流感病毒冷冻电子断层扫描血凝素的亚纳米分辨率结构测定
2025年11月7日
本文介绍了一种使用冷冻电子断层扫描成像的流感病毒数据处理方案，以及随后对血凝素糖蛋白进行亚断层扫描平均。该协议涵盖了从图像预处理到最终模型细化的分步数据处理。
我们的实验室利用结构生物学研究病毒及耐药性进化。在当前的研究中，我们正在表征流感血凝素在受体结合时如何改变构象。我们利用冷冻电子断层扫描技术可视化病毒形态的组织和结构。
具体来说，我们利用这种冷冻电子显微镜方式对多形病毒流感进行了成像。我们的方案使我们能够以亚纳米分辨率研究完整病毒上流感血凝素的原位组织和结构。这种更高的分辨率使我们能够可视化曾经隐藏的相互作用。
首先，启动一个Linux终端来激活Conda环境。用终端激活安装了ISO网络的Conda环境。创建一个名为tomo folder的子文件夹，然后把所有断层扫描文件移到那个文件夹里。
接下来，用代码在项目文件夹中生成星号文件。使用文本编辑器打开生成的星形文件，将零度倾斜图像的近似失焦值输入到第四列。现在在终端里运行CTFD卷积命令。
解卷后，激活EMAN2图形界面环境，开始粒子筛选的预处理。在断层扫描下，左键点击原始数据旁边的箭头，从下拉菜单选择导入断层扫描，然后选择文件。然后，左键点击分割旁边的箭头，选择预处理的断层扫描。
使用合适的默认参数。预处理后，会自动创建一个包含与进程断层扫描文件基名匹配的空白JSON文件的信息目录。在继续之前，先向文件添加埃像素信息。
要训练卷积神经网络（CNN）识别HA糖蛋白，需将工作目录更改为所用断层扫描的位置。然后用终端打开CNN训练界面。确认有四个窗户开着。
一个包含目录中的CNN参数和断层图信息，另外三个窗口包含良好参考、不良参考及CNN选中的粒子图像。在CNN图形界面中，点击新选项，初始化默认学习率为0.0001、框大小为8的CNN。在文件名称栏下，左键点击代表性的断层扫描图以打开它。
将光标悬停在打开的断层图上，点击鼠标滚轮打开新窗口。左键点击N号滑块以横贯Z轴。接下来，在开放的断层扫描中，使用良好参考面板选择10到20个对应HA的特征。正片窗口中会出现正片图像。
要移除一个，按住Shift并左键点击。现在切换到坏参考面板，选择10到20个对应特征的参考，如空膜斑块、RNP密度、基准标记和碎片。将迭代次数设置为50次，点击列车图标开始CNN训练。
培训结束后，请点击应用。选定的粒子会以蓝色圆圈形式显示在断层图上，或在粒子窗口中显示。继续精炼，选择更多正负参考，定期点击保存以保留进度。
当卷积神经网络表现满意后，点击“应用全部”进行粒子选择。然后通过多次断层扫描评估结果，并根据需要重新训练。要保存每个断层图的坐标，请使用命令 e2projectmanager.py 重新打开EMAN2图形界面。
点击断层图平均下的箭头，选择手动打包。现在输入断层扫描仪的名称，点击启动。然后依次点击文件，保存盒子线，tomogram_ha。
txt 以保存坐标。进入神经网络子文件夹和信息子文件夹进行备份和网络保存。HDF，火车出站。
HDF，隔离。hdf，以及boxes3Dref.hdf。通过将训练盒大小从8个调整到14，训练第二个CNN来检测M1蛋白层和VRNP的存在。
要策划粒子，首先从GitHub仓库下载笔记本。然后打开 CNN 粒子清理 IPYNB 笔记本，加载所需的模块。把HA和M1坐标文本文件加载到笔记本里。
使用开放的3D库将它们视为3D云。接下来，使用开放的三维统计离群值去除方法过滤掉HA坐标离群值。接下来，通过将距离M1超过20像素的HA点为离群值，计算HA与M1点云之间的距离，并将剩余坐标保存为输出文本文件。
将所有粒子串接，并使用 pts2 star 文件保存为星形文件。IPYNB。使用WarpTools提取弯曲因子四的粒子，并利用代码进行初始亚断层图平均，比例为RELION-4。将曲速星文件转换为RELION 4格式。
然后用 RELION 精细 MPI 生成粒子子集的初始参考。使用RELION refine MPI对断层扫描进行3D自动细化。收敛后，重复自动细化，泰坦平移偏移至八，步进至二。
利用二维分类技术，利用RELION精炼来丢弃垃圾粒子。用代码创建带有良好类的星形文件，然后将各个星形文件合并。代表性的断层扫描显示了形状从球形到细长形的多形病毒颗粒。
最终的亚断层图平均值达到6.0埃的全球分辨率，局部分辨率范围为5至7埃。最终HA重建中解析了α螺旋和β层，支持了精细图谱的结构质量。在HA头部和茎的四个位置均可识别糖基化位点，确认最终重建时糖链密度的可见性。
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概览
本文介绍了一种使用冷冻电子层析成像技术研究流感血凝素在受体结合时构象的协议。该协议能够以亚纳米分辨率可视化病毒的形态和结构。
关键研究组成部分
科学领域
- 结构生物学
- 病毒学
- 冷冻电子层析成像
背景
- 流感病毒表现出多形态形状。
- 血凝素是参与受体结合的关键糖蛋白。
- 了解构象变化可以为药物抗性研究提供信息。
- 冷冻电子层析成像提供了高分辨率成像能力。
研究目的
- 表征血凝素在受体结合时的构象变化。
- 可视化流感病毒的组织和结构。
- 增强对分子水平的病毒相互作用的理解。
使用的方法
- 冷冻电子层析成像用于成像病毒结构。
- 子层析图平均用于模型精细化。
- 图像预处理技术用于数据增强。
- 在完整病毒上现场可视化血凝素。
主要结果
- 成功以亚纳米分辨率成像流感血凝素。
- 识别了受体结合过程中之前隐藏的相互作用。
- 对病毒组织提供了详细的结构洞察。
- 为未来研究病毒糖蛋白建立了协议。
结论
- 该协议允许对流感血凝素进行高分辨率分析。
- 研究结果有助于理解病毒结构和功能。
- 这种方法可以应用于结构生物学中的其他病毒研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Subnanometer-resolution cryo-electron tomography of influenza hemagglutinin (HA) enables direct structural interrogation of viral glycoproteins in their native context, addressing a critical challenge in target validation for antiviral discovery. This workflow enhances predictive confidence in structure-based drug design and supports mechanistic de-risking at the earliest stages of antiviral portfolio development. The robust pipeline for HA visualization on intact virions positions structural biology as a foundational capability for translational virology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of HA conformation and organization on pleomorphic influenza virions.
