Name: 流感病毒冷冻电子断层扫描血凝素的亚纳米分辨率结构测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-07T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 了解利用冷冻电子断层扫描技术解析流感病毒血凝素在受体结合时的构象变化。该方法可在完整病毒颗粒上以亚纳米分辨率原位成像，揭示隐藏相互作用，为抗病毒药物研发提供结构基础。

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作者谨此感谢 Schiffer 实验室的有益讨论。我们还要感谢马萨诸塞大学陈医学院冷冻电镜核心设施在数据采集方面提供的帮助，以及给予我们的支持与建议。本研究工作得到了美国国家普通医学科学研究所资助项目 R01GM143773（资助对象：M.S.）和 R35GM151996（资助对象：C.A.S.）的支持。

注意：本实验方案所用的示例数据集可通过 EMPIAR-12864 获取，其中包含本方案所使用的两组倾转系列数据。倾转系列数据采集自手动浸入法制备的纯化甲型流感病毒网格样品，物理像素尺寸为 2.09 Å/像素，以确保足够大的视野范围，使每个倾转系列中包含多个病毒颗粒，同时尽可能实现最高分辨率的重构。对于用户自身的数据集，建议以原始倾转电影数据作为工作流程的起始输入。这些数据集的处理与可视化均使用高性能工作站完成。 材料表 列出了本实验方案所使用的硬件和软件。本方案中使用的所有软件包均为开源，可免费下载；安装链接和使用说明详见下文 材料表推荐用于处理冷冻电子断层扫描（cryoET）数据集的工作站应配备至少8核处理器、具有6 GB显存的独立GPU显卡、64 GB内存以及2 TB本地存储空间。
1. 使用 Warp 23 和 IMOD 24 对倾斜序列图像进行数据预处理及冷冻电子断层图重建
<ol>
	<li>在终端中，使用以下命令激活已安装 Warp 的 conda 环境： 
	<code>conda activate warp_environment</code></li>
	<li>创建用于处理帧序列的帧序列设置文件。这是一个配置文件，包含显微镜的元数据、待处理数据的存储位置以及输出文件的保存路径。 
	<code>WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07</code> 
	注意：这些数据是在超分辨率模式下采集的。</li>
	<li>进行对比度传递函数（CTF）估计和运动校正。 
	<code>WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages</code> 
	注意：m_grid 参数应与倾斜电影中的子帧数量相对应——我们的数据集每个倾斜电影包含 5 个子帧。</li>
	<li>导入倾斜序列元数据，以便 WarpTools 能够识别哪些电影属于哪个倾斜序列。 
	<code>WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar</code></li>
	<li>当 tomostar 文件夹填充完成后，创建用于倾斜序列处理的倾斜序列设置文件 
	<code>WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN</code></li>
	<li>输出倾斜堆栈，并使用 IMOD 的 batchruntomo 程序通过 Etomo 图形用户界面（GUI）进行自动化的基于标记物的倾斜序列对齐24。
	<ol>
		<li>在终端中运行以下命令： 
		<code>Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35</code> 
		注意：倾斜序列以物理像素尺寸的 4 倍导出，以减少对齐时间和计算资源消耗。</li>
		<li>选择一个样本数据集，首先设置对齐参数，然后将其作为模板应用于&#160;batchruntomo。</li>
		<li>如果使用 batchruntomo，请导入来自 IMOD 的对齐参数。 
		<code>WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35</code> 
		注意：对于本数据集，使用 Etomo GUI 的结果优于 WarpTools 内置封装工具的结果。</li>
		<li>或者，使用 WarpTools 中的 AreTomo25 封装工具进行无需标记物的自动化倾斜序列对齐。 
		<code>WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive</code> 
		注意：AreTomo 封装工具已在 AreTomo1.3.4 版本上测试通过。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在终端中运行以下命令，以估计倾斜序列的 CTF 参数： 
	<code>WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4</code></li>
	<li>使用 WarpTools 重建断层图像。
	<ol>
		<li>设置环境变量： 
		<code>export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1</code> 
		注意：此步骤可确保断层图像与本实验方案中后续使用的其他软件中的图像处理和可视化步骤兼容。</li>
		<li>在终端中执行以下命令以重建断层图像：<code>WarpTools ts_reconstruct --settings&#160; warp_tiltseries.settings --input_data 输入文件名 --angpix 8.35 --dont_invert</code></li>
	</ol>
	</li>
	<li>对所有数据集重复执行步骤 1.2 至 1.8.2。</li>
</ol>
2. 断层图预处理与颗粒挑选
<ol>
	<li>在终端中，激活已安装 IsoNet26 的 conda 环境。 
	<code>conda activate isonet_env</code></li>
	<li>首先创建一个子文件夹，并将所有断层图像移入该文件夹，以准备进行断层图像处理。 
	<code>mkdir tomo_folder 
	mv tomograms*.mrc tomo_folder/</code></li>
	<li>在项目文件夹中生成一个 star 文件。 
	<code>isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35</code></li>
	<li>使用文本编辑器打开生成的 star 文件，并在第四列（_rlnDefocus）中为每个断层图像输入 0 度倾斜图像的近似离焦值，该值可在 warp_tiltseries 文件夹中的 processed_items.json 文件中找到。 
	注意：IsoNet 要求离焦值以埃（angstroms）为单位。Warp 输出的离焦值单位为微米（µm），需乘以 10,000 进行换算。</li>
	<li>在终端中运行 CTF 去卷积命令。 
	<code>isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve</code></li>
