相同位置的类似鞘内导管。导管中装载了10 µL的泊洛沙姆水凝胶12 并以与设备植入步骤相同的方式插入硬膜下腔。到位后，在持续向硬膜下释放水凝胶的同时，缓慢撤出导管（图1B) 放置到每侧半脊髓上。每次操作后，对动物进行为期7天的监测，以确保其充分恢复。
采用21分制Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分评估运动功能16两组动物均在术前（基线）以及术后1天、3天和7天进行评估。开放旷场行为直接进行评估。 通过 盲法视频记录。将每组动物左右后肢的运动功能评分与未手术对照组以及另一脊髓损伤（SCI）组进行比较，以确定手术可能带来的任何不良影响。与未手术对照组或损伤性SCI动物相比，植入组或水凝胶组动物在手术后均未出现运动功能缺陷。需要指出的是，已发表的前期研究中已有组织学分析证实脊髓无损伤。该研究证明，采用此方法植入装置在术后7天内不会造成额外的脊髓创伤。11植入设备后，与对照组动物相比，星形胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞/巨噬细胞（Iba1）的活性均仅有轻微变化。同时检测了植入物正下方脊髓冠状切片的表面积和圆形度，结果显示形态学无明显改变。
<img alt="用于啮齿类动物神经调节实验的脊髓刺激装置及水凝胶注射示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68620/68620fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：硬膜下治疗策略。（A）植入装置示例，以及（B）用于注射水凝胶的导管/注射器。（C）大鼠脊髓中植入装置与水凝胶插入的代表性模型。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68620/68620fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Rodent spinal surgery, T10-T13 vertebrae exposure diagram and procedural images; vertebral dissection." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68620/68620fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 2"> 
图2：椎板切除术的图像，代表手术视野。 (A) 手术图像中动物的体位方向 图2 和 图3. (B) 用于定位第13肋过程（T13）以指导肌肉解剖起始位置的肌腱解剖标志。C) 垂直切割以识别需去除的各个突起部分 通过 椎板切除术。D沿脊突平行切开肌肉通道，以暴露骨板并进行移除。E用于牵开脊柱两侧的肌肉/皮肤，以提供足够的手术空间的Bulldog止血钳。F) 椎板切除术开始前，去除连接各突起之间的白色肌腱。G) 开始椎板切除术时的手术视野，咬骨钳从T12椎板下方插入，准备开始切除骨质。H切除T12椎板的前半部分，以暴露脊髓，并为术者提供足够的操作空间，以便向头侧移动并开始切除剩余的椎板（T11/T10）。我) 切除T12的颅侧部分，并完全移除该节段。J) 使用较宽切口在 T11 节段进行半程椎板切除术，以实施示例性挫伤性脊髓损伤。K) 切除T10-T12节段后行完全椎板切除术，充分暴露脊髓背侧表面。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68620/68620fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示针头插入、血管结构、操作步骤及头尾方向的脊髓手术示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68620/68620fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图3"> 
图3：进行硬脊膜切开及靶向治疗的操作步骤。（A）脊髓硬脊膜上打孔位置的示意图。（B）手术视野，显示27 G针头穿刺硬脊膜以完成硬脊膜切开；如图（A）所示，该操作在中央血管两侧均进行。（C）用于给药治疗的导管初始插入状态。（D）电刺激装置已放置于脊髓上。（E）装载有水凝胶、用于脊髓表面注射的导管。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68620/68620fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠脊髓损伤实验植入物，术后不同天数的BBB评分图分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68620/68620fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 4"> 
图 4：术后状态与运动功能。（A）装置植入和水凝胶递送后动物的代表性图像。（B）脊髓挫伤动物的代表性BBB评分，与仅接受硬膜下手术（植入物或水凝胶）或未进行任何操作的对照动物进行比较。对照组（未手术）、SCI组和植入物组的样本量为 n = 5，水凝胶组样本量为 n = 3。误差条表示标准误。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68620/68620fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：手术器械。 所用手术器械的照片。（1）#10刀片手术刀。（2）Vannas显微剪刀。（3）Graefe镊子。（4）Serrefine鳄嘴夹。（5）咬骨钳。（6）27 G针头用于硬脑膜切开。（7）精细镊子。（8）1 mL注射器用于按需滴加生理盐水。（9）解剖剪刀。（10）止血钳用于缝合。（11）尖头棉签。（12）灭菌棉球。（13）卷状无尘擦拭纸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68620/JoVE%20supp%20figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该图。</a>
补充图2：硬膜下 与硬膜外间隙 脊柱和脊髓的示意图，显示硬膜外腔 与硬膜下腔 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68620/JoVE%20supp%20figure%202.pdf" target="_blank">请点击此处下载该图片。</a>

