Name: 用于检测尖孢镰刀菌热带种族 4 的组合重组酶聚合酶扩增 CRISPR/Cas12a 检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T13:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 了解利用重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a技术检测尖孢镰刀菌热带种族4的快速方法。该检测方案成本低、速度快，适用于香蕉枯萎病病原体的现场诊断。

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我们感谢南非国家研究基金会（项目编号：138109）在非评级研究人员竞争性支持计划下提供的资助。同时，我们感谢欧盟“地平线2020”研究与创新计划玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里学者基金在INDICANTS项目（项目编号：890856）下提供的资助。

1. 植物材料的简化DNA提取
注意：参见图1以了解概览。
<ol>
	<li>进行DNA提取。
	<ol>
		<li>将每份250 mg的发病假茎组织分别转移至独立的提取袋中（参见材料表）。</li>
		<li>向装有植物材料的提取袋中加入2 mL 0.5 M NaOH-PVP（材料表）。使用研钵等手动研磨器在提取袋中研磨受感染的维管组织。 
		注意：如有需要，可额外添加1–2 mL 0.5 M NaOH-PVP，以获得足够的液体提取物。</li>
		<li>向1.5 mL离心管中加入195 µL 100 mM Tris-HCl（pH 8.0）（材料表）。</li>
		<li>用移液器将5 µL提取液从提取袋转移至含有195 µL 100 mM Tris-HCl（pH 8.0）的1.5 mL离心管中，使提取液稀释40倍。</li>
		<li>涡旋振荡离心管15–30秒，随后于-20 °C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. crRNA 合成与质量控制
<ol fo:break-after="page">
	<li>进行转录。
	<ol>
		<li>使用RNA转录试剂盒（材料表），向一个0.2 mL的PCR管中加入以下组分：1.5 µL 10x T7反应缓冲液、每种dNTP各1.5 µL、1.5 µL T7 DNA聚合酶混合物、1 µL无核酸酶水，以及10 µL浓度为100 µM的T7模板DNA，总体积为20 µL。</li>
		<li>将PCR管置于37 °C水浴或PCR仪中孵育至少4小时。</li>
		<li>使用分光光度计（材料表）测定转录所得RNA的浓度。用无核酸酶水或TE缓冲液（补充文件1）将RNA稀释至250 ng/µL（共10 µg），终体积为40 µL。 
		注：转录后的RNA可保存于-80 °C，待后续进行DNase处理和纯化步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行DNase处理及crRNA纯化。 
	注：所有步骤均在室温下操作。RNA和DNase I酶需保持在冰上。
	<ol>
		<li>根据RNA纯化试剂盒中提供的DNase I说明书对RNA样品进行处理（材料表）22。</li>
		<li>按照试剂盒说明书中的方案II对RNA样品进行纯化22。</li>
		<li>使用Nanodrop检测纯化后的crRNA浓度与质量&#160;，用无核酸酶水将RNA稀释至100 ng/µL，并于-80 °C保存备用。</li>
		<li>将crRNA与RNA上样染料（材料表）混合后，在70 °C水浴中加热10分钟，随后在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，以观察合成的crRNA（图2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 重组酶聚合酶扩增（RPA）-Cas12a 一体化反应管检测 体外 Foc TR4 检测