	<li>完成去卷积后，在终端中启动 EMAN2 图形用户界面（GUI）27，以开始对断层图像进行预处理，用于颗粒挑选。 
	<code>conda activate eman_env 
	e2projectmanager.py</code></li>
	<li>在“断层成像”（Tomography）模块下，左键单击原始数据（Raw Data）旁边的箭头，并从下拉菜单中选择导入断层图像（Import Tomograms）。</li>
	<li>左键单击分割（Segmentation）旁边的箭头，并选择预处理断层图像（Preprocess tomograms）。 
	注意：默认参数可能适用于大多数数据集。对于这些断层图像，应用了 4 Å 的低通滤波，并对倾斜图像进行了归一化处理。预处理完成后，EMAN2 将自动生成一个 info 目录，其中包含空白的 .json 文件（文件名基名与预处理文件相似）。在进行颗粒挑选前，需将 angpix 值添加到这些 json 文件中。</li>
	<li>训练卷积神经网络（CNN）以识别 HA 糖蛋白。
	<ol>
		<li>将工作目录更改为用于 CNN 训练和颗粒挑选的断层图像所在位置： 
		<code>cd path/to/tomograms</code></li>
		<li>使用终端打开 CNN 训练窗口。 
		<code>e2spt_boxer_convnet.py --label label_name</code></li>
		<li>确认已打开四个窗口：一个显示 CNN 参数和目录中断层图像的信息，另外三个窗口分别显示良好参考图像（Positive）、不良参考图像（Negative）以及 CNN 挑选出的颗粒图像（Particles）。</li>
		<li>在 CNN 图形界面中，左键单击新建（New）按钮以初始化一个新的 CNN。将默认学习率设为 0.0001，盒子大小设为 8。</li>
		<li>在文件名（FileName）列中，左键单击一个具有代表性的断层图像，以在新窗口中打开它。 
		注意：每次只能打开一个断层图像。
		<ol>
			<li>要沿断层图像的 z 轴移动，请将光标置于打开的断层图像上，按下计算机鼠标滚轮以打开新窗口。标有 N# 的滑块可用于改变 z 轴位置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在打开的断层图像中，使用鼠标左键在Positive&#160;面板中选择 10–20 个对应于 HA 的特征。 
		注意：应选择 HA 的顶部视图和侧面视图作为良好参考，这些视图在膜上方呈现为圆柱形或三角形，有助于构建更稳健的网络。
		<ol>
			<li>正向参考图像将显示在Positive窗口中。若要删除某个参考，按住 Shift 键并左键单击该参考图像。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>切换到Negative&#160;面板，并选择 10–20 个对应于空膜区域、vRNP 密度、标志物（fiducial markers）和碎片等特征的参考。 
		注意：参考图像将显示在Negative窗口中。</li>
		<li>在主窗口中左键单击训练（Train）按钮，启动 CNN 训练。 
		注意：主窗口中的迭代次数（Niter）决定了 CNN 训练的迭代轮数，建议将该参数设为 50。</li>
		<li>CNN 完成所选参考的训练后，左键单击应用（Apply），使用该 CNN 在当前打开的断层图像中挑选颗粒。 
		注意：挑选出的颗粒图像可在“Particles”窗口中查看。被选中的颗粒将以蓝色圆圈形式显示在断层图像上。</li>
		<li>根据已应用的网络结果继续选择正向和负向参考，并通过保存（Save）按钮定期保存进度。</li>
		<li>当结果令人满意时，选择全部应用（Apply All），使 CNN 在目录中的所有断层图像中挑选颗粒，并在多个断层图像上评估结果；根据需要进行额外训练。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每个断层图像的坐标保存为文本文件。
	<ol>
		<li>使用<code>e2projectmanager.py</code>命令打开 EMAN2 图形界面。</li>
		<li>单击子断层图像平均（Subtomogram Average）旁边的箭头，然后单击手动框选（Manual Boxing）。</li>
		<li>输入一个断层图像的名称，然后单击启动（Launch）。</li>
		<li>通过选择文件 &#62; 保存框坐标 &#62; tomogram_ha.txt，将坐标保存至文本文件。</li>
		<li>进入 neuralnets 子文件夹和 info 子文件夹，备份 nnet_save.hdf、trainouts.hdf、segouts.hdf 和 boxes3dref.hdf 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为确保分析仅针对完整组装的病毒颗粒进行（即基质蛋白 M1 层和病毒核糖核蛋白复合物 vRNP 均清晰可见），需训练第二个卷积神经网络以识别 M1 蛋白。
	<ol>
		<li>遵循步骤 2.9 中所述相同流程，仅将训练盒子大小从 8 更改为 14。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 颗粒筛选
<ol>
	<li>从&#160;https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis 下载笔记本文件。</li>
	<li>打开 CNN_Particle_Cleaning.ipynb 笔记本并加载所需的模块。 
	注意：该脚本使用 Open3D28 作为将颗粒坐标可视化为三维点云的软件包。</li>
	<li>加载对应 HA 和 M1 坐标的文本文件，并使用 Open3D 软件包将其显示为三维点云。</li>
	<li>使用 Open3D 中实现的统计离群值去除方法，滤除 HA 坐标的离群值。 
	注意：建议 HA 的初始参数设置为 nb_neighbors = 50（某坐标周围邻近坐标的数量）和 std_ratio = 0.5。</li>
	<li>计算 HA 与 M1 点云之间的距离。所有距离 M1 点云超过 20 像素的 HA 坐标将被识别为离群值。所有未被识别为离群值的颗粒坐标将保存至输出的 .txt 文件中。 
	注意：在像素大小为 8.35 Å/像素的条件下，20 像素对应约 16 nm 的距离。在我们的断层图像中，HA 三聚体中心到 M1 层的距离约为 15 nm。</li>
	<li>合并所有颗粒，并使用&#160;pts2starfile.ipynb 将其保存为 star 文件。</li>
</ol>
4. 迭代子断层图平均与分类
<ol>
	<li>使用 WarpTools 以 4 倍 binning 因子提取颗粒，并在 RELION4 中进行初步的子断层平均29。 
	<code>WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d</code> 
	注意：建议的盒子尺寸为 48 × 48 × 48 像素，对应约 360 Å3 的体积，足以容纳 7–8 个 HA 的阵列。
	<ol>
