Name: 白色和棕色脂肪移植物：纠正黑色和棕褐色短小鼠 （BTBR） 肥胖小鼠生殖、代谢和肾缺陷的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 了解白色和棕色脂肪组织联合移植技术，用于改善BTBR肥胖小鼠的代谢、生殖和肾功能。该方法通过标准化移植方案，为研究心肾代谢疾病提供可重复的动物模型。

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感谢实验与外科培训中心（CETEC）和技术团队以及犹太研究与教育研究所（IIEP）的技术团队提供的支持。本研究得到了巴西高等教育人员改进协调机构（CAPES/Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior）向 S.B. 提供的硕士研究奖学金、向 M.L.F. 提供的直接攻读博士学位研究奖学金，以及圣保罗州研究支持基金会（FAPESP/Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo；编号 2024/08173-6）向 M.O.M. 提供的硕士研究奖学金和（FAPESP/Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo；编号 2019/12636-3）向 M.T.A.B-R. 提供的科研启动奖学金资助。本研究还获得了圣保罗州研究支持基金会（FAPESP/Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo；编号 2017/23195-2 和编号 2021/02216-7）以及欧洲糖尿病研究基金会（EFSD/European Foundation for the Study of Diabetes）向 É.B.R. 提供的项目资助。作者声明，本稿件中未使用任何人工智能（AI）生成的内容。

