Name: 使用微流体双层装置在微生物单细胞生长分析中产生快速氧振荡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T15:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学习使用双层微流控芯片在微生物单细胞生长分析中产生快速氧振荡的方法。该技术可精确控制氧气水平，帮助研究人员深入理解微生物在变化环境中的行为响应。

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KK 受日本学生支援机构（JASSO）学生交流支援项目（G2130401003N）以及德国研究基金会（DFG，German Research Foundation）- SFB1535 - 项目编号 458090666 资助。

1. 模具准备
<ol>
	<li>通过 3D 打印制备顶层模具。制造具有光滑表面的顶层模具，以确保所得 PDMS 顶层表面光滑。建议使用立体光刻（SLA）3D 打印技术。
	<ol>
		<li>使用 3D CAD 软件设计模具（图 1A）。确保设计包含与底层流体通道重叠的气体通道。此设计过程应与底层设计（步骤 1.2.1）并行进行。</li>
		<li>使用 SLA 3D 打印技术打印模具。清除打印模具上残留的树脂，并将其在异丙醇（IPA）浴中清洗 30 分钟（图 1B）。</li>
		<li>根据树脂类型和几何形状，通过暴露于 405 nm 光源下进行适当时间和温度的后固化处理。</li>
		<li>将模具置于超声波清洗仪中的 IPA 中浸泡 15 分钟，以去除模具内残留的未固化树脂，否则可能抑制 PDMS 的固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备用于底层的硅晶圆模具。
	<ol>
		<li>使用 CAD 布局编辑器设计微流控芯片（图 1C）。确保设计包含入口、流体通道和出口。</li>
		<li>采用双层光刻技术制作硅晶圆模具，具体方法如先前文献所述（图 1D）16。 
		注：底层通道尺寸为 µm 级，需要精确加工，而顶层通道尺寸为 mm 级。由于 SLA 3D 打印具有较短的制造周期，因而可实现更快的原型开发，因此使用 SLA 打印技术来制造较大的顶层模具结构。底层采用光刻技术制造，以确保加工精度。如果顶层通道也处于 µm 级且需要高精度，则也应考虑使用光刻技术制造模具。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PDMS 双层微流控芯片的制备
<ol>
	<li>将PDMS预聚物与固化剂按10:1的比例充分混合，配制PDMS预聚溶液；将混合物置于真空干燥器中脱气1小时。</li>
	<li>用异丙醇清洁顶层模具，并用压缩空气吹干。</li>
	<li>将PDMS倒入顶层模具中，随后进行热固化处理 80 °C 20 分钟（1st 固化步骤， 图1E）。第 1st 固化步骤允许在PDMS未完全固化时进行剥离、切割和打孔。</li>
	<li>加热20分钟后，用手或镊子检查PDMS的粘性。如果PDMS仍然发粘，需调整加热时间。</li>
	<li>将PDMS从上层模具中剥离，并切割成单个片状（此处为20 mm × 18 mm）。打孔（直径 = 0.75 mm）作为气体入口图1F）。用异丙醇冲洗顶层的底面，再用压缩空气吹干，然后贴上胶带进行清洁。</li>
	<li>用异丙醇清洁底层模具，并用压缩空气吹干。将底层模具固定在旋涂仪上，在模具中心滴加PDMS。将PDMS靠近晶圆处倒入，以减少气泡产生。若浇注PDMS后发现有气泡，使用洁净的镊子或针头将气泡移至外侧。</li>
	<li>以1000 rpm转速将PDMS旋涂于底层模具上，持续60 s，随后进行热固化处理 80 °C 10 分钟（1st 固化步骤， 图1G10 分钟后用手或镊子检查 PDMS 的粘性，并根据需要调整加热时间。</li>
	<li>将上层PDMS部件放置在模具中的下层PDMS上，并从顶部用力按压，以确保上下层之间充分贴合图1H).</li>
	<li>完全热固化 PDMS 80 °C 至少 1 小时（2nd 固化步骤）。2nd 固化步骤可实现PDMS的最终固化，使顶层和底层不可逆地键合在一起（图1H).</li>
	<li>轻轻将PDMS底层切成小片，小心地将整个PDMS芯片从模具上剥离图1H). 