注意：概述请参见图3。
<ol>
	<li>准备RPA和Cas12a反应体系。 
	注意：确保这些步骤在冰上无DNA污染的环境中进行，所有试剂和材料需预先冷却。实验前用漂白剂和70%乙醇擦拭工作台面和移液器。本研究中使用的所有寡核苷酸信息见表1。
	<ol>
		<li>在另一个0.5 mL离心管（材料表）中配制20 µL Cas12a反应体系，试剂体积如下：2 µL 10x NEBuffer r2.1（50 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，100 µg/mL 重组白蛋白，pH 7.9），0.4 µL 10 µM LbCas12a蛋白，0.6 µL 100 ng/µL crRNA，0.4 µL 10 µM 报告分子，以及16.6 µL 去离子水。 
		注意：LbCas12a蛋白、crRNA和报告分子的终浓度均为200 nM。</li>
		<li>在另一个0.5 mL离心管中配制9.5 µL RPA反应体系，试剂体积如下：5 µL 2x反应缓冲液（终浓度为1x，按制造商说明），1.6 µL dNTP混合液（终浓度1.6 mM），1 µL 10x Basic E-Mix（终浓度1x，按制造商说明），0.5 µL 每种RPA引物（10 µM，终浓度各为0.5 µM），0.5 µL 20x Core反应混合液（终浓度1x，按制造商说明），以及0.4 µL 去离子水。</li>
		<li>将一个8联管条插入冰上的离心管架（材料表）中。</li>
		<li>将20 µL Cas12a反应体系加入8联管条的管底。</li>
		<li>将9.5 µL RPA反应体系加入8联管条的管盖中，并向管盖内的RPA反应体系中加入0.5 µL 280 nM MgOAc（终浓度14 nM），通过上下吹打混匀。</li>
		<li>向无模板对照（NTC）管的管盖中加入0.5 µL 去离子水，并小心盖紧，确保RPA与Cas12a反应体系不混合。 
		注意：设置无模板对照（NTC）以确保结果的可靠性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入模板DNA并启动反应。
	<ol>
		<li>除NTC外，在含有MgOAc的10 µL RPA反应体系（位于8联管条管盖中）加入0.5 µL 模板DNA；NTC管中以去离子水代替DNA。每次实验均应加入一个已知阳性对照Foc TR4 DNA，以确保检测系统正常工作。通过上下吹打混匀。</li>
		<li>小心盖紧8联管条的管盖，防止RPA与Cas12a反应体系混合。</li>
		<li>打开便携式荧光仪（材料表），为RPA-Cas12a检测创建运行程序（补充文件2）。打开已保存的运行程序，将8联管条放入便携式荧光仪中，在37 °C下孵育30分钟。 
		注意：操作8联管条时避免触碰管底，应握住左上和右上外侧边缘。</li>
		<li>30分钟后取出8联管条，翻转6次以混合RPA与Cas12a反应液，然后在小型离心机（见材料表）中离心5秒。</li>
		<li>将8联管条重新放回便携式荧光仪中，使用已保存的运行程序继续在37 °C下孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察结果。
	<ol>
		<li>根据便携式荧光仪测得的平均相对荧光单位（RFUs）进行结果判读（补充文件2及用户手册23）。</li>
		<li>使用蓝光透射仪（补充文件3）在465 nm激发波长的LED蓝光下观察各管荧光，用手机拍摄图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
&#160; &#160;