- Supports functional target validation by resolving glycosylation sites and protein-protein interactions at subnanometer scale.
- Facilitates mechanistic de-risking by revealing structural features relevant to receptor binding and membrane fusion.
- Improves predictive confidence for downstream inhibitor or vaccine design targeting HA.
Screening & Assay Development
- Provides validated structural templates for in silico screening and rational design workflows.
- Standardizes particle picking and subtomogram averaging for reproducible structural outputs.
- Enables quantitative assessment of glycoprotein density and distribution on virion surfaces.
- Supports assay development by confirming the presence and accessibility of key epitopes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural findings with disease-relevant viral strains and glycoprotein variants.
- Enables continuity from molecular discovery to preclinical validation of HA-targeted interventions.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates by providing high-resolution structural benchmarks.
Pipeline & Workflow Integration
This cryoET pipeline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification and preclinical research for antiviral programs.
- Discovery Biology: Delivers high-resolution structural data to test mechanistic hypotheses about HA function and viral entry.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative structural outputs for computational and experimental screening platforms.
- Analytics: Provides robust measurements of glycosylation, secondary structure, and protein organization for comparative analyses.
- Translational Research: Bridges molecular findings to preclinical models by characterizing clinically relevant viral strains.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, modular workflow for structural analysis of diverse viral glycoproteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in target structure and function.
- Operational Value: Standardizes data processing and analysis for reproducible, scalable outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes candidates with validated structural engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement and triage of antiviral assets based on structural benchmarks.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-electron tomography, image processing, and neural network-based particle picking.
- Demands access to high-performance computing infrastructure and specialized software (e.g., EMAN2, RELION).
- Necessitates cross-team standardization of data formats, annotation, and quality control.
- Adaptation to other viral systems may require retraining of neural networks and protocol optimization.
- Resolution and throughput are limited by sample heterogeneity and data acquisition constraints.
