Name: 使用 RNA 原位 杂交测定对小鼠脑中的胰岛素受体 A 和 B 进行精确可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 学习使用双链原位杂交技术对小鼠脉络丛中的胰岛素受体A和B亚型进行高分辨率定位。该方法揭示了亚型特异性表达模式，为脑胰岛素信号传导及神经系统疾病的靶向治疗提供了新见解。

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本工作由美国国家衰老研究所/美国国立卫生研究院院内研究计划资助。

所有动物实验均按照美国国家衰老研究所（NIA）批准的方案进行，该研究所已获得美国实验动物护理评估与认证协会（AAALAC）的全面认证。实验方案经NIA院内研究计划（IRP/NIA）动物护理与使用委员会审查并批准。小鼠饲养于温度受控的设施中，采用12小时光照/12小时黑暗循环，自由饮水并提供标准饲料，除非另有说明。实验所用C57BL/6J雄性小鼠购自杰克逊实验室，实验时年龄为3–4个月。
1. 固定冷冻样本制备
<ol>
	<li>用新鲜配制的4%多聚甲醛（PFA）在1×PBS中灌注小鼠，并将完整脑组织置于新鲜配制的4% PFA中，在4 °C下固定17–24小时。&#160; 
	注意：脑组织（每个脑组织使用10 mL）在4% PFA中固定时间不得超过24小时。</li>
	<li>将组织浸入含10%（10 mL）蔗糖的1×PBS溶液中，于4 °C下孵育直至组织沉入容器底部。随后依次将组织转移至20%蔗糖溶液，最后转移至30%蔗糖溶液，每一步均需等待组织完全下沉。 
	注意：组织下沉所需时间因组织类型和大小而异。对于脑组织，大约需要18小时。</li>
	<li>将组织在OCT包埋介质中冷冻，并将组织块存放在密封容器中，于-80 °C保存。</li>
	<li>将甲醛固定的冷冻脑组织进行冠状面切片，厚度为10 µm，切片后于−80 °C保存备用。 
	注意：应将切片贴附于带正电荷的载玻片上；使用其他类型的载玻片可能导致组织脱落。若切片不立即使用，可在-80 °C保存最多3个月。</li>
</ol>
2. 双重检测实验前的切片预处理
<ol>
	<li>在检测当天，用1×PBS清洗载玻片5分钟，轻轻上下移动载玻片架以去除残留的OCT包埋剂。</li>
	<li>将载玻片在60 °C下烘烤30分钟。</li>
	<li>在预冷的含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS中对载玻片进行后固定，4 °C孵育15分钟。</li>
	<li>将载玻片依次通过乙醇系列：室温下50%乙醇5分钟，70%乙醇5分钟，100%乙醇5分钟，再用100%乙醇重复5分钟。</li>
	<li>室温下空气干燥载玻片5分钟。</li>
	<li>向每个组织切片滴加2–4滴过氧化氢，室温孵育10分钟。用蒸馏水冲洗一次。</li>
	<li>在烧杯中配制700 mL新鲜的1×靶修复溶液，用铝箔覆盖并加热至持续沸腾（99–100 °C）。 
	注意：使用前沸腾时间不得超过30分钟。同时，将烘箱（见材料表）预热至40 °C。</li>
	<li>小心将载玻片架浸入沸腾的靶修复溶液中，孵育5分钟。保持温度在98–102 °C之间，并密切监控。 
	注意：根据组织类型不同，沸腾时间可能需要调整（5–15分钟）。</li>
	<li>立即将热的载玻片架转移至盛有蒸馏水的容器中，上下移动3–5次。更换新鲜蒸馏水后重复一次。</li>
	<li>用新鲜的100%乙醇冲洗载玻片，上下移动3–5次。空气干燥载玻片。</li>
	<li>使用疏水屏障笔围绕每个组织切片画圈2–3次。在室温下让屏障完全干燥。</li>
	<li>将载玻片放入批量载玻片托盘中。向每个切片加入蛋白酶（见材料表），确保组织完全覆盖。在40 °C烘箱中孵育15分钟。 
	注意：根据组织类型和靶基因的不同，蛋白酶孵育时间可能需要调整。</li>
	<li>从烘箱中取出载玻片托盘并放入蒸馏水中。轻轻上下移动载玻片清洗2分钟，更换新鲜蒸馏水后重复此步骤两次。</li>
</ol>
3. 双重检测实验
<ol>
	<li>探针
	<ol>
		<li>额外准备两个切片，分别用于阳性对照和阴性对照探针。</li>
		<li>选择与目标探针具有相同数量 ZZ 对的对照探针。对于 1 个 ZZ 对，使用阳性对照和阴性对照（参见材料表）。</li>
		<li>使用前，将探针在 40 °C 下平衡 10 分钟，并将 AMP1-12 试剂恢复至室温（RT）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>探针杂交
	<ol>
		<li>短暂离心 C2 探针，并按 1:50 的比例与 C1 探针混合。加入足够量的探针混合液（100–200 µL），完全覆盖每个切片，将载玻片放入 40 °C 烤箱中孵育 2 小时。在室温下用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。</li>
		<li>Base Scope Duplex AMP1 应用
		<ol>
			<li>去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，加入 AMP1（100–200 µL），完全覆盖每个切片。放回烤箱，在 40 °C 下孵育30 分钟。</li>
			<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Base Scope Duplex AMP2 应用
		<ol>
			<li>去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，加入 AMP2（100–200 µL），完全覆盖每个切片。放回烤箱，在 40 °C 下孵育30 分钟。</li>
			<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Base Scope Duplex AMP3 应用
		<ol>
			<li>去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，加入 AMP3（100–200 µL），完全覆盖每个切片。放回烤箱，在 40 °C 下孵育15 分钟。</li>
			<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。 
			&#8203;注意：孵育时间不得超过 15 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Base Scope Duplex AMP4 应用
		<ol>
			<li>去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，加入 AMP4（100–200 µL），完全覆盖每个切片。放回烤箱，在 40 °C 下孵育15 分钟。</li>
			<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Base Scope Duplex AMP5 应用
		<ol>