本手术方案是将鞘内导管插入啮齿类动物脊髓硬膜下腔以递送靶向治疗药物的逐步操作指南。

治疗脊髓疾病或损伤具有挑战性，部分原因在于难以开发出可直接应用于……的有效疗法

我们正在探索通过硬膜下给药将治疗直接递送至受损的脊髓组织，是否能够改善脊髓损伤后的恢复和功能。目前研究面临的主要挑战是拓展治疗方法的适用范围。我们希望建立一种可重复且可靠的治疗范式，能够应用于多种不同场景。近期，我们的研究团队发现，在脊髓损伤的啮齿类动物中，经过电场刺激治疗后，其运动和感觉功能得到改善。我们的方案将治疗药物递送至鞘内空间，从而绕过血-脊髓屏障，相较于标准的硬膜外给药方法，可能具有更高的疗效。未来，我们的团队计划在更大的动物模型中应用此方法，并进一步研究其对脊髓损伤后膀胱功能的影响。首先，将麻醉后的大鼠置于干净的桌面上，剃除从髋部上方至颈部基底部的背部毛发。剃毛后，进行术前皮下注射。使用氯己定擦拭液以打圈方式对剃毛区域进行消毒，由中心向外周移动。然后以相同方式涂抹氯己定酊。皮下注射布比卡因，并重复之前的消毒步骤。在眼睛上涂抹眼用润滑剂，以防止干燥。现在将大鼠转移至置于显微镜下的加热垫上，并整理所有无菌器械。在剃毛区域覆盖一层压封膜，仅切开一个足够暴露手术区域但不露出未剃毛发的开口。插入直肠温度探针以监测大鼠体温。根据需要调节加热垫，维持体温在约 37 °C，并每隔 5 至 10 分钟进行一次动物福利检查。接着，进行足底反射测试，以确认动物已达到外科麻醉水平。确认后，开始手术操作。使用手术刀片，从颈部基部下方开始，沿头侧向尾侧方向做一条6至8厘米长的直线切口，延伸至胸背部隆起处，以暴露第9至第13胸椎（T9–T13）。然后用灰色镊子和微型弹簧剪，轻轻牵开切口下方的结缔组织，暴露脊柱肌肉组织。通过在切口的尾侧半段找到两条呈白色V形的肌腱来确定T13和T12棘突。从头向尾方向观察，位于第二个V形肌腱前方的棘突即为T13。从T13与T12之间开始，向T9方向推进，使用显微剪刀在每对椎骨突起之间的结缔组织上做小切口，以分离各椎骨突起。然后沿棘突侧缘切开一条平行的通道，以暴露每个节段的椎板。在脊柱两侧重复此解剖操作。接下来，将止血钳夹在肌壁上，以保持手术区域开放。将一对电极置于T13，另一对置于T11与T12的交界处，第三对置于T11与T10的交界处。确定通道位置后，使用显微剪刀或咬骨钳去除各棘突之间的结缔组织。继续清理，直至从T13头端至T9尾端之间的椎板区域所有结缔组织和肌肉均被剥离。找到T12椎板的尾侧部分，该部分覆盖于T13椎板的头侧区域之上。将咬骨钳的尖端置于该重叠区域下方，轻柔地切除小块椎板。从一侧交替至另一侧，持续切除 T12 椎板的部分组织。为扩大开口，将切口向突起的中线延伸，暴露脊髓，形成一个直径约 5 毫米的孔洞。然后将咬骨钳置于两侧椎板下方，小心地向T12的颅端方向均匀地开辟一条通道。重复相同操作，去除T11和T10的椎板。当椎板切除术充分暴露T10至T12区域后，用生理盐水轻轻冲洗暴露的硬脑膜。使用解剖显微镜进行硬脊膜切开术，以进入脊髓的硬膜下腔。确认硬脊膜切开术的选定位置及其前方区域均无来自中线血管的分支血管。将一支27号针头弯成90度角，针尖斜面朝上。在预定的入点处，用弯曲针的针尖轻柔地刺穿硬脑膜。一旦硬脑膜被刺破，小心地将针头向背侧抬起，在中线血管两侧各不超过2毫米的范围内撕开一个圆形孔洞。观察是否有少量脑脊液渗出，以确认硬脑膜切开成功。利用硬脑膜上制作的孔洞，向硬膜下腔递送治疗物或植入装置。根据本方案，插入鞘内导管，用于引导刺激装置或注射水凝胶。在继续操作前，确认导管尖端在硬脑膜下可见。如果导管顺利滑入硬脊膜下方并越过脊髓的小血管，则表明置管成功。导管就位后，即可通过导管输送所需的治疗物质。治疗完成后，将一块无菌外科明胶海绵插入椎板切除腔内，以促进止血、辅助愈合并维持脊柱结构。最后，使用4-0聚对二氧环己酮可吸收缝线缝合脊柱上方的肌肉层和皮肤层。将生物电子器件植入或向6至8周龄的Sprague-Dawley大鼠体内递送水凝胶。每项操作完成后，所有动物均保持正常的运动功能，术后7天各组之间的BBB评分无差异，表明所述方案的安全实施。