所有实验均经巴西圣保罗以色列爱因斯坦医院（HIAE）机构动物护理与使用委员会批准，并在圣保罗犹太研究与教育研究所注册（编号：3309-18 和编号：4900-21）。所用试剂与设备的详细信息列于 材料表.
注意：使用BTBR肥胖小鼠（瘦素基因敲除，纯合子，ob/ob）作为2型糖尿病（T2DM）、糖尿病肾病（DKD）和肥胖的模型。4至5周龄的雌性BTBR肥胖小鼠作为脂肪组织移植的受体。供体动物为雌性BTBR ob/+（杂合子）或 +/+（野生型）小鼠（基因型未确认，但表型为瘦型）。移植时，受体小鼠的平均体重范围为25至32 g。所有动物均饲养在独立通风的笼具中，环境条件标准，自由摄食和饮水，12小时光照/黑暗循环，并控制环境温度。每笼最多饲养五只动物。
1. 手术操作
注意：所有手术器械应在使用前通过热珠灭菌器加热至240-270 °C进行灭菌，随后用70%酒精处理。所有试管在使用前应通过高压灭菌法进行灭菌。
<ol>
	<li>使用100% v/v异氟烷过量（2.5-5%）处死供体小鼠，随后进行颈椎脱位（图1A）。</li>
	<li>将动物置于仰卧位（腹部朝上），用0.5%醇性氯己定二葡糖酸盐消毒下腹部。沿腹中线做2-3 cm切口，以采集腹股沟白色脂肪组织（WAT）（图1B）。将切除的组织置于冰上盛有3 mL溶液的离心管中。</li>
	<li>将动物重新置于俯卧位（腹部朝下），用0.5%醇性氯己定二葡糖酸盐消毒肩胛区域。在肩胛骨之间沿中线做1-2 cm切口，以采集肩胛间棕色脂肪组织（BAT）（图1C）。合并10-14只供体的脂肪组织。确保总WAT与BAT重量之和等于受体体重的10–15%。</li>
	<li>仔细清理脂肪组织，去除可能附着的毛发。分别使用16 G针头和3 mL注射器匀浆WAT和BAT（图1D）。</li>
	<li>使用分析天平测量最终脂肪重量（图1E），并在移植前将样品置于冰上保存。</li>
	<li>将受体BTBR肥胖小鼠置于100% v/v异氟烷麻醉舱中进行诱导麻醉（2.5-5%），随后通过面罩维持麻醉（1.5-2.5%）。当呼吸频率降至每3秒≤1次时，通过缩足反射试验确认麻醉深度，并将动物置于俯卧位（图1F）。</li>
	<li>使用2.0%非醇性氯己定二葡糖酸盐消毒背部区域（图1G）。</li>
	<li>使用16 G针头在背部表面6-26个位点分别注射100-200 µL匀浆后的脂肪。使用镊子辅助均匀分布。移植后，每个注射位点应用0.5%氯己定溶液处理（图1H）。</li>
	<li>肌肉注射曲马多（40 mg/kg；50 mg/mL溶液）以镇痛，并将动物单独饲养，防止恢复期间发生伤害。 
	注意：术后立即每15分钟观察动物1-1.5小时，并在术后6-8小时进行随访检查，评估疼痛的临床症状，必要时给予镇痛处理。</li>
	<li>次日，用0.5%氯己定溶液清洁注射部位，并给予第二剂曲马多。</li>
</ol>
<img alt="啮齿类动物脂肪组织研究流程：安乐死、组织采集、称重、麻醉、注射。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68759/68759fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：脂肪移植操作示意图。（A）使用异氟烷在密闭箱中对供体实施安乐死。（B）采集腹股沟白色脂肪组织（WAT）。（C）采集中肩胛间棕色脂肪组织（BAT）。（D）脂肪组织匀浆。（E）脂肪称重。（F）对受体进行麻醉。（G）背部无菌处理。（H）使用镊子辅助技术进行脂肪注射。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68759/68759fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 移植后交配
<ol>
	<li>移植后两周，将雌性BTBR肥胖小鼠与雄性BTBR ob/+（杂合子）小鼠合笼以进行交配。</li>
</ol>
3. 功能评估
<ol>
	<li>每周使用分析天平测量体重。</li>
	<li>在五个时间点（第4-7周、第8-10周、第14-16周、第18-20周以及第24-26周）使用血糖仪评估空腹血糖水平。</li>
	<li>将动物置于代谢笼中，自由饮水，持续6小时，以收集尿液样本。</li>
	<li>在第6-8周时，采用ELISA方法测定尿白蛋白水平，并使用比色苦味酸法测定尿肌酐水平。通过将白蛋白浓度（µg）除以肌酐浓度（mg）计算尿白蛋白与肌酐比值（uACR）。</li>
</ol>
4. 形态学分析
<ol>
	<li>通过给予 100% v/v 异氟烷过量（2.5-5%），随后进行颈椎脱位以确保死亡，对 24 周龄的受体小鼠实施安乐死。</li>
	<li>在 24 周龄时采集卵巢、肾脏和胰腺。</li>
	<li>将收获的器官置于 10% 中性缓冲福尔马林中，并在室温下固定 24–48 小时。</li>
	<li>固定后，使用自动组织处理机对组织进行脱水处理，并包埋于石蜡中以进行组织学分析。
	<ol>
		<li>将组织依次浸入下列乙醇溶液中，每种溶液处理 1 小时：70%、85%、95%（两次）和 100%（两次）。</li>
		<li>将组织转移至新鲜二甲苯中处理 1 小时，随后再转移至第二份二甲苯中继续处理 1 小时。</li>
		<li>将组织浸入熔融石蜡（6 °C）中 1 小时，然后转移至新鲜熔融石蜡中再处理 1 小时。</li>
		<li>将组织置于装有熔融石蜡的加热模具中定向排列，并在室温下冷却使其凝固。</li>
		<li>使用切片机从每个石蜡块中连续切取四张不连续的 3.5 µm 厚切片。将切片带漂浮于 4 °C 水浴中展平，然后将单个切片转移至带正电荷的玻璃载玻片上。沥干多余水分后，将载玻片置于 3 °C 的加热板上 60 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用苏木精-伊红（H&amp;E）染色法评估卵巢中的卵泡数量和胰岛大小。
	<ol>
		<li>将石蜡包埋组织切片置于 6 °C 烤箱中孵育 1 小时。将切片转移至盛有新鲜二甲苯的容器中，孵育 30 分钟以溶解石蜡，并在 15 分钟后更换为新鲜二甲苯溶液。</li>
		<li>将切片依次浸入二甲苯:乙醇混合液、100% 乙醇、85% 乙醇和 70% 乙醇中，每种溶液处理 30 秒。</li>
		<li>用自来水冲洗 10 秒，用 Harris 苏木精染色 30 秒，再浸入 95% 乙醇中 3 秒。</li>
		<li>将切片依次浸入 70%、85%、100% 乙醇和二甲苯:乙醇混合液中，每种溶液处理 30 秒。</li>
		<li>将切片浸入新鲜二甲苯中 5 分钟，随后再转移至第二份二甲苯中继续处理 5 分钟，以确保染色固定。</li>
		<li>使用封片介质加盖盖玻片进行封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用过碘酸-雪夫（PAS）染色法评估肾组织切片中的肾小球大小及系膜基质扩张情况。
	<ol>
		<li>将切片在 6 °C 孵育 1 小时，随后浸入新鲜二甲苯中 5 分钟以脱蜡。</li>