			<li>去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，加入 AMP5（100–200 µL），完全覆盖每个切片。放回烤箱，在 40 °C 下孵育30 分钟。</li>
			<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Base Scope Duplex AMP6 应用
		<ol>
			<li>去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，加入 AMP6（100–200 µL），完全覆盖每个切片。放回烤箱，在 40 °C 下孵育15 分钟。</li>
			<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。 
			&#8203;注意：与 AMP3 相同，孵育时间不得超过 15 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Base Scope Duplex AMP7 应用
		<ol>
			<li>去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，加入 AMP7（100–200 µL），完全覆盖每个切片，在室温下孵育30 分钟。
			<ol>
				<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。 
				&#8203;注意：AMP7 需在&#160;室温（RT）下孵育 30 分钟。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Base Scope Duplex AMP8 应用
		<ol>
			<li>去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，加入 AMP8（100–200 µL），完全覆盖每个切片，在室温下孵育15 分钟。</li>
			<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。 
			&#8203;注意：AMP8 孵育时间为15 分钟，温度为RT。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>红色信号检测（C2）
		<ol>
			<li>短暂离心Fast Red-B，并按 1:60 的比例与Fast Red-A混合。</li>
			<li>将混合液加入每个切片（100–200 µL），盖上托盘，在避光条件下室温孵育 10 分钟。</li>
			<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次。 
			&#8203;注意：混合后的 Fast Red 溶液需在 5 分钟内使用完毕。避免光照（阳光或紫外线）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Base Scope Duplex AMP9 应用
		<ol>
			<li>去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，加入 AMP9（100–200 µL），完全覆盖每个切片。放回烤箱，在 40 °C 下孵育15 分钟。</li>
			<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Base Scope Duplex AMP10 应用
		<ol>
			<li>去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，加入 AMP10（100–200 µL），完全覆盖每个切片。放回烤箱，在 40 °C 下孵育15 分钟。</li>
			<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Base Scope Duplex AMP11 应用
		<ol>
			<li>去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，加入 AMP11（100–200 µL），完全覆盖每个切片。在室温下孵育30 分钟。</li>
			<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。 
			&#8203;注意：AMP11 需在室温下孵育 30 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Base Scope Duplex AMP12 应用
		<ol>
			<li>去除载玻片上多余的洗涤缓冲液，加入 AMP12（100–200 µL），完全覆盖每个切片。在室温下孵育15 分钟。</li>
			<li>用 1×洗涤缓冲液洗涤 2 次，每次 2 分钟。 
			&#8203;注意：孵育时间不得超过 15 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>绿色信号检测（C1）
		<ol>
			<li>短暂离心Fast Green-B管，按 1:50 的比例与Fast Green-A混合。</li>
			<li>将绿色溶液加入每个切片（100–200 µL），盖上托盘，在室温下孵育 10 分钟。</li>
			<li>在 1×洗涤缓冲液中洗涤 5 分钟，并用蒸馏水短暂漂洗。 
			注意：混合后的 Fast Green 溶液需在 5 分钟内使用完毕。避免光照。Green B 与 A 的比例为 1:50。红色和绿色底物均对酒精敏感，请勿使用任何含酒精的试剂。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 复染
<ol>
	<li>将切片浸入50%苏木精染色液中，室温下染色1分钟，直至组织呈现紫色。</li>
	<li>用自来水上下冲洗3–5次，更换新鲜自来水重复冲洗，直至背景清晰而组织仍保持紫色。</li>
	<li>将切片在0.02%氨水溶液中上下浸洗3次，直至组织变为蓝色。</li>
	<li>再次用自来水冲洗3–5次。</li>
</ol>
5. 封片
<ol>
	<li>将载玻片置于 60 °C 的干燥烘箱中完全干燥约 15 分钟。</li>
	<li>将载玻片浸入新鲜的二甲苯中。 
	注意：由于封片介质黏度较高，封片前短暂浸入二甲苯有助于介质在组织切片上更均匀地铺展，并减少盖玻片下气泡的形成。</li>
	<li>在载玻片和盖玻片上滴加封片介质（参见材料表），避免产生气泡。</li>
	<li>室温下静置干燥载玻片至少 5 分钟。</li>
</ol>
6. 评估样本
<ol>
	<li>在标准明场显微镜下以 20x 或 40x 放大倍数观察切片。（图 1）。 
	注意：阳性对照应在细胞中显示为点状颗粒。阴性对照在 20x 放大倍数下每 20 个细胞中不超过 1 个点状颗粒时可接受。</li>
</ol>
7. 评分（可选）
<ol>
	<li>使用图像分析软件（例如 Halo 或 QuPath）对每个细胞中的 RNA 点进行定量分析。</li>
</ol>