		<li>将 warp star 文件转换为与 RELION 4 兼容的文件 
		<code>relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star</code></li>
		<li>使用 relion_refine_mpi 在部分颗粒子集上生成初始参考模型。 
		<code>head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star &amp;#38; tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star 
		mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001</code></li>
		<li>使用 relion_refine_mpi 对子断层图像进行 3D 自动精修。
		<ol>
			<li>示例命令：<code>mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001</code> 
			注意：初始全局和局部采样分别设置为 7.5 和 1.8 度，对应 healpix 阶数为 4 和局部 healpix 阶数为 2。初始精修主要利用膜、M1 蛋白和 HA 阵列的强密度信号。允许较大的平移偏移范围，以涵盖阵列对齐过程中可能出现的任何位移。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在首次精修运行收敛后，将平移范围更改为 8，步长更改为 2，重复精修。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用 2D 分类，通过 relion_refine 剔除无用颗粒。
	<ol>
		<li>示例命令：<code>relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002</code>。 
		注意：使用 2D 分类而非 3D 分类，因其计算效率更高。子断层图像可直接作为 2D 分类任务的输入，无需额外图像处理。</li>
		<li>使用 relion_star_handler 合并包含可识别的柱状 HA、膜和 M1 密度的 HA 阵列的类别。</li>
		<li>首先，创建包含优质类别的 star 文件。 
		<code>relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber</code></li>
		<li>然后，使用以下 relion_star_handler 命令合并各个 star 文件。 
		<code>relion_star_handler --i &#34;output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star&#34; --o bin4_keep.star --combine</code></li>
	</ol>
	</li>
	<li>以 bin2 和未 binning 的颗粒重新提取，用于迭代局部精修。
	<ol>
		<li>对于 bin2 精修，使用更小的盒子尺寸 80 提取颗粒，并将 healpix 和局部 healpix 均设为 4（1.8 度局部角度采样），进行局部搜索。</li>
		<li>在此阶段，使用 relion_star_handler 合并来自不同数据集的颗粒集合。 
		<code>relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine</code></li>
		<li>在第一轮精修后，在 EMAN2 环境中使用 e2filtertool.py 创建一个圆柱形掩膜，覆盖中心 HA 及其周围的膜和 M1 密度。 
		注意：圆柱形掩膜使用的参数为：cx=24，cy=24，outer_radius=8，zmax=40，zmin=12；其余参数均未勾选。</li>
		<li>应用掩膜后，再进行一轮精修。</li>
		<li>再进行一轮 2D 分类，以剔除未与中心 HA 对齐或含有额外杂质的异常颗粒。</li>
		<li>对未 binning 的颗粒重复该流程，盒子尺寸设为 120，创建一个覆盖中心 HA 的软掩膜，将参考模型对齐至 C3 对称性，并在此精修阶段应用对称性。 
		<code>relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3</code> 
		注意：使用 RELION 达到的最终分辨率为 6.1 Å。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 MTools9 中进行最终精修
	<ol>
		<li>创建精修群体（激活 Warp conda 环境后）。 
		<code>MTools create_population --directory refine_m --name ha_final</code></li>
		<li>为每个数据集添加数据源。 
		<code>MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings</code>
		<ol>
			<li>对其他数据集重复上述步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>创建精修物种。 
		<code>MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc</code></li>
		<li>多颗粒精修。
		<ol>
			<li>首先使用以下命令精修颗粒姿态：<code>MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles</code></li>
			<li>随后，使用以下命令同时精修颗粒姿态和球差：<code>MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs</code> 
			注意：此处停止精修，因为进一步迭代未提升分辨率。然而，未全面测试的其他参数组合可能仍能进一步改善结果。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 模型优化
<ol>
	<li>使用 ChimeraX30，载入最终的密度图和 HA 的原子模型。</li>
	<li>对密度图进行分割，并合并所有对应于 HA 胞外域的片段，然后使用 Fit to Segments 工具将 HA 模型对接到密度图中。
	<ol>
		<li>保存模型变换后的坐标。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开 Phenix GUI31，并使用 Real Space Refinement 工具。
	<ol>
		<li>当提示添加文件时，添加变换后的 HA 模型和密度图，并填写最终重构的分辨率。</li>
		<li>进行五轮全局最小化、局部rotamer拟合、占有率精修和基团ADP精修。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 ChimeraX 可视化最终的重构结果和模型。</li>
</ol>