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务或智力利益。

常规监测是有效预防和控制Foc TR4及其他重要外来有害生物的重要策略。能够在田间应用并快速、准确识别病原体的检测方法，可加快决策进程，并降低监测工作的相关成本。为此，本文介绍的方案结合了简化的DNA提取步骤，直接对采集的植物样品进行处理，随后将提取物用于单管检测体系，整合RPA与Cas12a反应，实现对Foc TR4的快速、高灵敏度检测21。
本文所介绍的RPA-Cas12a联合检测方法最重要的优势之一是其双重特异性。在扩增步骤中，该方法依赖于特异性的RPA引物，随后Cas12a的crRNA对目标序列的识别已被证明具有单核苷酸特异性12。在Cas12a检测方法的初步优化过程中，crRNA的转录最初基于Li等人发表的方案24。由于CRISPR反应效率出现了一些问题，后续改用一种已预先退火T7正向引物和Foc TR4 T7反向引物的合成T7模板进行转录。必须确保该模板经过充分的DNase处理，以彻底去除所有双链DNA，因为该模板含有目标序列，...

由土传真菌病原体Fusarium oxysporum f. sp. cubense（Foc）引起的枯萎病，被全球公认为历史上最具破坏性的跨境植物病害之一1。一旦侵入新地区，Foc 会保持潜伏状态，直到感病植株出现症状，这一过程可能持续数月，从而使真菌在未被察觉的情况下定殖并扩散。由于该病原菌可产生抗逆性强的厚垣孢子，且香蕉种植多为多年生模式，一旦定殖，几乎无法通过经济手段根除。因此，预防和早期检测对于保护易受侵害的种植者至关重要1。目前由Foc热带4号小种（TR4）引发的疫情，需要通过定期监测，在高风险区域识别出出现症状的香蕉植株。非生物胁迫因素（如水分胁迫和某些营养元素缺乏）会导致植株外部黄化，其症状与Foc TR4感染相似。此外，不同Foc小种引起的症状也难以区分。因此，必须通过实验室分离纯化，继而进行表型和分子检测，才能实现对Foc TR4的可靠鉴定2。目前已有多种可用于Foc TR4检测的分子检测方法，包括PCR、定量（q）PCR以及环介导等温扩增（LAMP）技术3,4,5,6,7。然而，大多数这些方法仍需昂贵的设备和专业技能，且必须在实验室环境中进行。重组酶介导的等温扩增（RPA）可在恒温条件下进行，因此无需依赖上述设备，适用于田间现场检测方案8。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas系统已越来越多地被用于改进分子诊断技术9。这些系统因成本低廉、操作简便，且无需使用特殊仪器，因而适用于现场检测。基于CRISPR的诊断方法通常包括对目标序列进行等温扩增，随后通过CRISPR-Cas蛋白识别目标序列，并非特异性地切割DNA或RNA荧光报告分子，从而指示目标的存在10,11。在CRISPR-Cas12a系统中，CRISPR RNA（crRNA）引导Cas12a识别并切割核酸靶标。该crRNA可通过与互补序列杂交，设计用于靶向特定的DNA或RNA区域。一旦结合，Cas12a将以单核苷酸特异性切割目标序列，并随之非特异性地切割报告分子12。最近，CRISPR-Cas12a系统已被用于检测多种具有重要经济意义的植物致病真菌13,14,15,16,17,18,19,20。
本方案描述了一种单管检测技术的开发，该技术结合了简化的DNA提取、重组酶聚合酶扩增（RPA）以及CRISPR/Cas12a技术（RPA-Cas12a），用于检测香蕉枯萎病菌热带4号生理小种（Foc TR4），检测结果既可在便携式荧光仪上读取，也可在廉价的发光二极管（LED）蓝光透射仪下肉眼观察21。该方法可进一步优化，用于田间现场检测，以提升防控策略的有效性。类似的方法也可用于设计基于Cas12a的其他植物病原体检测方法。

<table><tbody><tr><td>EnGen Lba Cas12a (Cfp1) 蛋白</td><td>New England Biolabs</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>EnGen Lba Cas12a 稀释液</td><td>New England Biolabs</td><td>B0653A</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR 管</td><td>Merck</td><td>EP0030124332</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 微量离心管</td><td>Merck</td><td>EP0030121708</td><td></td></tr><tr><td>通用提取袋</td><td>BIOREBA</td><td>430100</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA 标准分子量标记</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>SM0241 / SM0242</td><td></td></tr><tr><td>Genie Centrifuge Mini-6KO 离心机</td><td>OptiGene</td><td>OP-FUGE</td><td></td></tr><tr><td>Genie III</td><td>OptiGene</td><td>https://www.optigene.co.uk/instruments/genie-iii/&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Genie 条带支架</td><td>OptiGene</td><td>GBLOCK-01 / GBLOCK-02 / GBLOCK-03</td><td></td></tr><tr><td>Genie 条带</td><td>OptiGene</td><td>OP-0008-50 / OP-0008-500</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 高产率 RNA 合成试剂盒</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 紫外/可见光分光光度计</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>https://caeonline.com/buy/spectrometers/nanodrop-nd-1000/293669253</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3</td><td>New England Biolabs</td><td>B7003S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer r2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B6002S</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9003-39-8</td><td></td></tr><tr><td>RNA 纯化与浓缩-5 试剂盒</td><td>Zymo Research</td><td>R1013</td><td></td></tr><tr><td>RNA 上样染料</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>R0641</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlue 蓝光透射仪</td><td>Accuris Instruments</td><td>E4000-E</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠 (NaOH) 颗粒</td><td>Merck, EMPARTA</td><td>K277</td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷 (Tris)</td><td>Merck</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp 液体基础试剂盒</td><td>TwistDx</td><td>TALQBAS01</td><td></td></tr></tbody></table>