<ol><li>Häring, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+receptor%3A+signalling+mechanism+and+contribution+to+the+pathogenesis+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The insulin receptor: signalling mechanism and contribution to the pathogenesis of insulin resistance.</a> Diabetologia. 34 (12), 848-861 (1991).</li>
<li>Benecke, H., Flier, J. S., Moller, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+spliced+variants+of+the+insulin+receptor+protein%3A+expression+in+normal+and+diabetic+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alternatively spliced variants of the insulin receptor protein: expression in normal and diabetic human tissues.</a> J Clin Invest. 89 (6), 2066-2070 (1992).</li>
<li>Vella, V., Malaguarnera, R., Nicolosi, M. L., Morrione, A., Belfiore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin%2FIGF+signalling+and+discoidin+domain+receptors%3A+an+emerging+functional+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Insulin/IGF signalling and discoidin domain receptors: an emerging functional connection.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (11), 118522(2019).</li>
<li>Galal, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+isoforms+and+insulin+growth+factor-like+receptors%3A+implications+in+cell+signaling%2C+carcinogenesis%2C+and+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor isoforms and insulin growth factor-like receptors: implications in cell signaling, carcinogenesis, and chemoresistance.</a> Int J Mol Sci. 24 (19), 15006(2023).</li>
<li>Starks, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+is+associated+with+higher+cerebrospinal+fluid+tau+levels+in+asymptomatic+APOE%C9%9B4+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance is associated with higher cerebrospinal fluid tau levels in asymptomatic APOEɛ4 carriers.</a> J Alzheimers Dis. 46 (2), 525-533 (2015).</li>
<li>Belfiore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+isoforms+in+physiology+and+disease%3A+an+updated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor isoforms in physiology and disease: an updated view.</a> Endocr Rev. 38 (5), 379-431 (2017).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>BaseScope assays. , Advanced Cell Diagnostics, Inc. 
 <a target="_blank" href="https://acdbio.com/basescope-duplex-assay">https://acdbio.com/basescope-duplex-assay</a> (2025).</li>
<li>Dani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+and+spatial+map+of+the+choroid+plexus+across+brain+ventricles+and+ages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages.</a> Cell. 184 (11), 3056-3074.e21 (2021).</li>
<li>Schulingkamp, R. J., Pagano, T. C., Hung, D., Raffa, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptors+and+insulin+action+in+the+brain%3A+review+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Insulin receptors and insulin action in the brain: review and clinical implications.</a> Neurosci Biobehav Rev. 24 (8), 855-872 (2000).</li>
<li>Milstein, J. L., Ferris, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+as+an+insulin-sensitive+metabolic+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">The brain as an insulin-sensitive metabolic organ.</a> Mol Metab. 52, 101234(2021).</li>
<li>Moruzzi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+expression+of+insulin+receptor+isoforms+in+obesity%2Ftype+2+diabetes+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific expression of insulin receptor isoforms in obesity/type 2 diabetes mouse models.</a> J Cell Mol Med. 25 (10), 4800-4813 (2021).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