		<li>将切片依次浸入 99%、95% 和 70% 乙醇中，每种溶液处理 30 秒。</li>
		<li>用自来水冲洗 10 秒。</li>
		<li>加入 10 滴过碘酸，孵育 10 分钟。</li>
		<li>用流动水冲洗 3 分钟并干燥。</li>
		<li>加入 10 滴雪夫试剂，在避光环境中孵育 15 分钟。</li>
		<li>用流动水冲洗 3 分钟并干燥。</li>
		<li>加入 10 滴 Harris 苏木精进行复染，孵育 3 分钟。</li>
		<li>将切片用流动水冲洗 3 分钟并干燥。</li>
		<li>将切片依次浸入 70%、85%、100% 乙醇和二甲苯:乙醇混合液中，每种溶液处理 30 秒。</li>
		<li>将切片浸入新鲜二甲苯中 5 分钟，随后再转移至第二份二甲苯中继续处理 5 分钟以固定染色。</li>
		<li>使用封片介质加盖盖玻片进行封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过免疫组织化学（IHC）法评估卵巢和肾脏中的卵泡凋亡（cleaved caspase-3）以及肾脏中的足细胞数量（WT-1+ 细胞）。
	<ol>
		<li>将切片在 6 °C 孵育 1 小时，随后用二甲苯处理 30 分钟（15 分钟后更换二甲苯）。</li>
		<li>将切片依次浸入 100%、90%、70% 乙醇和水中，每种溶液处理 30 秒。</li>
		<li>通过微波加热切片于柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中 95 °C 处理 12 分钟，进行抗原修复以暴露抗原位点。</li>
		<li>用 1x 洗涤缓冲液冲洗 15 分钟，每 5 分钟更换一次缓冲液。</li>
		<li>使用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，以避免背景染色；使用牛血清白蛋白（BSA）防止非特异性结合。 
		注：cleaved caspase-3 染色时，阻断内源性过氧化物酶活性 7 分钟 30 秒；WT-1 染色时，阻断 5 分钟。</li>
		<li>重复步骤 4.7.4 的洗涤过程。</li>
		<li>每张切片加入 10 µL 针对 cleaved caspase-3（凋亡）和 WT-1（足细胞）的一抗。在避光、湿润的环境中  °C 孵育过夜。</li>
		<li>重复步骤 4.7.4 的洗涤过程。</li>
		<li>每张切片加入 10 µL 辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，在室温避光条件下孵育 1.5 小时。</li>
		<li>重复步骤 4.7.4 的洗涤过程。</li>
		<li>每张切片加入 10 µL DAB（3,3'-二氨基联苯胺）显色剂以显示 HRP 活性，产生棕褐色沉淀。 
		注：cleaved caspase-3 染色时，DAB 孵育 1 分钟 30 秒；WT-1 染色时，孵育 45 秒。</li>
		<li>重复步骤 4.7.4 的洗涤过程。</li>
		<li>根据所需染色强度，用 Harris 苏木精复染切片 30 秒至 1 分钟。</li>
		<li>用自来水冲洗 1–2 分钟，直至水流清澈。</li>
		<li>将切片依次浸入 70%、85%、95% 和 100% 乙醇中（每种 30 秒），再浸入二甲苯:乙醇混合液中（30 秒）。</li>
		<li>将切片置于新鲜二甲苯溶液中 5 分钟，随后转移至第二份二甲苯中继续处理 5 分钟。</li>
		<li>使用封片介质加盖盖玻片进行封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用倒置光学显微镜在 40 倍放大倍数下观察染色切片。使用自动图像分析软件为各器官选择感兴趣区域（ROI）。
	<ol>
		<li>卵巢（H&amp;E）：计数并分类每张切片中的卵泡类型。</li>
		<li>胰腺（H&amp;E）：使用 ROI 工具手动勾勒每个胰岛的轮廓以选择胰岛。定义 ROI 后，软件将自动计算其面积（单位：平方微米，µm2）。</li>
		<li>肾脏（H&amp;E）：使用 ROI 工具手动勾勒每个肾小球簇的外缘以量化肾小球面积。使用 测量面积 功能获取其面积（单位：µm2）。勾勒完成后，软件将自动计算面积（单位：µm2）。</li>
		<li>肾脏（PAS）
		<ol>
			<li>为量化系膜基质，使用 阈值 工具识别并选择肾小球内 PAS 阳性（品红/粉红色）区域。根据需要调整颜色和强度阈值，利用 预览 窗口优化选择。将选定的 PAS 区域定义为 ROI。勾勒完成后，软件将自动计算其面积（单位：µm2）。</li>
			<li>通过计算 PAS 阳性区域占总肾小球面积的百分比，对系膜基质扩张进行归一化处理。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>卵巢和肾脏（cleaved caspase-3 免疫组化）
		<ol>
			<li>选择对应于卵泡或肾小球结构的 ROI。通过调整色调、饱和度和强度阈值应用颜色掩模，以识别 DAB 阳性（棕色）染色。使用 预览 功能确保准确选择 DAB 信号，并优化阈值设置以排除苏木精（蓝色）复染和非特异性背景。</li>
			<li>定义所需阈值后，将选择区域设为 ROI 并测量 DAB 阳性区域面积（µm2）。通过将 DAB 阳性面积除以总 ROI 面积并乘以 100，计算染色区域百分比。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>肾脏（WT-1+ 免疫组化）：计数每个肾小球中呈棕色染色的细胞核数量，以估算足细胞数量。 
		注：每张切片的卵泡计数（均值 ± 标准差，SD）为：BTBR 肥胖型（7.7 ± 3.11）、移植组（5.8 ± 3.24）、BTBR 瘦型（4.6 ± 5.62）。每张切片的胰岛计数（均值 ± SD）为：BTBR 肥胖型（18.3 ± 8.42）、移植组（9.7 ± 5.45）、BTBR 瘦型（6.8 ± 1.72）。每只动物评估 30 个肾小球，用于肾小球面积和系膜基质扩张的测量。数据以均值 ± 标准差（SD）或均值 ± 标准误（SEM）表示，视情况而定。采用 Shapiro-Wilk 检验评估数据正态性。对于正态分布的数据组间比较，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）结合 Tukey 事后检验。重复测量数据采用双因素方差分析或混合效应模型分析，必要时应用 Geisser-Greenhouse 校正。对于非正态分布数据，采用 Kruskal-Wallis 检验结合 Sidak 多重比较校正。所有统计分析均使用适当的统计软件完成，统计学显著性设定为 p &lt; 0.05（详见 材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明无利益冲突。

