Name: 全层骨软骨缺损绵羊模型的建立与评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: 了解如何在绵羊股骨髁建立全层骨软骨缺损模型，用于再生医学与软骨修复研究。该手术方案结合组织学评估与步态分析，为关节功能恢复治疗提供可靠的临床前动物模型。

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本工作由Araucaria基金会（资助编号：PDT2020221000005）提供支持。我们感谢卡洛斯·查加斯研究所和健康工具技术发展计划—RPT-FIOCRUZ的所有工作人员，感谢他们提供FIOCRUZ/PR、细胞技术核心实验室以及巴拉那天主教大学实验农场的显微镜设施。&#160;作者感谢卡洛斯·查加斯研究所—Fiocruz巴拉那研究激励计划提供的经费支持。我们还感谢卡洛斯·查加斯研究所传播办公室的Wagner Nagib在视听制作方面的贡献。

本研究获得了研究伦理委员会的批准，并获得了编号为6092250823/2023的伦理审查合格证书。在本研究中，选取了九只12月龄的白萨福克雌性绵羊。在每只动物的两个股骨内侧髁上均制造了缺损。空缺损作为对照。每只动物的一侧膝关节随机分配接受GelMA治疗，另一侧作为对照。该策略使我们能够评估天然再生能力，并减少个体差异（如遗传因素和骨骼成熟度）的影响。动物被随访6个月以评估透明软骨的形成情况。
1. 麻醉程序
<ol>
	<li>在手术前约 24 小时，使动物禁食禁水。</li>
	<li>术前通过肌肉注射给予动物哌替啶 4 mg/kg 与咪达唑仑 0.3 mg/kg 进行预处理。</li>
	<li>使用前一天，在无人的房间内佩戴防护手套填充麻醉蒸发器，以尽量减少职业暴露风险。</li>
	<li>每次操作前检查麻醉回路是否漏气，并在通风良好的区域进行所有操作，遵循机构的生物安全指南。</li>
	<li>15 分钟后，使用 18 G 导管对动物进行插管，并以 10 mL∙kg-1∙h-1 的速率输注乳酸林格氏液。</li>
	<li>采用 1% 丙泊酚静脉麻醉，剂量为 4 mg/kg。</li>
	<li>使用 7.5–8.0 mm 带套囊的气管导管对动物进行气管插管，并通过半闭合循环呼吸系统维持自主呼吸，氧气输送浓度（FiO₂）为 1.0，流速为 50 mL/kg。</li>
	<li>采用部分静脉麻醉（PIVA）技术，以 0.1 mg∙kg-1&#160;min-1 的速率持续输注丙泊酚，并仅通过调节异氟烷浓度来达到合适的外科麻醉水平。在整个手术过程中监测麻醉深度。</li>
	<li>在神经定位仪引导下，对股神经和坐骨神经实施神经周围阻滞，每次阻滞给予 2% 利多卡因 0.2 mL/kg。 
	注意：只有在确认动物已达到外科麻醉状态（对用力捏蹄无反应且无下颌张力）后，方可开始手术。</li>
</ol>
2. 手术操作 体内
<ol>
	<li>使用外用消毒剂葡萄糖酸氯己定对剃毛后的膝关节进行消毒，并将动物置于手术室内的仰卧位。</li>
	<li>通过触诊动物膝关节确定关节腔位置，以明确切口的精确部位。做一双弧形皮肤切口（起始于股骨外侧髁远端，止于胫骨结节水平内侧）。</li>
	<li>辨认髌腱、髌骨、髌韧带及关节囊内侧部分。切开关节囊以暴露股骨内侧髁。将膝关节过度屈曲，以观察髁部关节软骨最远端区域。</li>
	<li>在动物髁部区域做一长约3–5 cm的手术切口。去除皮肤下方的组织层以暴露髁部，并保持切口区域清洁，防止污染。</li>
	<li>使用注射器和针头采集滑膜液。将部分样本转移至含EDTA的试管中用于分析，其余材料用于制备涂片。</li>
	<li>放置牵开器以充分暴露髁面。髁部暴露越充分，下一步诱导损伤时操作越容易。 
	注意：此时应注意动物的足部。膝关节的屈曲或伸展有助于更好地暴露髁部。</li>