在脑内，胰岛素受体（IR）的表达具有异质性，在嗅球、下丘脑、海马和脉络丛等区域观察到较高的密度10。对特定脑区和细胞类型中变异表达模式的全面表征将提供关键信息，有助于我们研究并理解胰岛素和IGF-II信号在突触可塑性、学习和记忆中的特定作用12。此外，这还将加深我们对复杂神经系统疾病中病理过程的认识。脑内IR-A和IR-B表达的失调已被证实与多种神经及神经精神疾病相关，包括阿尔茨海默病、抑郁症、自闭症和精神分裂症6。鉴定亚型特异性的表达模式将是开发靶向IR-A或IR-B的选择性治疗策略的基础步骤，这一方向在治疗这些复杂的中枢神经系统疾病中尚属全新的探索领域。
BaseScope 双重检测技术基于成熟的 RNAscope 技术，能够以高特异性和空间分辨率检测短 RNA 序列和外显子连接区域，为研究复杂的生物学机制提供独特见解。该方法特别适用于在细胞水平上可视化大脑中的胰岛素受体（IR）亚型 IR-A 和 IR-B，尤其是在研究涉及外显子 11...

胰岛素受体（IR）是一种单次跨膜的酶受体，介导胰岛素多种多样的生理效应。该受体以二聚体蛋白形式发挥作用，每个单体由两条通过二硫键连接的肽链组成：包含配体结合域的胞外α亚基，以及具有内在酪氨酸激酶活性的跨膜β亚基1。通过第11外显子的可变剪接，IR基因的转录产生两种IR mRNA变异体。IR-A缺失第11外显子，而IR-B保留该外显子。因此，IR-A与IR-B在α亚基C末端附近存在一段12个氨基酸的序列差异，导致两者在结合成熟胰岛素以外的生长因子以及下游信号传导特性方面有所不同。尽管两种亚型对胰岛素具有相似的亲和力，但IR-A对胰岛素样生长因子-II（IGF-II）和胰岛素原的亲和力高于IR-B。IR-A和IR-B的表达模式因组织类型、细胞类型及疾病状态而异2。
它们在组织和疾病中的差异性表达凸显了其在生理和病理过程中所发挥的独特作用。脉络丛（choroid plexus, CP）是一种特化的结构，可产生脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF），并构成血-脑脊液屏障（blood-CSF barrier）的一部分，在营养物质转运、代谢废物清除以及神经保护中发挥关键作用，尤其在炎症状态下更为重要。两种胰岛素受体（IR）亚型均在脉络丛中表达，可能参与调控脑脊液的体积与成分。IR-A 通过与胰岛素样生长因子 II（IGF-II）的高亲和力结合，可能促进脉络丛上皮细胞的增殖及组织修复；而 IR-B 则可能介导胰岛素穿过血-脑脊液屏障，从而维持脑内胰岛素的可利用性，支持星形胶质细胞、神经元、胶质细胞的功能以及葡萄糖稳态3,4。
在无症状的阿尔茨海默病（AD）遗传风险个体中，糖尿病前期的胰岛素受体（IR）水平与脑脊液中tau蛋白升高相关5，而IR-A/IR-B比例的改变则与胰岛素抵抗、衰老以及增殖活性增加有关——这些因素可能促进癌症及其他病理过程的发展6。明确IR-A和IR-B亚型特异性的表达模式，是开发复杂中枢神经系统疾病新型治疗策略的关键步骤。然而，目前的方法（如免疫染色和qPCR）存在局限性：由于缺乏经过验证的抗体，并非所有蛋白质都能可靠地进行免疫标记；而尽管qPCR具有高度特异性，却缺乏空间分辨率。
为了克服这些局限性，我们采用了双重原位杂交（Duplex in situ hybridization, ISH）技术，这是一种基于RNAscope平台BaseScope的先进RNA检测方法。该检测方法采用独特的双Z探针设计，需与靶RNA序列串联结合，从而实现高特异性和高灵敏度，即使对丰度较低的转录本也能有效检测。通过多次探针结合事件对荧光或显色信号进行放大，增强了信号检测能力并降低了背景干扰7。与标准RNAscope不同，该方法经过优化，可检测较短的RNA序列（50–300个碱基），因此特别适用于在脑等复杂组织中识别可变剪接事件、单核苷酸变异以及稀有转录本8。
该检测可在明场下同时将靶标显示为 distinct 的绿色（C1）和红色（C2）显色信号。它适用于经4%多聚甲醛（PFA）或10%中性缓冲福尔马林（NBF）固定的组织，切片厚度为5 µm-15 µm（冰冻/石蜡包埋），且含有低至高丰度RNA的样本。由于该方法对RNA降解、过度固定以及探针误差较为敏感，&#160;我们需要优化预处理条件、探针设计和对照设置，以最大限度提高特异性并降低背景信号。在此，我们应用该双重原位杂交（Duplex ISH）检测方法，对小鼠脉络丛（CP）中IR-A和IR-B的表达模式进行表征，为胰岛素受体（IR）亚型的空间生物学特性及其在脑健康与疾病中的潜在&#160;作用提供了新的见解。