本研究表明，在2型糖尿病、糖尿病肾病和肥胖症的临床前模型中，联合移植白色脂肪组织和棕色脂肪组织是一种有效的治疗策略，可控制高血糖、防止体重增加和胰岛细胞肥大，恢复女性亚生育能力，并通过减少细胞凋亡和维持足细胞数量来改善肾功能。
尽管以往的研究已探讨了将白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）移植作为调节葡萄糖稳态和胰岛素敏感性11、改善心脏功能12,13、预防肥胖5,8、恢复生育能力8或改善糖尿病肾病（DKD）14的策略，但大多数研究使用的2型糖尿病（T2DM）、糖尿病肾病（DKD）和肥胖表型较轻的小鼠模型，例如B6.V-Lepob/J（C57BL/6J Lepob/Lepob）或C57Bl/6品系，与...

糖尿病肾病（DKD）、2型糖尿病（T2DM）和肥胖症是相互关联的多因素疾病，构成了日益严重的全球性健康挑战。糖尿病肾病定义为在无其他可识别肾脏损害原因的情况下，糖尿病（DM）与慢性肾脏病同时存在，影响约20%-40%的糖尿病患者1,2。2型糖尿病是一种以慢性高血糖以及葡萄糖、脂质和胰岛素稳态紊乱为特征的全身性代谢障碍，目前影响全球超过5亿人，是全球十大主要死亡原因之一3。肥胖症由长期能量摄入与消耗失衡所致，目前全球每八人中就有一人受累，是导致发病和死亡的重要因素4。这三种疾病密切相关：肥胖显著增加患2型糖尿病的风险，而后者又显著提高发生糖尿病肾病的风险1,4。肥胖症、2型糖尿病和糖尿病肾病在全球范围内日益流行，凸显了深入理解其病理生理机制并开发有效治疗策略的紧迫性。
棕色脂肪组织移植已成为对抗肥胖症和2型糖尿病的一种有前景的治疗策略。该干预措施与体重减轻、胰岛素抵抗和肝脂肪变性的改善，以及循环脂联素水平升高、β3-肾上腺素能受体表达增加和脂肪酸氧化相关基因的上调密切相关。5需要注意的是，哺乳动物的脂肪组织可根据颜色分为三种主要类型：白色、棕色和米色6出生后不久，白色脂肪组织（WAT）即开始扩张，并广泛分布于全身。其作为关键的内分泌器官，通过摄取循环中的葡萄糖和游离脂肪酸，以甘油三酯的形式储存多余能量。6相比之下，棕色脂肪组织（BAT）通过将能量以热能形式耗散，在体温调节中发挥关键作用 通过 非颤抖性产热而非将其储存为ATP6BAT 的活性随年龄增长、肥胖和糖尿病而降低。在成人中，BAT 占全身脂肪组织的比例较小，主要位于人体的锁骨上区和颈部区域，而在小鼠中则主要分布于肩胛间区。6富含线粒体的棕色脂肪组织（BAT）消耗大量葡萄糖和脂肪酸，并与抵抗体重增加相关。7越来越多的证据支持棕色脂肪组织（BAT）在促进更纤瘦且更具代谢优势的表型方面的作用，由此引发了人们对其通过移植进行治疗应用的日益关注。
瘦素（Leptin）是一种主要由白色脂肪组织（WAT）分泌的激素，在调节能量平衡、代谢和生育力中起核心作用8。它作用于中枢神经系统，刺激下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）的分泌，进而促进垂体前叶释放黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）9。瘦素还可直接作用于卵巢的膜细胞和颗粒细胞，支持卵泡发育9。
BTBRob/ob （BTBR 肥胖型）小鼠模型，基因型为 BTBR.Cg-Lep ob/WiscJ（黑灰毛色、肥胖、簇状毛发；参见材料表），在瘦素基因（Lep）上具有纯合的自发功能丧失突变，表现出多种代谢和生殖异常，包括高血糖、葡萄糖耐受不良、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、伤口愈合受损、代谢低下、低体温以及由于低促性腺激素性性腺功能减退导致的生育力下降。雄性小鼠通常在6周龄时即发展为2型糖尿病（T2DM），而雌性小鼠则在8周龄时发展为该病10。高血糖严重且呈进行性发展，至10周龄时空腹血糖水平超过400 mg/dL。此外，BTBR 肥胖型雄性小鼠在第8周开始出现随时间推移而加重的白蛋白尿，并进展为组织学上明显的糖尿病肾病（DKD），包括系膜区扩张和足细胞尿。这些特征使BTBR 肥胖型小鼠成为一种可靠的临床前模型，能够高度模拟人类糖尿病肾病（DKD）的病理过程10。
鉴于瘦素缺乏所导致的严重代谢后果，已有多种策略被用于逆转ob/ob表型，包括瘦素替代疗法和脂肪组织移植。尽管大多数研究使用的是C57BL/6背景的ob/ob小鼠，但针对代谢功能障碍更为严重的BTBR品系开展的此类干预研究仍相对较少。在C57BL/6背景的ob/ob小鼠中，白色脂肪组织（WAT）移植已被证明可使胰岛素水平恢复正常，改善胰岛素敏感性，并恢复生育能力8。此外，在瘦型C57BL/6小鼠中进行棕色脂肪组织（BAT）移植已被证实可防止体重增加，改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，同时减轻胰岛素抵抗，尤其是在高脂饮食诱导的肥胖背景下11。另有研究表明，BAT移植还可改善心脏血流动力学和整体代谢健康状况12。尽管结果令人鼓舞，但这些研究仍存在若干重要局限性。大多数研究均在C57BL/6背景的ob/ob小鼠中进行，而该品系的代谢表型相较于BTBR ob/ob小鼠较轻。因此，这些发现向具有更显著胰岛素抵抗、高血糖、肥胖及肾病等特征的模型的推广性受到限制。此外，瘦素替代治疗及脂肪组织移植在BTBR背景下的效应尚未得到充分研究，这构成了当前文献中的一个关键空白。许多此类干预措施还仅在瘦型动物中或短期实验中进行评估，可能无法充分反映人类代谢性疾病的复杂性和慢性特征。尽管已有研究报道了胰岛素敏感性、葡萄糖耐量及生育能力的改善，但其潜在机制仍不清楚，且这些发现向临床应用的转化价值仍不确定。值得注意的是，在BTBR ob/ob小鼠中联合进行白色与棕色脂肪组织移植的代谢效应仍基本未被探索。
本研究旨在建立一种在BTBR肥胖小鼠中联合进行白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）移植的标准化方案，并评估其对生育力恢复、肾功能及组织学变化的影响。次要目标是促进BTBR肥胖小鼠品系的扩繁，同时减少动物房中杂合子型（BTBR ob/+）&#160;和野生型（BTBR +/+）小鼠的损耗。