	注意：如果PDMS芯片难以从模具上剥离，可考虑对底层模具进行进一步的表面处理，例如硅烷化或化学表面涂层，以利于剥离操作。如果在剥离过程中顶层与底层发生分离，请考虑缩短1st 固化步骤。</li>
	<li>在流体通道两端打孔（直径 = 0.5 mm），作为流体的入口和出口图1H）。用异丙醇冲洗芯片底部表面，再用压缩空气吹干，然后贴上透明胶带，仔细清洁底部表面。</li>
	<li>用等离子体氧化活化表面（25 s）后，将芯片与厚度为0.175 mm的盖玻片键合 图1H).</li>
	<li>将芯片放置在玻璃基底上后，用加压空气冲洗顶层，以确保PDMS膜底层与玻璃充分贴合。</li>
	<li>将键合好的芯片加热至 80 °C 10秒至1分钟，以增强结合稳定性。 
	注意：上述PDMS固化步骤及所需的固化时间可能受多种参数影响，如模具厚度、设备和环境条件。因此，若推荐的方案不适用于具体应用，应相应调整固化时间。</li>
</ol>
3. 实验设置
注意：标准实验装置采用配备互补金属氧化物半导体（CMOS）相机、荧光寿命成像显微镜（FLIM）相机（频域）、以及温度培养箱的倒置显微镜。调制激发激光光源（445 nm，100 mW）连接至FLIM相机。使用三个质量流量控制器（氮气、氧气和二氧化碳）进行气体调控。采用注射泵实现培养基灌流。
<ol>
	<li>准备用于气体（进样）和液体（进样与出样）灌流的管路。在实验开始前打开培养箱，使其达到设定温度（此处为 37 °C）。</li>
	<li>选择合适的物镜（此处，氧传感使用 20x，微生物观察使用 100x），如需要则添加浸油。使用粘合剂将双层芯片固定在芯片支架上。</li>
</ol>
4. 芯片上氧气控制与检测
<ol>
	<li>配制适当浓度的氧敏感染料溶液（此处为 3 mM 三(2,2'-联吡啶)二氯合钌(II)六水合物，RTDP）。</li>
	<li>使用已知荧光寿命（此处为 3.75 ns）的参考载玻片对 FLIM 相机进行校准。用 FLIM 相机测量信号强度，并调整曝光时间或显微镜光圈，使信号强度达到 0.68 - 0.72，以获得更佳的校准效果。</li>
	<li>将芯片固定器安装在显微镜载物台上。将适当的管路连接至流体入口和出口。使用注射泵以恒定流速（此处为 100 nL/min）开始灌注氧敏感染料溶液。</li>
	<li>用适当管路连接气体入口与质量流量控制器。开始通入氧浓度可控的气体（此处为 0% 或 21% 氧气，总质量流量为 600 mL/min）。</li>
	<li>测量无氧条件下的相位寿命（τ0）以及另一已知氧浓度（此处为 21%）下的相位寿命。利用 Stern-Volmer 方程计算猝灭常数（Kq），该方程用于描述氧气存在下的荧光猝灭行为。也可使用荧光强度（I）进行计算；但基于强度的测量可能受光源强度波动、光漂白等因素影响。 
	<img alt="氧浓度公式；猝灭方程；科学研究中的符号分析。" src="/files/ftp_upload/68697/68697eq1.jpg" style="opacity: 0.9;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 1"> 
	注意：建议在开始通气后等待数分钟，以确保校准准确，尤其是在目标氧浓度低至 0% 时。为提高精度，可结合其他除氧方法，例如使用除氧剂或额外的密封腔室装置。</li>
	<li>测量相位寿命，并利用 Stern-Volmer 方程计算相应的氧浓度。若需建立周期性变化的氧环境，可使用任意仪器控制系统，自动调节氮气和氧气的体积流量。</li>
</ol>
5. 细菌培养物的制备
<ol>
	<li>通过将目标微生物（此处为来自冷冻管的单个即用型菌珠，E. coli MG1655）接种至适宜培养基（此处为LB培养基，包含10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl）中，启动预培养，并在适宜条件下过夜培养（此处为37 °C、150 rpm）。</li>
	<li>使用分光光度计在600 nm处测定培养液的光密度（OD600）。</li>
	<li>通过将预培养液按一定比例接种至LB培养基中，启动下一阶段培养（此处初始OD600 = 0.3 或 0.0001）。继续培养直至菌液进入对数生长期。 