<table><tbody><tr><td>氨水</td><td>Electron Microscope Science&amp;nbsp;</td><td>26754-4A</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope 双重检测试剂盒</td><td>ACD Bio</td><td>323810</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope 双重检测阳性对照探针-小鼠(Mm)-C1-Ppib-1ZZ/C2-Polr2a-1ZZ</td><td>ACD Bio</td><td>700121</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope 双重检测阳性对照探针-C1-DapB-1ZZ/C2-DapB-1ZZ</td><td>ACD Bio</td><td>700141</td><td></td></tr><tr><td>吉尔苏木精 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS132-1L</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488</td><td>Invitrogen</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>HybEZ 烤箱、托盘、支架和洗涤托盘</td><td>ACD Bio</td><td>321721, 310012, 321716, 321717</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge 疏水屏障笔</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>INSR 亚型 A 和 B 探针：BA-Mm-Insr-tv1-E10E11, BA-Mm-Insr-tv2-E11E12-C2</td><td>ACD Bio</td><td>717411, 717421-C2</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素受体抗体</td><td>Cell Signaling&amp;nbsp;</td><td>23413</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 10x 靶标修复液</td><td>ACD Bio</td><td>322000</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 过氧化氢，蛋白酶 Plus</td><td>ACD Bio</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>20x 盐水-柠檬酸钠 (SSC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1325-1</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount 永久封片介质</td><td>Vector Laboratory</td><td>H-5000</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠脑内胰岛素受体a和b的rna精确可视化 原位 杂交实验

Precise Visualization of Insulin Receptors A and B in Murine Brain with an RNA In Situ Hybridization Assay

胰岛素受体（IRs）在所有组织和细胞类型中广泛表达。该受体存在两种功能不同的亚型——IR-A 和 IR-B，二者因外显子 11 的选择性剪接而相差 12 个氨基酸。这些亚型具有组织和细胞特异性的表达模式，其相对丰度在发育、衰老及疾病过程中发生变化。由于两种亚型序列高度相似，使用传统免疫学方法区分 IR-A 与 IR-B 一直具有挑战性。本文中，我们描述了一种新型的双重检测方法 原位 原位杂交（ISH）检测技术可实现组织中IR-A和IR-B表达的可视化。利用该方法，我们首次证明，尽管两种亚型均在小鼠脉络丛中表达，但以IR-A为主导。该技术为研究胰岛素受体亚型的空间分布提供了有力工具 原位 在不同组织中。尽管实时定量PCR能够检测单细胞中IR-A和IR-B的转录本 体外 在复杂组织中缺乏空间定位能力，凸显了双联原位杂交（Duplex ISH）技术的必要性与应用价值。

胰岛素受体（IR）是一种跨膜酪氨酸激酶受体，由两个胞外α亚基和两个跨膜β亚基组成，形成一个功能性的异源四聚体。α亚基介导胰岛素的结合，而β亚基具有内在的酪氨酸激酶活性，可启动下游信号传导。IR mRNA 对外显子11的选择性剪接产生两种IR亚型：IR-A和IR-B。其中，IR-B在其α亚基的C末端区域包含由外显子11编码的12个氨基酸片段，而IR-A则缺少该片段。
为了区分脑组织中的这些同工型，我们使用了两种特异性探针：靶向外显子10-12连接区（跳过外显子11）的IR-A探针，以及靶向外显子11-12连接区的IR-B探针。采用双联检测方法 原位 杂交（ISH），我们在小鼠脑的第三脑室和侧脑室中观察到了亚型特异性表达（图1A,B）。该检测产生青绿色（IR-A）和红色（IR-B）的显色信号，每个点状信号代表一个单独的RNA分子。该方法可实现单细...