<table><tbody><tr><td>0.5% 醇类氯己定二葡糖酸盐溶液</td><td>Rioqu&amp;iacute;mica</td><td>SKU 1068253</td><td></td></tr><tr><td>16 号针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>SKU 305198</td><td></td></tr><tr><td>2.0% 非醇类氯己定二葡糖酸盐溶液</td><td>Rioqu&amp;iacute;mica</td><td>SKU 1113045</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>SKU 309657</td><td></td></tr><tr><td>Accu-Check 试纸条 &amp;ndash; Performa</td><td>Roche</td><td>EAN 4015630981960</td><td></td></tr><tr><td>阿辛蓝 PAS 试剂盒</td><td>EasyPath</td><td>SKU EP-11-20019</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4612</td><td></td></tr><tr><td>CellSens 软件</td><td>Olympus</td><td>CELLSENS</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸盐缓冲液 pH 6.0：一水合柠檬酸 + 氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909 + 28-3010</td><td></td></tr><tr><td>活化型 Caspase-3 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Cobas C 111 分析仪</td><td>Roche</td><td>4528778001</td><td></td></tr><tr><td>肌酐 K</td><td>Labtest</td><td>96-300</td><td></td></tr><tr><td>EnVision FLEX DAB+ 显色剂</td><td>Agilent-Dako</td><td>K3468</td><td></td></tr><tr><td>EnVision FLEX /HRP 检测试剂</td><td>Agilent-Dako</td><td>SM802</td><td></td></tr><tr><td>EnVision FLEX 过氧化物酶阻断试剂</td><td>Agilent-Dako</td><td>SM801</td><td></td></tr><tr><td>EnVision FLEX 底物缓冲液</td><td>Agilent-Dako</td><td>SM803</td><td></td></tr><tr><td>EnVision FLEX 洗涤缓冲液 20x</td><td>Agilent-Dako</td><td>K800721-2</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>Agilent-Dako</td><td>CS701</td><td></td></tr><tr><td>GloMax Discover 微孔板读数仪</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td></td></tr><tr><td>血糖仪 Accu-Check - Performa</td><td>Roche</td><td>EAN 4015630980512</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8 软件（统计学软件）</td><td>GraphPad by Dotmatics</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>100% v/v 异氟烷 (Isoflurane)</td><td>Crist&amp;aacute;lia</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>Agilent-Dako</td><td>CS700</td><td></td></tr><tr><td>IX51 光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>单只小鼠代谢笼</td><td>Tecniplast</td><td>3600M021</td><td></td></tr><tr><td>封片剂 - Entellan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100869</td><td></td></tr><tr><td>小鼠白蛋白 ELISA 试剂盒</td><td>Abcam</td><td>Ab207620</td><td></td></tr><tr><td>小鼠品系：BTBR.Cg-Lepob/WiscJ</td><td>JAX Laboratories</td><td>4824</td><td></td></tr><tr><td>过碘酸雪夫 (PAS) 试剂盒</td><td>EasyPath</td><td>EP-11-20014</td><td></td></tr><tr><td>RM255 切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>14050237960</td><td></td></tr><tr><td>TP1020 组织处理仪</td><td>Leica Biosystems</td><td>TP-1020</td><td></td></tr><tr><td>曲马多 50 mg/mL</td><td>Gr&amp;uuml;nenthal</td><td>4022444</td><td></td></tr><tr><td>WT-1 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-192</td><td></td></tr></tbody></table>