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<li>Song, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+underlying+fascin-mediated+bundling+of+actin+filaments+unveiled+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The mechanism underlying fascin-mediated bundling of actin filaments unveiled by cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 217 (2), 108212(2025).</li>
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<li>Ke, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+and+distributions+of+SARS-CoV-2+spike+proteins+on+intact+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures and distributions of SARS-CoV-2 spike proteins on intact virions.</a> Nature. 588 (7838), 498-502 (2020).</li>
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<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AreTomo%3A+an+integrated+software+package+for+automated+marker-free%2C+motion-corrected+cryo-electron+tomographic+alignment+and+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol+X%22%5BJournal%5D)">AreTomo: an integrated software package for automated marker-free, motion-corrected cryo-electron tomographic alignment and reconstruction.</a> J Struct Biol X. 6, 100068(2022).</li>
<li>Liu, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotropic+reconstruction+for+electron+tomography+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning.</a> Nat Commun. 13 (1), 6482(2022).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+data+processing+workflow+for+cryo-ET+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A complete data processing workflow for cryo-ET and subtomogram averaging.</a> Nat Methods. 16 (11), 1161-1168 (2019).</li>
<li>Zhou, Q. Y., Park, J., Koltun, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open3D%3A+a+modern+library+for+3D+data+processing%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Open3D: a modern library for 3D data processing.</a> arXiv. , (2018).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+approach+to+single-particle+electron+cryo-tomography+in+RELION-4.0%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A Bayesian approach to single-particle electron cryo-tomography in RELION-4.0.</a> Elife. 11, e83724(2022).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+ChimeraX%3A+structure+visualization+for+researchers%2C+educators%2C+and+developers%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">UCSF ChimeraX: structure visualization for researchers, educators, and developers.</a> Protein Sci. 30 (1), 70-82 (2021).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li>
<li>Burt, A., Gaifas, L., Dendooven, T., Gutsche, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flexible+framework+for+multi-particle+refinement+in+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A flexible framework for multi-particle refinement in cryo-electron tomography.</a> PLoS Biol. 19 (8), e3001319(2021).</li>
<li>Watanabe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ebola+virus+nucleocapsid+assembly+revealed+by+in+situ+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ebola virus nucleocapsid assembly revealed by in situ cryo-electron tomography.</a> Cell. 187 (20), 5587-5603.e19 (2024).</li>
<li>Woldeyes, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+thin+filament+in+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+and+its+response+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Structure of the thin filament in human iPSC-derived cardiomyocytes and its response to heart disease.</a> bioRxiv. , (2025).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Env+trimers+asymmetrically+engage+CD4+receptors+in+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Env trimers asymmetrically engage CD4 receptors in membranes.</a> Nature. 623 (7989), 1026-1033 (2023).</li>
<li>Scaramuzza, S., Castaño-Díez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-by-step+guide+to+efficient+subtomogram+averaging+of+virus-like+particles+with+Dynamo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Step-by-step guide to efficient subtomogram averaging of virus-like particles with Dynamo.</a> PLoS Biol. 19 (8), e3001318(2021).</li>
<li>Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamo%3A+a+flexible%2C+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> J Struct Biol. 178 (2), 139-151 (2012).</li>
<li>Tran, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+structures+of+chimeric+hemagglutinin+displayed+on+a+universal+influenza+vaccine+candidate%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy structures of chimeric hemagglutinin displayed on a universal influenza vaccine candidate.</a> mBio. 7 (2), e00257-e00316 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