	注意：如果芯片内培养所用培养基与初次预培养所用培养基不同，建议使用芯片培养所用培养基进行第二次预培养，以使微生物适应新培养基16。</li>
	<li>通过将培养液稀释至适当光密度，制备接种液。将接种液转移至1 mL注射器中以用于后续步骤。对于E. coli，接种液的光密度（OD600）约为0.5。</li>
</ol>
6. 芯片上微生物培养及在受控氧条件下进行延时成像
<ol>
	<li>将芯片支架固定在显微镜载物台上。将芯片支架和PDMS芯片置于培养箱（此处为37 °C）中预热数小时，以减少因温度变化引起的位移而导致延时成像过程中失焦的风险。</li>
	<li>在开始培养前，通过调节氧气和氮气的质量流量来设定所需的初始氧浓度，同时保持总流量和二氧化碳流量恒定，开始通气。</li>
	<li>将芯片的气体入口与质量流量控制器连接。</li>
	<li>通过将装有接种液的注射器连接到流体出口，并手动推动注射器，将生物体接种至芯片中。通过显微镜观察，确认细胞是否已成功捕获在培养腔室中。</li>
	<li>细胞接种后，取下注射器，并将另一装有新鲜培养基的注射器连接至流体入口。手动推动注射器，冲洗培养基供给通道中残留的细胞。</li>
	<li>使用注射泵以恒定流速（此处为100 nL/min）开始灌注培养基。确保流速足够，因为流速不足可能导致腔室干燥。所需足够流速可能因多种因素而异，包括流体通道的几何结构以及上层气体通道的气体流速。</li>
	<li>开始延时图像采集。若在振荡氧浓度条件下进行培养，应在图像采集开始的同时启动质量流量控制器的自动控制。若气体控制与图像采集的启动存在延迟，应在后续图像数据分析中考虑该延迟因素。</li>
</ol>
7. 图像数据分析
<ol>
	<li>将延时图像按每个位置保存为一个图像堆栈。</li>
	<li>对图像进行预处理，使用图像分析程序对培养的菌落进行旋转、对齐和裁剪。预处理后的 .TIF 图像示例可在此处获取： https://doi.org/10.5281/zenodo.1398274715</li>
	<li>分割细胞并提取相关数值，如细胞数量、长度、面积、荧光强度等，并进一步分析生长行为。示例 Python 脚本可在此处获取： https://github.com/JuBiotech/Supplement-to-Kasahara-et-al.-202515</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了用于构建和运行双层微流控系统的操作流程，以在快速振荡的氧气条件下，利用高时空分辨率观察微生物的生长情况。结合延时成像技术，该平台可实现芯片上微生物在可控氧气条件下的培养与实时监测，从而能够分析微生物生长与氧气可利用性之间的关联。
在本实验方案中，顶层和底层分别制备，然后组装成一个完整的芯片。这种模块化设计可通过更换双层结构实现多种芯片设计。根据顶层和底层模具各自的尺寸与精度要求，采用不同的加工方法：顶层使用SLA 3D打印，底层使用光刻技术。该方法提高了整体加工效率。两层的组装通过两步PDMS固化过程完成。必须根据具体设计优化第一步固化的加热时间，因为模具厚度和局部加热条件可能影响PDMS的固化效果。
我们利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）具有高透气性的特性，实现快速的氧气切换。另一方面，氧气通过PDMS的被动扩散也可能影响氧气控制的精确性，尤其是在较低氧气浓度条件下。为弥补这一局限性，可对实验方案进行进一步优化。例如，氧气传感器的校准方法仍有改进空间。在本示例方案中，使用PDMS双层芯片在两个参考点——0%和21%氧气浓度下对传感器进行校准。因此，氧气检测的精确性依赖于能否准确建立无氧环境以完成校准。如方案所述，建议在开始气体冲洗后等待数分钟，以确保校准的准确性，特别是当目标为达到接近0%的极低氧气浓度时。然而，由于透气性PDMS芯片可能存在泄漏或残留空气，这一操作仍具挑战性。通过使用除氧化学试剂或将芯片置于密闭且无气体的腔室中，可进一步提高校准的准确性17,18。这些补充措施有助于在严格厌氧和低氧条件下对微生物行为进行更可靠且精确的分析。
所展示的装置将对多个研究领域具有重要意义。例如，该装置可用于模拟工业生物反应器中的氧气条件，其中氧气的可利用性被认为在时空上具有非均一性7,8,19,20。使用双层芯片可使研究人员表征并理解微生物在快速变化的氧气环境下的行为，而这是传统培养系统所无法实现的。