白色与棕色脂肪移植：纠正黑褐色布拉基尿（btbr）肥胖小鼠生殖、代谢及肾脏功能缺陷的一种方法

White and Brown Adipose Grafts: An Approach to Correct Reproductive, Metabolic, and Renal Deficits in Black and Tan Brachyury (BTBR) Obese Mice

白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）移植已成为一种有前景的治疗策略，可用于逆转代谢紊乱，而无需持续给予外源性药物。WAT 作为参与能量稳态的关键内分泌器官，而 BAT 则是体温调节所必需的产热组织。黑褐色短尾（BTBR）肥胖&#160;小鼠模型很好地模拟了肥胖、2 型糖尿病（T2DM）和糖尿病肾病（DKD）的关键特征，包括高血糖、胰岛素抵抗、代谢低下以及生育力下降。
根据下述方案，将来自BTBR野生型和杂合子供体的白色脂肪组织（WAT）与棕色脂肪组织（BAT）联合移植至BTBR肥胖&#160;受体后，成功逆转了亚生育力，减轻了体重增加，使血糖调控恢复正常，并改善了肾脏相关指标。值得注意的是，肾组织肥大和细胞凋亡减少，足细胞数量得以保留。这些结果表明，联合移植WAT和BAT可能成为治疗2型糖尿病（T2DM）的一种替代性治疗策略，同时对糖尿病肾病（DKD）和肥胖具有协同改善作用。此外，该方法可能有助于增加动物房种群中可存活的BTBR肥胖小鼠数量。进一步探究其潜在机制将有助于推动该干预手段的临床转化。