对关键病毒蛋白的更深入结构理解可加速针对这些病毒的新型治疗方法的发现。在过去十年中，分辨率革命推动了利用单颗粒冷冻电镜（cryoEM）快速解析高分辨率病毒结构的发展，但该方法仅限于纯化的蛋白质或具有二十面体对称性的无包膜病毒。相比之下，冷冻电子断层扫描（cryoET）能够在三维空间中可视化形态多样的膜性病毒颗粒，但其分辨率有限。本文介绍的流程基于广泛使用的 Warp-RELION-M 流程9,32，并整合了一套自定义脚本与 EMAN2 中基于半自动卷积神经网络的颗粒挑选工具，旨在建立一个端到端的处理流程，实现流感病毒HA蛋白的亚纳米分辨率结构重建。
在冷冻电子断层扫描（cryoET）中，数据采集后选择合适的分析工具组合是一项较为困难的问题，因为在断层图像分析的各个步骤中——从初始预处理到模型构建——均存在大量可用的软件程序。本流程改编自Warp-RELION-M9,<sup class="xref...

过去几十年中，冷冻电子断层扫描技术（cryoET）已被用于捕捉蛋白质复合物、病毒、细胞及生物体的瞬时状态。作为冷冻电子显微技术（cryoEM）的一种形式，cryoET 是一种结构生物学方法，其通过对生物样品进行快速冷冻，随后通过倾斜样品从多种角度进行成像1,2,3。在各个角度获取的图像随后通过计算方法对齐至共同的倾斜轴，并重建为断层图像，从而提供三维视图4。
X射线晶体学和单颗粒冷冻电镜技术需要纯化且结构均一的分子，而冷冻电子断层扫描技术（cryoET）则可以直接在分子的天然环境中对其进行成像4。因此，cryoET的一个主要优势在于其能够可视化具有多形性的样品，例如膜性病毒，包括流感病毒5,6,7。cryoET的另一项前景在于其具备跨尺度成像的能力。尽管断层图的分辨率通常难以超过5–10 nm8，但通过亚断层平均技术（subtomogram averaging）——即识别、配准并平均同一颗粒的多个拷贝——在某些生物分子（如核糖体）中可实现接近原子级别的分辨率9,10。然而，仅有限种类的分子能够达到这一分辨率；亚断层平均图的分辨率通常不超过10–15 Å。相比之下，单颗粒冷冻电镜在“分辨率革命”之后，常规可达到3–4 Å的分辨率11。近年来，随着cryoET数据采集通量的提高以及分析软件的进步，已在天然环境中实现了更多生物分子的亚纳米级分辨率结构解析12,13,14,15,16,17,18。
冷冻电子断层扫描（cryoET）的一个常见用途是观察病毒的形态、排列方式和结构。尽管该技术的分辨率低于单颗粒冷冻电镜（cryoEM）或X射线晶体学，但cryoET结合亚断层平均法仍可提供病毒蛋白在其天然环境中行为的信息，并揭示这些蛋白在完整病毒颗粒背景下的组织细节。病毒表面糖蛋白是cryoET研究的常见目标，这些蛋白通常介导宿主细胞的附着与膜融合，且往往是主要抗原以及治疗药物或疫苗的作用靶点。随着近年来cryoET数据处理软件包的不断进步，对这些糖蛋白实现亚纳米分辨率的平均结构重建已变得越来越可行19,20,21,22。其中一个典型例子是血凝素（hemagglutinin, HA），它是流感病毒颗粒表面的主要蛋白。该蛋白不仅负责受体结合和膜融合功能，而且在病毒颗粒表面以极高密度排列，单个病毒颗粒上可分布数百至数千个HA分子5。本文所介绍的流程（图1）整合了多个常用软件包与自主编写的脚本，涵盖了从预处理到流感病毒HA亚断层平均结构模型优化的各个阶段。