我们建立了一种双联检测方法 原位 杂交检测技术用于绘制小鼠脉络丛中胰岛素受体亚型IR-A和IR-B的分布图谱，克服了传统方法的局限性。该高分辨率方法揭示了亚型特异性表达特征，为脑内胰岛素信号传导机制提供了新的见解，并为神经系统疾病的亚型靶向治疗带来潜在可能。

小鼠脑内胰岛素受体A和B的RNA精确可视化 原位 杂交实验

胰岛素受体（IRs）在所有组织和细胞类型中广泛表达。该受体存在两种功能不同的亚型——IR-A 和 IR-B——

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用 RNA 原位 杂交测定对小鼠脑中的胰岛素受体 A 和 B 进行精确可视化

本方案涉及一种非放射性方法 原位...

双荧光 原位 新鲜脑切片中的杂交反应

本方案已成功用于定量检测多种脊椎动物组织类型中 mRNA...

放射性 原位 用于检测组织中多样化基因表达模式的杂交技术

本视频展示了利用寡核苷酸探针检测受5-羟色胺综合征影响的大鼠脑组织中5-羟色胺受体RNA合成的方法。该实验方案包括组织预处理、探针杂交以及酶促检测，以在显微镜下可视化并定量分析5-羟色胺受体RNA的表达水平。...

使用寡核苷酸探针进行原位杂交研究大鼠脑切片中的RNA表达

来源：Baleriola, J., 等.，使用高分辨率原位杂交法检测脑切片中轴突定位的 mRNA。 J. Vis. Exp. (2015)本视频展示了利用荧光原位杂交和抗体染色技术，在固定的小鼠海马脑片中检测胆碱能轴突内 mRNA 的方法。荧光显微镜可揭示探针标记的 mRNA...

小鼠脑切片荧光原位杂交后神经元的免疫染色

RNA 原位 杂交（ISH）能够实现对细胞和组织中RNA的可视化。本文展示了如何将RNAscope...

使用高分辨率技术检测脑切片中轴突定位的mRNA 原位 杂交

由于缺乏特异性抗体，将基因表达定位到特定细胞类型可能具有挑战性。本文中，我们描述了一种通过结合双重荧光RNA原位杂交与免疫染色技术，实现基因表达同时三重检测的实验方案。...

双荧光联合检测 原位 小鼠脑切片中三种基因表达检测的杂交与免疫标记联合方法

利用RNA对小鼠脑切片中pre-mRNA选择性剪接进行定量分析 原位 杂交实验

新型的组织透明化技术（如溶剂清除器官的终极三维成像）可与免疫染色兼容，能够实现狂犬病病毒脑部感染及其复杂细胞环境的三维可视化。通过对厚的抗体标记脑组织切片进行光学透明化处理，可增加成像深度，并实现共聚焦激光扫描显微镜下的三维分析。...

溶剂清除脑组织中狂犬病病毒感染的高分辨率三维成像

本文介绍一种利用近红外染料结合免疫组织化学与高分辨率扫描，检测脑区蛋白质的实验方案。...

利用近红外荧光与高分辨率扫描检测啮齿类动物脑组织中的蛋白质表达

本方案描述了一种结合荧光的方法 原位...

多重荧光联合检测 原位 新鲜或固定小鼠脑切片上的荧光免疫组织化学杂交

采用多重原位杂交（ISH）技术，同时可视化成年小鼠整个迷走神经节复合体中两种G蛋白偶联受体和一种转录因子的转录本。该方案可用于生成迷走传入神经元转录谱的精确图谱。...

使用多重技术检测小鼠迷走感觉神经元中G蛋白偶联受体的表达 原位 杂交

学习使用双链原位杂交技术对小鼠脉络丛中的胰岛素受体A和B亚型进行高分辨率定位。该方法揭示了亚型特异性表达模式，为脑胰岛素信号传导及神经系统疾病的靶向治疗提供了新见解。

小鼠脑内胰岛素受体A和B的RNA精确可视化原位杂交实验

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小鼠脑内胰岛素受体A和B的RNA精确可视化 原位 杂交实验

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