移植脂肪的量与方案有效性 
在完成方案标准化后，评估了两种脂肪移植体积（占供体体重的5-9.9%和10-15%）的有效性，有效性定义为至少实现一次成功妊娠并产下可存活后代。5-9.9%组的成功率为23.8%，而10-15%组的成功率达到52.2%，相当于方案有效性提高了2.2倍(图2A)。关于组织组成，图2B显示，随着移植脂肪中棕色脂肪组织（BAT）含量的增加，有效性呈比例上升，当BAT占总注射脂肪的25%时，有效性达到100%。
<img alt="比较手术效果和脂肪百分比的柱状图，显示不同结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68759/68759fig2.jpg" data-altupdatedat="17833968...

本文介绍了一种白色和棕色脂肪组织移植方案，该方案为逆转糖尿病和肥胖型BTBR小鼠的生育力低下、肥胖和高血糖，并改善其肾功能提供了有前景的策略。

白色与棕色脂肪移植：纠正黑褐色布拉基尿（BTBR）肥胖小鼠生殖、代谢及肾脏功能缺陷的一种方法

白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）移植已成为逆转代谢紊乱的一种有前景的治疗策略……

本研究探讨了在瘦素缺乏的BTBR肥胖小鼠中联合移植白色脂肪和棕色脂肪是否能够逆转亚生育力、肥胖、高血糖和肾功能障碍，从而改善生殖、代谢和肾脏功能结局。我们标准化了联合移植白色脂肪组织和棕色脂肪组织的实验方案，确定了用于改善BTBR肥胖模型中代谢和生殖功能障碍的最佳动物年龄和脂肪移植量。与瘦素治疗或单一脂肪移植相比，我们的方案通过一种可重复且可扩展的方法，实现了生理性的、持续的激素释放，在代谢、生育力和肾功能方面带来更广泛的改善。通过标准化该方案，我们能够更广泛地利用BTBR小鼠模型研究心肾代谢性疾病及糖尿病并发症，同时符合动物实验的“3R”原则。我们的目标是系统性地优化并重复该方案，提高移植效率，整合新型生物医学平台，并探索其他脂肪移植位点，以优化BTBR肥胖小鼠的治疗效果。首先，将已处死的小鼠置于仰卧位，腹部朝上。使用0.5%酒精氯己定二葡萄糖酸盐对下腹部进行消毒。使用手术剪在腹中线处做一个长约2至3厘米的切口，以暴露并采集腹股沟白色脂肪组织。将切除的组织放入一个3毫升的试管中，并置于冰上保存。接下来，将小鼠重新置于腹侧卧位，使其腹部朝下。使用手术剪在肩胛骨之间沿背侧正中线做一个1至2厘米的切口，以暴露并切除肩胛间棕色脂肪组织。使用装有16号针头的3毫升注射器，分别匀浆白色和棕色脂肪组织。然后使用分析天平测量脂肪的最终重量，并将样品置于冰上直至移植。接下来，取麻醉后的受体BTBR肥胖小鼠。当小鼠呼吸减慢至每三秒或更长时间呼吸一次时，将其置于腹卧位。然后使用2%非酒精性氯己定双葡萄糖酸盐消毒背部区域。使用16号针头，在背部表面的6至26个位置，每个位点注射100至200 µL匀浆后的脂肪组织。使用镊子轻柔辅助将脂肪在每个部位均匀分布。移植后，对每个注射部位涂抹0.5%氯己定溶液。肌肉注射曲马多以镇痛，并将每只动物单独饲养，防止恢复期间发生损伤。次日，用 0.5% 氯己定溶液清洁每个注射部位，并给予第二剂肌肉注射曲马多以持续镇痛。移植后两周，将雌性 BTBR 肥胖小鼠与雄性 BTBR 杂合子小鼠同笼以进行交配。每周使用分析天平测量小鼠的体重。使用血糖仪评估空腹血糖水平。采用含10%至15%供体脂肪的移植方案，其获得可存活后代的有效率比含5%至9.9%脂肪的组别高出2.2倍。随着注射脂肪中棕色脂肪组织比例的增加，该方案的有效性逐步提高，当棕色脂肪组织占总脂肪的25%至30%时，有效性达到100%。移植BTBR肥胖雌鼠与杂合子雄鼠交配后，产生的肥胖后代数量是仅由杂合子小鼠交配的1.6倍。与肥胖对照组相比，移植小鼠的卵巢显示出卵泡发生功能的恢复，表现为白体数量增加以及卵泡群体分布趋于平衡。定量分析证实，肥胖小鼠中前窦状卵泡和窦状卵泡数量更高，而移植组则呈现部分正常化。切割的caspase-3染色显示，与肥胖对照组相比，移植小鼠的卵巢细胞凋亡减少，水平接近瘦型对照组，提示移植具有保护作用。从第10周到第24周，移植小鼠的体重持续低于肥胖对照组，在相同期间其体重增加百分比显著降低。在第8周至第20周之间，移植小鼠的空腹血糖水平显著低于肥胖对照组。