在各种环境因素中，氧气与微生物的生长和生理活动密切相关，尤其影响氧化应激反应、铁稳态以及致病性感染等细胞过程1,2,3。传统上，微生物培养通常在环境条件下或特定氧浓度下进行有限控制。然而在实际情况中，许多环境中的氧气条件往往并非恒定，而是随时间波动。例如，由于流体运动和微生物自身的运动性，微生物在水体环境中移动时可能在数秒至数分钟内经历氧气浓度的快速变化4,5,6。类似地，工业生物反应器中由于混合不充分也会形成非均一的氧气环境，从而影响微生物的生长和最终产量7,8。研究微生物对这类动态条件的响应，对于理解生态过程以及提升生物技术应用具有重要意义。
大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）等兼性厌氧微生物可根据氧气的可利用性在有氧和无氧代谢途径之间切换9,10。尽管先前的研究已探讨了这种代谢适应能力，但大多数研究集中在使用传统培养系统进行单次氧气变化的条件下，而这类系统无法模拟微生物经常面临的快速环境变化9,11,12,13,14。因此，目前对微生物如何在生理上响应频繁变化的氧气水平仍缺乏充分理解。
如前所述，传统的实验装置缺乏模拟快速氧浓度波动所需的精确性和速度，且不支持连续、高分辨率的监测。为解决这一问题，我们近期开发了一种专用的微流控平台，该平台采用双层聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片，可实现快速的氧气调控和单细胞成像15。本文提供了用于制备可产生快速氧振荡并实现在可控氧条件下对微生物进行单细胞生长分析的双层微流控芯片的实验方案。该芯片由两层组成——上层用于气体灌注，下层用于液体灌注和微生物培养。两层之间的中间薄膜可实现快速的气体交换。作为示例，大肠杆菌（E. coli）MG1655在所开发的芯片中进行了培养，并分析了其在恒定氧和振荡氧条件下的生长情况。