联合重组酶聚合酶扩增与crispr/cas12a检测法用于检测 fusarium oxysporum 专化型 cubense 热带4号小种

Combined Recombinase Polymerase Amplification CRISPR/Cas12a Assay for Detecting Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

定期且准确的监测是有效管理植物病害的核心。监测结果可指示采取何种措施最为合适，并判断是否需要进行预防、根除或无需采取行动。仅基于寄主植物症状学的监测方法往往不可靠，因为生物和非生物胁迫引起的症状具有相似性。基于实验室的分子检测方法，如聚合酶链式反应（PCR）和定量（q）PCR，是目前最常用且可靠的植物病原检测手段，但其依赖昂贵的设备和熟练的操作人员。本文介绍一种结合简化DNA提取、重组酶聚合酶扩增（RPA）以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas12a（RPA-Cas12a）的技术方案，用于检测入侵性病原菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense 热带4号小种（Foc TR4）。该技术提供了一种简便的单管检测替代方案，分析稳健性强，相较于现有的分子检测方法具有更高的特异性，且无需使用昂贵和复杂的实验室设备。

使用简化的DNA提取方法，结合RPA-Cas12a检测体系，在Genie III便携式荧光仪中成功检测到感病植物材料中的Foc TR4，结果如图4A所示。阳性样本显示可见荧光（第6-8泳道），而阴性样本终点荧光信号较低（第1-5泳道）。当在LED蓝光下观察样本管时，感染Foc TR4的样本也表现出可见荧光（图4B）。相比之下，未感染Foc TR4的植物组织DNA未产生可见荧光。
<img alt="香蕉假茎DNA提取过程示意图；包括BIORBEBA袋、NaOH+PVP、涡旋振荡。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68841/68841fig1.jpg" data-altupdatedat="1778558422000" data-alt="图1"> 
图1<stron...

本方案介绍了一种结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测技术的方法，用于检测侵入性植物病原菌Fusarium oxysporum f. sp. cubense 热带4号小种。

联合重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a检测法用于检测 Fusarium oxysporum 专化型 cubense 热带4号小种