white-brown-adipose-grafts-an-approach-to-correct-reproductive

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科研

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生物学

白色和棕色脂肪移植物：纠正黑色和棕褐色短小鼠 （BTBR） 肥胖小鼠生殖、代谢和肾缺陷的方法

在本视频中，我们演示了从新生小鼠分离皮下白色脂肪组织和肩胛间棕色脂肪组织的手术操作过程。...

小鼠幼崽白色与棕色脂肪组织库的采集：一种获取小鼠幼崽白色脂肪组织和棕色脂肪组织的手术操作

从小鼠白色脂肪组织中分离得到的原代白色前脂肪细胞可分化为米色/褐色样细胞。本文介绍了一种可靠的细胞模型系统，用于研究白色脂肪“褐变”的分子调控机制。...

基质血管细胞的分离与向米色/褐色样细胞的分化

本文介绍了一种移植方法，可将供体大鼠乳腺上皮细胞移植至受体动物的肩胛间白色脂肪垫中。该方法可用于研究宿主和/或供体对乳腺上皮发育的影响，且无需预先清除内源细胞，从而扩展了该技术的应用范围。...

大鼠乳腺上皮细胞移植至肩胛间白色脂肪垫

本报告描述了一种从新生小鼠中同时分离原代棕色和白色前脂肪细胞的实验方案。分离得到的细胞可在体外培养，并可诱导其分化为完全成熟的白色和棕色脂肪细胞。该方法可用于在培养条件下对原代脂肪细胞进行遗传学、分子水平及功能特性分析。...

从新生小鼠中分离与分化原代白色和棕色前脂肪细胞

利用微型PET/MR成像方法对小鼠产热性脂肪组织库进行功能成像与定量分析。...

使用[18F]FDG微正电子发射断层扫描/磁共振成像对小鼠棕色和米色脂肪组织进行可视化与定量分析

前脂肪细胞从小鼠肩胛间棕色脂肪组织的基质血管组分中分离获得，并分化为能够积累脂滴、表达分子标志物并呈现成熟棕色脂肪细胞线粒体形态的细胞。这些细胞进一步通过免疫荧光和透射电子显微镜进行分析。...

从新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管组分中分化与成像棕色脂肪细胞

本文介绍了一种详细方案，阐述如何利用从啮齿类动物或人类脂肪组织中分离出的微血管片段，作为一种简便的方法来构建具有功能性的血管化米色脂肪组织。...

由微血管片段构建血管化产热脂肪组织的三维培养

本方案介绍了在脂肪细胞中使用CRISPR SunTag-p65-HSF1（AdipoSPH）作为研究米色脂肪生物学的一种替代腺相关病毒（AAV）的策略。 在体 注射携带靶向内源性 Prdm16 基因的 sgRNA 的 AAV...

利用CRISPR SunTag-p65-HSF1激活系统研究米色脂肪生物学与代谢

在本实验方案中，我们描述了利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9和腺相关病毒（AAV）单导向RNA（sgRNA）系统相结合的技术，构建脂肪组织特异性敲除小鼠的方法。所述步骤包括sgRNA的设计、AAV-sgRNA颗粒的制备，以及将AAV显微注射至棕色脂肪组织（BAT）叶中的操作。...

利用Cre-LoxP、CRISPR-Cas9与腺相关病毒单导向RNA系统联合构建棕色脂肪特异性基因敲除小鼠

可诱导的遗传谱系示踪（GIFM）可实现对细胞的精细时空控制下的标记与追踪 体内...

一种用于遗传诱导命运图谱绘制的实用方法：标记与追踪细胞的可视化指南 体内

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