<table><tbody><tr><td>AMD Ryzen Threadripper PRO 5965WX</td><td>AMD</td><td>https://www.amd.com/en/support/downloads/drivers.html/processors/ryzen-threadripper-pro/ryzen-threadripper-pro-5000wx-series/amd-ryzen-threadripper-pro-5965wx.html</td><td></td></tr><tr><td>AreTomo 1.3.4</td><td>加州大学旧金山分校</td><td>https://drive.google.com/drive/folders/1Z7pKVEdgMoNaUmd_cOFhlt-QCcfcwF3_</td><td></td></tr><tr><td>EMAN2 2.99.52</td><td>贝勒医学院</td><td>https://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2</td><td></td></tr><tr><td>IMOD 4.12.27</td><td>科罗拉多大学博尔德分校</td><td>https://bio3d.colorado.edu/imod/</td><td></td></tr><tr><td>流感分析脚本</td><td>马萨诸塞大学陈医学院</td><td>https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis</td><td></td></tr><tr><td>IsoNet 0.3</td><td>加州大学洛杉矶分校</td><td>https://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet</td><td></td></tr><tr><td>M 2.0.0</td><td>基因泰克</td><td>https://warpem.github.io/warp/home/m/</td><td></td></tr><tr><td>NVIDIA A4000</td><td>NVIDIA&amp;nbsp;</td><td>https://www.nvidia.com/en-us/products/workstations/rtx-a4000/</td><td></td></tr><tr><td>Open3D&amp;nbsp;</td><td>英特尔实验室</td><td>https://www.open3d.org/</td><td></td></tr><tr><td>PHENIX 1.21-5207</td><td>劳伦斯伯克利国家实验室</td><td>phenix-online.org</td><td></td></tr><tr><td>RELION 4.0</td><td>英国医学研究理事会分子生物学实验室</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/</td><td></td></tr><tr><td>Ubuntu 20.04</td><td>Ubuntu</td><td>https://releases.ubuntu.com/focal/</td><td></td></tr><tr><td>UCSF ChimeraX 1.6.1</td><td>加州大学旧金山分校</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/</td><td></td></tr><tr><td>Warp 2.0.0</td><td>基因泰克</td><td>http://warpem.github.io/warp/</td><td></td></tr></tbody></table>

利用流感病毒冷冻电子断层扫描技术解析血凝素的亚纳米级分辨率结构

Subnanometer-Resolution Structural Determination of Hemagglutinin from Cryo-Electron Tomography of Influenza Viruses

冷冻电子断层扫描是一种用于可视化异质样品的强大工具，其主要应用之一是形态多变病毒的结构表征。近年来，病毒糖蛋白的子断层平均技术已成为直接观察完整病毒颗粒表面这些关键蛋白的方法。其中一个重要靶标是流感病毒的血凝素（HA）糖蛋白，该蛋白密集覆盖在病毒包膜表面，负责流感病毒的受体结合和膜融合过程。尽管已有对流感病毒HA进行子断层平均的报道，但由于冷冻电子断层扫描（cryoET）本身固有的低信噪比，以及分析异质性流感病毒颗粒所需的手动工作量，其分辨率一直受到限制。本文介绍了一种整合多个软件包的冷冻电子断层扫描分析流程，可高效且稳健地分析流感病毒颗粒的断层数据。本方案详细描述了从初始运动校正到最终模型构建的各个步骤，实现从流感病毒颗粒中解析HA的结构。通过该流程，利用来自A/Puerto Rico/8/34（PR8）流感毒株的两套冷冻电子断层扫描数据集，获得了分辨率为6.0 Å的HA结构重建结果。

为了展示该处理流程的应用（图1），我们将前述工作流程应用于两组共25个断层图像数据集，这些数据来自甲型H1N1流感病毒株（A/Puerto Rico/8/1934）。数据采集参数见表1。图2展示了一个代表性断层图像及形态多样的流感病毒颗粒的局部放大视图。该断层图像中捕获了多种形态的病毒颗粒，其形状从球形到椭圆形或拉长形不等。尽管大多数流感病毒颗粒含有结构有序的M1蛋白和vRNP复合物，但部分病毒颗粒结构较为松散，并缺少关键的结构组分。
从该数据集中，在完成颗粒挑选和筛选后，最初选取了40,995个子断层图用于bin4（8.35 Å/像素）的重构。两个数据集最初在RELION4中以C1对称性和一个涵盖整个HA阵列的宽球形掩模独立处理。对这些子断层图进行了三轮 refinement，随后进行2D分类。分类后，剔除分辨率较差的子断层图和垃圾颗粒；保留的子断层图在bin2（4.17 Å/像素）下重新提取，并将两个数据集合并。bin2子断层...