<table><tbody><tr><td>Clewin 5</td><td>WieWeb 软件，荷兰</td><td>N/A</td><td>版图编辑器</td></tr><tr><td>CMOS 相机</td><td>尼康，日本</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>肖特股份公司，德国</td><td>D263 Bio</td><td>39.5 mm × 34.5 mm × 0.175 mm</td></tr><tr><td>飞秒等离子清洗机</td><td>迪恩电子，德国</td><td>-</td><td>芯片等离子键合</td></tr><tr><td>Form 3B</td><td>Formlabs，美国</td><td>-</td><td>3D 打印机</td></tr><tr><td>寿命参考标准品</td><td>Starna Scientific，英国</td><td>UMM-SFG</td><td></td></tr><tr><td>质量流量控制器</td><td>V&amp;ouml;gtlin Instruments GmbH，瑞士</td><td>GSC-A9SA-BB22</td><td>氮气、氧气</td></tr><tr><td>质量流量控制器</td><td>V&amp;ouml;gtlin Instruments GmbH，瑞士</td><td>GSC-A9SA-BB21</td><td>二氧化碳</td></tr><tr><td>Model v3 树脂</td><td>Formlabs，美国</td><td>RS-F2-DMBE-03</td><td>3D 打印树脂</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>卡尔·罗斯，德国</td><td>3957.1</td><td>LB 培养基组分</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E 2</td><td>尼康，日本</td><td>-</td><td>倒置显微镜</td></tr><tr><td>pco.flim 相机</td><td>PCO AG，德国</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>pco.flim 激光器</td><td>Omicron-Laserprodukte GmbH，德国</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>卡尔·罗斯，德国</td><td>8986.1</td><td>LB 培养基组分</td></tr><tr><td>Plan Apo &amp;lambda;</td><td>尼康，日本</td><td>-</td><td>100× 油镜，20×</td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）</td><td>陶氏化学公司，美国</td><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体套件</td><td></td></tr><tr><td>打孔工具，&amp;Phi;0.50 mm</td><td>世界精密仪器，美国</td><td>504528</td><td></td></tr><tr><td>打孔工具，&amp;Phi;0.75 mm</td><td>世界精密仪器，美国</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>ROTI Store 冻存管</td><td>卡尔·罗斯，德国</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 2016 x64 版</td><td>达索系统，法国</td><td>N/A</td><td>3D CAD</td></tr><tr><td>基底旋转涂覆仪</td><td>APT Automation，德国</td><td>SPIN150i</td><td>PDMS 旋涂</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>CETONI，德国</td><td>neMESYS</td><td></td></tr><tr><td>温控培养箱</td><td>Okolab，意大利</td><td>-</td><td>显微镜设备</td></tr><tr><td>三(2,2&amp;rsquo;-联吡啶)二氯合钌(II)六水合物（RTDP）</td><td>Acros Organics，比利时</td><td>208750010</td><td></td></tr><tr><td>管路</td><td>圣戈班，法国</td><td>Tygon F-4040-A</td><td>气体进样管路</td></tr><tr><td>管路</td><td>圣戈班，法国</td><td>Tygon AAD04103</td><td>液体管路</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>卡尔·罗斯，德国</td><td>2363.3</td><td>LB 培养基组分</td></tr></tbody></table>