定期且准确的监测是植物病害高效管理的核心。它能够指明采取何种措施最为有效……

我们致力于香蕉枯萎病病原体（即 Foc TR4）的快速准确检测。结合使用重组酶聚合酶扩增技术与 CRISPR 技术，可避免使用昂贵仪器，并提高现有检测方法的准确性。首先，将每段具有症状的假茎各取 250 毫克，分别转移至独立的提取袋中。向每个含有植物材料的提取袋中加入 2 毫升 0.5 摩尔的氢氧化钠聚乙烯吡咯烷酮溶液。使用手动研磨器（如研杵）在提取袋内将受感染的维管组织充分研磨。然后，向一个 1.5 毫升离心管中加入 195 微升 pH 为 8 的 100 毫摩尔 Tris-HCl 缓冲液。从提取袋中吸取5微升植物提取物，加入含有Tris-HCl缓冲液的1.5毫升离心管中，使提取物稀释40倍。涡旋振荡管子15至30秒，随后将管子置于-20摄氏度保存，以备后续使用。使用RNA转录试剂盒，将指定组分加入0.2毫升PCR管中。将制备好的离心管置于37摄氏度的水浴或PCR仪中孵育至少4小时。随后，使用分光光度计对转录的RNA进行定量。用无核酸酶的水将RNA稀释至终体积为40微升、浓度为250纳克/微升。然后，按照RNA纯化试剂盒制造商的说明，使用试剂盒中提供的DNase I处理RNA样品。接着，使用RNA纯化试剂盒纯化RNA样品。使用NanoDrop仪器测定纯化后CRISPR RNA的浓度和质量。然后，用无核酸酶水将RNA稀释至每微升100纳克。现在，将CRISPR RNA与RNA上样染料混合后置于水浴中，在70摄氏度加热10分钟，并将样品在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，以观察CRISPR RNA。使用指定组分，在另一个0.5毫升离心管中配制20微升Cas12a反应混合液。接下来，在另一个0.5毫升离心管中配制9.5微升的RPA反应混合液，其组分如上所示。将八联排管放入置于冰上的离心管架中，然后将20微升Cas12a反应混合液加入排管中每根管的底部。随后，将9.5微升RPA反应混合液加入排管中每根管的管盖内。向管盖中的RPA反应体系加入0.5 µL的280 nmol/L醋酸镁溶液，并通过移液器吹打混匀。接着，在阴性对照管的管盖中加入0.5 µL去离子水，并小心闭合管盖，防止RPA与Cas12a反应体系相互混合。随后，将0.5 µL模板DNA加入含有醋酸镁的10 µL RPA反应体系管盖中。用移液器反复吹打混匀管内溶液。小心关闭所有管条盖子，确保RPA和Cas12a反应体系不发生混合。随后，打开便携式荧光仪，为RPA-Cas12a检测创建运行程序。打开已保存的运行程序，将试管条放入荧光仪中，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。30 分钟后，从荧光仪中取出试管条，倒置试管六次以混匀 RPA 和 Cas12a 反应体系，然后在小型离心机中短暂离心 5 秒。随后，将试管条重新放回荧光仪中，使用已保存的运行程序在 37 摄氏度下继续孵育 30 分钟。解读便携式荧光仪上测得的平均相对荧光单位。最后，使用蓝光透射仪在465纳米激发波长的LED蓝光下观察反应管，并用手机摄像头拍摄荧光信号图像。在RPA Cas12a检测到香蕉枯萎病菌热带第4型（Foc TR4）DNA后，阳性样本在Genie III便携式荧光仪中产生可见荧光，而阴性样本则呈现较低的终点荧光信号。在LED蓝光下观察时，含有来自感染Foc TR4植物材料DNA的样本管显示出明显的荧光，而含有未感染组织DNA的样本管则无任何荧光。我们已开发出首个利用CRISPR技术检测Foc TR4的检测方法。该方法经优化后，可在成本较低的仪器上实现比现有商业检测试剂盒更快、更准确的检测。我们的后续工作将探索一种与该检测方法联用的、可连接智能手机的荧光检测仪。

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环境

用于检测尖孢镰刀菌热带种族 4 的组合重组酶聚合酶扩增 CRISPR/Cas12a 检测

利用DNA组装技术，可在一次克隆反应中并行构建多个CRISPR载体，从而使大量CRISPR载体的构建变得简单。番茄毛状根是验证CRISPR载体和创制突变体材料的优良模型系统。...

高通量CRISPR载体构建及通过番茄毛状根生成对DNA修饰的表征

我们描述了一种可靠的基因替换策略，用于对黑粉菌 Ustilago maydis...

植物病原真菌 Ustilago maydis 的遗传操作以研究真菌生物学及植物-微生物相互作用

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C.

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本实验方案的目的是利用组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 共CRISPR标记进行筛选，实现对 C. elegans 基因组的无缝CRISPR/Cas9编辑。该方案可用于在 C. elegans...

使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

本研究建立了一种基于重组酶聚合酶扩增联合CRISPR-Cas12a的快速、灵敏且便携的Candidatus Liberibacter...

可现场部署的结合重组酶聚合酶扩增与CRISPR-Cas12a技术的Candidatus Liberibacter asiaticus检测方法

基于CRISPR-Cas系统与抗CRISPR蛋白的基因数字电路

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基于RPA-CRISPR/Cas12a-SPM与深度学习的DNA病毒检测系统

本文介绍了基于重组酶的等温扩增反应和基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）反应的预混、冻干试剂的逐步制备方法，可用于检测传染病病原体的核酸生物标志物或其他感兴趣的遗传标志物。...

基于CRISPR的现场快速诊断技术及其预混冻干试剂

为了实现对Acinetobacter baumannii的快速且精准检测，我们提出了一种结合重组酶聚合酶扩增技术（RPA）与LbaCas12a内切酶的检测方案，用于鉴定A.

基于重组酶聚合酶扩增/Cas12a系统的Acinetobacter baumannii感染快速特异性检测

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现场检测锥虫科寄生虫和Nosema ceranae的DNA：基于碱裂解联合RPA/CRISPR/Cas12a系统的方法

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