本文介绍了一种用于处理通过冷冻电子断层扫描技术成像的流感病毒数据的方案，以及随后对血凝素糖蛋白进行亚断层平均的步骤。该方案涵盖了从图像预处理到最终模型优化的逐步数据处理流程。

冷冻电子断层扫描技术是一种用于可视化异质样品的有力工具，其主要应用之一是样品的结构表征……

本实验室利用结构生物学研究病毒及药物耐药性的进化。在当前的研究中，我们正在表征流感病毒血凝素在受体结合时构象变化的机制。我们采用冷冻电子断层扫描技术来可视化病毒的形态组织与结构。具体而言，我们已采用这种冷冻电子显微镜技术对形态多变的流感病毒进行成像。本方案使我们能够在完整病毒颗粒上原位研究流感病毒血凝素的排列与结构，达到亚纳米级分辨率。这种更高分辨率使我们能够观察到以往难以察觉的相互作用。首先，启动一个 Linux 终端以激活 Conda 环境。使用终端激活已安装 ISO net 的 Conda 环境。创建一个名为 tomo 文件夹的子文件夹，然后将所有断层图像文件移入该文件夹中。接下来，使用代码在项目文件夹中生成一个 star 文件。使用文本编辑器打开生成的 star 文件，并将零度倾斜图像的近似离焦值输入到第四列中。现在在终端中运行 CTFD 卷积命令。去卷积完成后，启动 EMAN2 图形用户界面环境，以开始进行颗粒挑选的预处理。在断层成像模块下，左键单击原始数据旁边的箭头，从下拉菜单中选择导入断层图，并选择相应文件。然后，左键单击分割旁边的箭头，选择预处理后的断层图。使用合适的默认参数。预处理后，系统将自动创建一个 info 目录，其中包含与过程断层扫描文件基名相对应的空白 JSON 文件。在继续操作前，请向这些文件中添加埃米级像素信息。为了训练卷积神经网络（CNN）以识别HA糖蛋白，需将工作目录更改为待使用断层图像所在的路径，然后通过终端打开CNN训练界面。确认已打开四个窗口。一个包含目录中关于CNN参数和断层图像的信息，另外三个窗口分别显示CNN选出的良好参考图像、不良参考图像以及颗粒。在CNN图形用户界面中，单击新选项，以默认学习率0.0001和盒子尺寸八来初始化CNN。在文件名列中，左键单击一个代表性断层图像以打开它。将光标悬停在打开的断层图像上，然后单击鼠标滚轮以打开新窗口。左键单击 N 数值滑块以沿 Z 轴进行浏览。接下来，在打开的断层图像上，使用“良好参考”面板选择 10 到 20 个对应于 HA 的特征。阳性图像将显示在阳性窗口中。要移除一个，按住 Shift 键并单击左键。现在切换到不良参考图像面板，选择 10 到 20 个对应于空膜区域、核糖核蛋白密度、定位标记物和碎片等特征的参考图像。将迭代次数设置为 50，然后单击训练图标以开始 CNN 训练。训练完成后，点击“应用”。选定的颗粒将以蓝色圆圈显示在断层图像上，或可在颗粒窗口中查看。通过选择更多的正负参考颗粒继续优化，并定期点击“保存”以保留进度。当卷积神经网络（CNN）表现令人满意后，点击“应用全部”以执行颗粒挑选。随后在多个断层图上评估结果，并根据需要重新训练。要保存每个断层图的坐标，请使用命令 e2projectmanager.py 重新打开 EMAN2 图形用户界面（GUI）。单击子断层平均图下方的箭头，然后选择手动框选。接着输入断层图的名称，再单击启动。随后依次单击文件、保存框选坐标和 tomogram_ha。txt 文件以保存坐标。导航至神经网络子文件夹和 info 子文件夹，以备份并保存网络。hdf、trainouts。hdf、segouts.hdf 和 boxes3Dref.hdf。通过将训练框大小从 8 更改为 14，训练第二个卷积神经网络以检测 M1 蛋白层和 VRNP 的存在。为了筛选颗粒，首先从 GitHub 仓库下载笔记本文件。然后打开 CNN 颗粒筛选的 IPYNB 笔记本，并加载所需的模块。将 HA 和 M1 坐标文本文件加载到笔记本中。使用开源3D库将它们以3D点云形式查看。接着，利用开源3D的统计离群值去除方法滤除HA坐标的离群点。然后，通过识别距离M1超过20个像素的HA点作为离群点，计算HA与M1点云之间的距离，并将剩余的坐标保存至输出文本文件中。使用 pts2 star file.IPYNB 将所有颗粒合并并保存为 star 文件。利用 WarpTools 提取弯曲因子为四的颗粒，并使用该代码在 RELION minus four 中进行初始子断层平均。将 warp star 文件转换为 RELION four 格式。然后，使用 RELION refine MPI 对部分粒子子集生成初始参考模型。利用 RELION refine MPI 对子断层图像进行 3D 自动精修。当达到收敛后，以 8 为 titan 平移偏移量、2 为步长，重复进行自动精修。利用 RELION refine 进行二维分类，以剔除垃圾颗粒。使用代码创建包含优质类别的 star 文件，然后合并各个单独的 star 文件。代表性断层图像显示病毒颗粒具有多形性，形态从球形到长条形不等。最终的亚断层平均图达到了6.0埃的全局分辨率，局部分辨率范围为5至7埃。在最终的HA重构图中，α螺旋和β折叠结构清晰可辨，表明精修后的结构图具有良好的结构质量。在HA头部和茎部的四个位置可识别出糖基化位点，证实最终重构图中可见糖链密度。