使用微流控双层装置在微生物单细胞生长分析中实现快速氧气振荡

Creating Rapid Oxygen Oscillations in Microbial Single-cell Growth Analysis using a Microfluidic Double-layer Device

利用微流控技术结合延时显微镜进行微生物单细胞分析，有望在时空分辨率下研究微生物在受限环境中的生长行为，提供传统培养与分析平台无法获得的见解。氧气在决定微生物生长过程中起着关键作用。然而，在微生物微流控分析中，尚未实现秒级的时间控制。我们近期开发了一种双层PDMS微流控芯片，可实现数十秒量级的氧气时间控制。该芯片包含上层气体通道层和底层培养及流体灌注层，两层之间由一层薄的中间PDMS膜隔开，从而实现两层之间的快速气体交换。在本方法学论文中，我们详细阐述了该芯片的制备、表征以及利用该芯片进行微生物培养的操作流程。作为代表性结果，我们展示了在数十秒内快速切换氧气浓度的能力、微生物的持续培养，以及在恒定和振荡氧气条件下进行的时间分辨生长分析。本实验方案旨在帮助希望在其微流控系统中实现氧气时间控制的研究人员。

PDMS 双层芯片的制备 
制备的双层芯片如图 2A所示，其中以不同颜色标示气体通道（红色）和流体通道（蓝色），便于可视化。该芯片包含三条相同的流体通道以及与之重叠的气体通道，可实现并行实验。流体通道内设有培养区域，包含一系列培养腔室（图 2A(i)）。细胞被捕获在培养腔室内，并以单层形式生长，从而支持高分辨率、高采集速率的时间序列成像。芯片的截面显示，上层厚度为 3 mm，底层厚度为 65 µm，气体通道中的气体可通过中间的 PDMS 膜快速扩散至流体通道（图 2A (ii-ii')）。
芯片上的氧气控制 
采用荧光寿命成像显微技术（FLIM）和氧敏感染料测试了所开发芯片的气体交换能力15。如图2B所示，当氧气浓度在21%和0%之间切换时，流体通道内的氧气浓度在数十秒内即相应地出现下降或上升。这些氧气测量结果表明，所开发的双层微流控芯片能够在数十秒内实现快速的氧气振荡。
在恒定氧气条件下进行微生物培养 
首先利用该芯片在不同氧气浓度的恒定气体环境中表征兼性厌氧菌E. coli的生长情况。供气中始终添加二氧化碳，因为在预实验中我们观察到，当二氧化碳缺乏时，E. coli的生长受到限制（数据未显示）。图3A和图3B分别展示了在有氧（21% 氧气供应）和无氧（0% 氧气供应）条件下E. coli的代表性相差显微图像。培养3小时后，在有氧条件下生长的E. coli形成的菌落大于无氧条件下的菌落。定量分析也显示菌落尺寸（Acolony）的增长速率随氧气的可利用性不同而存在差异，如图3C中的生长曲线所示。需要注意的是，Acolony已通过初始面积归一化处理，以便在不同菌落和条件下进行比较。指数生长速率µ可从生长曲线中测定，方法如下，并总结于图3D中。
<img alt="细菌生长速率方程 μ=(lnA_colony,t-lnA_colony,t0)/(t-t0)，对数分析公式。" src="/files/ftp_upload/68697/68697eq2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 2">
实验结果验证了该设备在目标浓度下控制氧气的能力，并能有效分析从获取的时间序列图像中得到的相应微生物生长情况。
在振荡氧条件下进行微生物培养 
最后，在振荡氧条件下培养大肠杆菌（E. coli），通过在有氧和无氧供气阶段之间切换，切换周期为 T'。研究考察了从 60 分钟到 1 分钟范围内的多种 T' 值，以检验在振荡氧条件下进行时间分辨生长分析的能力。图 4 展示了在不同 T' 值（分别为 60、30、10、5、2 和 1 分钟）的振荡氧条件下定量测定的 E. coli 生长情况。除了基于 Acolony 的生长曲线外，还进一步确定了瞬时生长速率 µΔt，以获得时间分辨的生长动态信息。
<img alt="微生物生长速率方程 μΔt，显示菌落随时间的变化；数学公式。" src="/files/ftp_upload/68697/68697eq3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 3">
在图4中，恒定好氧和厌氧条件下的生长速率也以虚线表示（µ21%、µ0%），作为生长参照。E. coli的生长在交变气体条件下表现出明显的动态变化。例如，当通气阶段从好氧切换至厌氧条件（T' = 60 分钟）后，其生长呈现（i）响应阶段：生长速率突然下降；（ii）恢复阶段：生长速率逐渐回升；以及（iii）稳定阶段：生长速率在µ0%附近趋于稳定。在不同T'条件下，E. coli的生长动态均实现了时间分辨的成功观测，其中最短切换时间可达1分钟；在此类短时间切换下，由于细胞适应气体环境变化的时间有限，E. coli表现出单调上下波动的生长速率。此外，生长行为不仅可在菌落水平上进行分析，还可深入至单细胞水平。图5展示了在不同切换间隔T'下，单个细胞面积随氧气振荡的变化过程。通过观察相邻数据点的变化趋势，即可推断单细胞的生长情况，无需进行复杂的轨迹追踪分析。单细胞水平的生长行为与图4中菌落水平所观察到的结果相似：在好氧通气阶段细胞面积增长较快，并且在气体切换时刻生长速度发生明显转变。本研究结果表明，该系统具备在交变气体条件下培养微生物的能力，并可实现微生物生长与氧气可利用性之间关系的时间分辨分析。
<img alt="微流控芯片制备：包含模具设计、PDMS成型和组装流程的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：双层芯片制备流程。该流程包括（A, C）模具设计、（B, D）模具加工、（E–G）PDMS成型以及（H）芯片组装。本图经修改自15。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="带培养室的气液通道微流控装置；氧气水平动态图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：制备的双层芯片及其氧气调控能力。（A）展示了所制备芯片的代表性图像，其中气体通道（红色）和液体通道（蓝色）以不同颜色标识以便观察。图（i）为扫描电镜图像，显示一系列通过两侧液体通道连接的培养室（比例尺：100 µm）。图（ii-ii'）为芯片的横截面，显示厚度为 3 mm 的上层和厚度为 65 µm 的下层。（B）在有氧（21% 氧气）与无氧（0% 氧气）条件切换后，液体通道中测得的氧气浓度变化。本图已根据文献15进行修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同氧气水平下的细菌生长；延时显微镜观察、生长速率曲线、Monod 模型。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：在恒定氧气条件下培养 E. coli。（A）细胞在有氧条件下（21% 氧气供应）培养 3 小时，并通过相差显微镜获取延时图像。（B）细胞在无氧条件下（0% 氧气供应）培养，并在 3 小时内获取延时图像。（C）根据不同恒定氧气条件下的 Acolony 绘制细胞生长曲线。（D）指数生长速率的计算结果与汇总。所有比例尺 = 5 µm。数据以均值 ± 标准差表示，n = 35 个菌落（0%）、27（0.1%）、21（0.5%）、16（1%）、13（5%）、13（10%）、29（21%）。本图改编自15。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>
<img alt="好氧与厌氧条件下微生物生长动态；响应、稳定化、恢复" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4: E. coli 在振荡氧条件下培养。 在不同振荡氧条件下考察细胞生长情况（T'，好氧与厌氧条件之间的切换间隔）。基于细胞生长的 A菌落 随时间变化绘制（上图），以及 µΔt 随时间变化绘制，以实现时间分辨的数据解读（底部）。数据表示为均值 ± 标准差，n = 5 个菌落（60 分钟）、3（30 分钟）、4（10 分钟）、4（5 分钟）、4（2 分钟）、5（1 分钟）。该图已修改自15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="好氧与厌氧细胞生长、面积与时间关系、图示系列、呼吸阶段分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68697/68697fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：在振荡氧条件下培养的 E. coli 的单细胞面积（A single cell）。 数据来自每个切换间隔 T' 的代表性菌落。该图经修改自15。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68697/68697fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本方案介绍了一种用于制造双层微流控芯片并在快速氧浓度波动条件下分析微生物生长的方法。通过在流体通道中进行氧气检测和微生物培养，验证了该装置的性能。

利用微流控技术结合延时显微镜进行微生物单细胞分析，有望研究微生物在……条件下的生长行为

creating-rapid-oxygen-oscillations-microbial-single-cell-growth

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

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