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进入啮齿动物脊髓的硬膜下空间进行治疗

简要的视觉描述，介绍用于将（基因和细胞）疗法递送至脊髓的外科技术及装置。该技术已在动物模型中得到演示，具有完全的可转化性，目前正应用于人类临床。...

脊髓给药治疗的外科技术：在哥廷根小型猪中进行手术操作的示范

小鼠模型中通过立体定位大池途径进行治疗递送

来源：Zamboni, M., et al., 通过脑池内注射诱导软脑膜细胞修饰。J. Vis. Exp.

通过小脑延髓池注射在小鼠模型中实现靶向药物递送

来源：Chen, Y., et al．大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送．J. Vis. Exp.

向大鼠中枢神经系统鞘内递送测试化合物

来源：Li, D., et al. 成年小鼠中重组腺相关病毒的直接鞘内注射. J. Vis. Exp.

在小鼠模型中通过鞘内递送病毒治疗中枢神经系统疾病

本研究的目的是在成年小鼠中利用一种新型的软膜下基因递送技术，开发并验证脊髓腺相关病毒9型（AAV9）介导的基因递送的有效性和安全性。...

成年小鼠脑膜下腺相关病毒9（AAV9）载体递送

本文介绍了一种通过将导管植入大鼠脊柱腰段鞘内空间，向其中枢神经系统递送药物的方法。我们重点阐述反义寡核苷酸的递送，但该方法同样适用于其他治疗方式的给药。...

大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送

本文描述了一种对幼年大鼠腰池进行注射的外科手术方法。该方法已用于基因治疗载体的鞘内递送，但预计也可适用于多种其他治疗剂，包括细胞和药物。...

通过腰池注射在幼年大鼠中进行鞘内载体递送

本文介绍了一种改良的大鼠鞘内导管置入方法，该方法操作简便、使用方便，是一种可靠的重复性鞘内给药途径。...

一种改良的大鼠鞘内导管置入方法

本方案详细介绍了在啮齿类动物中进行脊髓手术以及在脊髓上方植入并固定光学探针的外科手术操作。...

啮齿类动物脊髓中光电子器件的植入

了解硬膜下导管植入技术，用于直接向啮齿动物脊髓损伤组织输送治疗药物。该方法绕过血脊髓屏障，提高疗效，为脊髓损伤再生医学研究提供可靠手术方案。

获取啮齿类动物脊髓硬膜下腔用于治疗给药

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