subnanometer-resolution-structural-determination-hemagglutinin-from

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

流感病毒冷冻电子断层扫描血凝素的亚纳米分辨率结构测定

本方案描述了一种利用冷冻电子断层扫描和三维图像处理技术测定膜蛋白结构的高通量方法。内容涵盖了样品制备、数据采集、数据处理与解析的详细步骤，并以HIV-1包膜糖蛋白作为该方法的代表性研究目标进行示例。这些计算处理流程的设计使得研究人员和学生能够远程开展工作，参与数据处理与结构分析。...

利用冷冻电子断层扫描与自动化子断层平均化技术测定HIV包膜糖蛋白的分子结构

我们介绍了一种关联显微技术，该技术结合了高速三维活细胞荧光光学显微镜与高分辨率冷冻电子断层扫描技术。通过成像动态的小型HIV-1颗粒与宿主HeLa细胞的相互作用，我们展示了该关联方法的能力。...

动态相互作用三维结构分析的关联显微技术

我们介绍了一种收集和处理完整线粒体冷冻电子断层成像图的方法。该技术可提供关于天然生物膜中大型膜蛋白复合物的结构、功能和组织的详细信息。...

通过电子冷冻断层扫描技术可视化线粒体中的ATP合酶二聚体

病毒颗粒附着于表面是通过超分辨率荧光成像或原子力显微镜（AFM）进行单病毒颗粒成像的前提条件。本文展示了一种用于实现病毒颗粒在玻璃表面可控黏附的样品制备方法，适用于原子力显微镜和超分辨率荧光成像。...

单病毒颗粒原子力显微镜与超分辨率荧光成像的样品制备

本文介绍了一种结合电子冷冻断层扫描技术、亚断层平均化方法及计算软件包 Jsubtomo...

利用 Jsubtomo 对电子冷冻断层成像重构结果中的病毒包膜糖蛋白刺突进行平均化处理

本文介绍了一种使用软件套件SPHIRE处理冷冻电镜图像的实验方案。该方案几乎适用于所有以接近原子级分辨率为目标的单颗粒电镜研究项目。...

使用 SPHIRE 从电子冷冻显微镜图像进行高分辨率单颗粒分析

我们提出了一种用于大分子高分辨率结构研究的冷冻生物样品冷冻聚焦离子束微加工薄片制备方案 原位 使用冷冻电子断层扫描技术。本方案提供了制备高质量、高重复性薄片的指南，用于对细胞内大分子的结构进行表征 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）.

样品制备与冷冻聚焦离子束微加工 酿酒酵母 用于冷冻电子断层扫描

本文描述了制备适用于在纳米尺度下通过透射电子显微镜进行液相电镜和冷冻电镜分析的病毒组装体的实验方案。...

在液体和冰中推进病毒组装的高分辨率成像

本实验方案描述了使用 Tomo5 进行高分辨率冷冻电子断层扫描远程数据采集，以及使用 emClarity 进行后续数据处理和子断层平均化的方法。以脱铁铁蛋白为例，详细展示了获得分辨率为 2.86 Å...

冷冻电子断层扫描远程数据采集与亚断层图像平均法

本视频方案演示了如何对病毒学样本进行扫描透射电子显微镜断层成像。为获得最佳结果，样本需通过高压冷冻及后续的冷冻置换方法进行制备。...

病毒学中的扫描透射电子显微镜断层成像：高压冷冻-冷冻置换样品的三维成像

了解利用冷冻电子断层扫描技术解析流感病毒血凝素在受体结合时的构象变化。该方法可在完整病毒颗粒上以亚纳米分辨率原位成像，揭示隐藏相互作用，为抗病毒药物研发提供结构基础。

利用流感病毒冷冻电子断层扫描技术解析血凝素的亚纳米级分辨率结构

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