一种建立同基因型小鼠肺肿瘤原位模型的微创方法

目前我们的研究重点是了解肺癌疾病，并探索如何开发出与现有标准治疗（包括化疗、放疗和免疫治疗）相兼容的新型治疗手段。我们尚未发现可用于特异性研究早期肺癌的原位肺癌模型。本实验方案旨在提供清晰且可重复的操作指南，以填补这一空白。

该方案具有微创性且操作简便。此外，结合我们提供的标准，该方案可实现对肿瘤精准植入的筛选，并通过生物发光成像实现早期肿瘤检测。本方案使研究人员能够在宿主组织中研究肺癌早期阶段，从而推动新型抗癌药物的临床前研究，并有助于对肿瘤微环境的深入探索。

我们将利用该技术在临床前水平评估新型肺癌治疗方法的机制和疗效，并希望其能够推动未来患者的治疗。开始时，将麻醉后的小鼠以俯卧位置于加热装置上的鼻罩中，并在小鼠双眼涂抹眼膏。确认麻醉成功后，使用电推剪去除小鼠左侧背部一个2厘米×3厘米矩形区域的毛发。

从脊柱向内侧剃毛，从手术台向外侧剃毛，从最后一根肋骨向下剃毛，从肩胛骨上缘向头部方向剃毛，直至看不到毛发为止。将小鼠放置在预热装置上的空笼子中。观察其呼吸模式，直至小鼠恢复清醒，然后将其放回原笼，等待手术。

在收获细胞当天，于收集前3至4小时向培养板中加入含有50毫克/毫升庆大霉素的新鲜培养基。吸除培养板中的培养基，并用1×PBS洗涤贴壁细胞。随后在37摄氏度下用胰蛋白酶EDTA溶液孵育细胞1至2分钟。

加入新鲜培养基以中和胰蛋白酶。通过轻轻敲击或吹打培养板使细胞分散。然后将细胞悬液收集至50毫升锥形管中。

现在，将锥形管在室温下以 1,200 ×g 离心 3 分钟。确认管底有致密沉淀后，吸除上清液，并用 PBS 洗涤沉淀。将洗涤后的细胞沉淀重悬于 PBS 中，调整浓度至每毫升约 100 万至 200 万个细胞，用于计数。

将悬浮液通过40微米细胞滤网过滤后再进行后续操作。接着，取10微升细胞悬液与10微升台盼蓝混合。将染色后的样品加入血细胞计数板，进行细胞计数。

计算细胞总数和细胞活力。将细胞在室温下以1,200 G离心3分钟，吸除PBS，保留沉淀。用PBS中含0.5毫克/毫升的metra gel重悬细胞沉淀。

将细胞数量调整至所需浓度，总体注射体积为50微升。将细胞悬液置于冰上，以防止基质胶凝固。使用无菌纱布对麻醉动物的手术部位进行三次清洁，交替使用聚维酮碘和70%乙醇。

将灭菌的带孔手术单置于小鼠体表，孔径为3厘米×4厘米，并将高压灭菌的手术器械放置于手术单上。使用镊子辨认肩胛骨的颅侧边缘及胸廓肋骨的尾侧边缘。术者以拇指和食指绷紧皮肤，用10号手术刀片在肩胛骨正下方做一长约5毫米的浅表皮肤切口。

然后使用115毫米直剪刀钝性分离皮下脂肪与肋骨及肋间肌，注意不要剪穿这些组织。若因毛细血管损伤导致轻微出血，可用无菌棉签轻轻按压出血区域以止血。使用显微夹和镊子保持切口张开。

从第七根真肋开始，使用弯头中位点镊子向上计数，定位第四和第五根肋骨。将该区域标记为注射部位。现在，轻轻倒置细胞悬液管三到四次以混匀。

注射前，将50 µL悬浮液吸入一支无菌的300 µL、31号、8 mm胰岛素注射器中，确保无气泡存在。在注射器前端紧贴处放置一条4 mm厚的无菌金属胶带，作为限位器以控制注射深度。以90度角将50 µL细胞悬液注入第四与第五肋骨之间的肋间间隙，位置紧邻第四肋骨下方，进针后保持针头位置2至3秒。

以与插入时相同的角度缓慢拔出针头，并将其丢弃至锐器容器中。最后，使用两到三针方结缝合皮肤切口，并在缝合处涂抹兽用外科粘合剂以加强伤口闭合。生物发光成像在注射后第一天即可检测到实验小鼠体内与肿瘤相关的信号，且随着时间推移，每只小鼠注射25,000和50,000个细胞的两组均显示出明显的信号强度增加，其中50,000个细胞组的信号强度更高。

在25,000和50,000细胞组中，总肿瘤荧光信号均呈指数增长，在接种后第21天，50,000细胞组的信号强度达到每秒超过10的8次方个光子。假手术小鼠的肺组织中未见发光信号或可见肿瘤，而实验组小鼠肺组织中显示出强烈的发光信号和红色肿瘤团块。在注射后21天，纳入分析的小鼠肿瘤局限于左肺叶，未向周围组织扩散。