	<li>使用配备8 mm环钻钻头的骨科钻头，在股骨内侧髁中心钻取一个直径8 mm、深度5 mm的缺损，确保对位准确，避免产生非预期的尺寸或形状，并保持相对于关节软骨最远端区域呈0°角。 
	注意：环钻操作应在尽可能低的速度下进行，轻柔控制钻头，仅使用足以切割软骨和软骨下骨的旋转力，同时使用室温下的0.9% NaCl进行局部冷却，即使在低速操作时也应如此。</li>
	<li>使用骨科锤和骨凿进行手术取出骨软骨柱。</li>
	<li>用无菌纱布清洁创口范围，确保病损内部无血液和组织碎片。</li>
	<li>将200 µL含0.25% (w/v) 联苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂（LAP）作为光引发剂的20% (w/v) GelMA液态配方滴加至损伤内部，直至填满至表面。</li>
	<li>在距离样本约5 cm处，使用波长为395–405 nm的LED光源（总功率9 W）照射180 s，对GelMA水凝胶进行光交联。在此条件下，表面估计辐照度约为10 mW/cm²，总曝光能量约为1.8 J/cm²。 
	注意：使用紫外光时应佩戴护目镜。</li>
	<li>小心移除牵开器。</li>
	<li>在不同组织层使用独立缝线关闭创口，以防止血清肿形成。所需缝线数量取决于手术切口的范围。</li>
	<li>在缝合处覆盖无菌敷料，以预防感染。</li>
</ol>
3. 术后护理
<ol>
	<li>在麻醉恢复期间监测动物的生命体征，包括心率（70-90 次/分钟）、呼吸频率（12-20 次/分钟）、体温（39 °C 至 40.5 °C），以及毛细血管再充盈时间正常（1-2 秒）且黏膜颜色正常。定期触诊面动脉和股动脉，检查脉搏是否清晰可触及。 
	注：麻醉恢复应在安静、清洁、温暖且铺有软垫的环境中进行，保持最低限度的光照和低噪音水平。</li>
	<li>术后每天一次对手术部位进行局部青霉素换药处理（长效青霉素G：1,250,000 IU；普鲁卡因青霉素G：1,250,000 IU；硫酸双氢链霉素：1.25 g；尿素：2.50 g），持续10天。</li>
	<li>确保动物在麻醉苏醒后立即恢复四足站立姿势，能够将体重施加于手术肢体，并且无任何不适表现。</li>
	<li>术后镇痛方案包括美洛昔康（0.4 mg/kg，每24小时一次）和曲马多（2 mg/kg，每12小时一次），持续使用5天。当通过绵羊面部疼痛量表（Sheep Grimace Scale）41 观察到与疼痛相关的面部表情时，应追加一次曲马多作为补救剂量；该量表是一种经过验证的评估工具，基于特定的面部动作单元（包括眼眶收缩、翻唇行为、耳部位置和头部位置）来评估绵羊术后的疼痛与痛苦程度。</li>
</ol>
4. 组织学分析
<ol>
	<li>手术后六个月实施安乐死。在给予安乐死药物前，为达到深度镇静，需通过静脉途径预先给予动物氯胺酮（10 mg/kg）和赛拉嗪（1 mg/kg），所用剂量高于临床常规推荐剂量，以确保迅速进入深度镇静状态，此做法符合公认的安乐死操作规范。随后给予丙泊酚以诱导麻醉性昏迷。接着以 2 mEq/kg 的剂量静脉注射氯化钾，直至呼吸和循环停止，且所有保护性反射消失。</li>
	<li>切取股骨远端骨骺，去除髁部区域。将分离的膝关节组织置于10%中性缓冲福尔马林中固定，并在34 °C条件下用5% EDTA（乙二胺四乙酸）进行脱钙处理，每3天更换一次EDTA溶液。</li>
	<li>将组织包埋于石蜡中，并切成4 µm厚的切片。将载玻片浸入65 °C的二甲苯中，每次5分钟，重复3次，以去除石蜡。随后依次在乙醇（99%、95%、70%）中浸洗10–20次，再用去离子水水化5分钟42。</li>
	<li>进行苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色时，使用哈里斯苏木精对切片染色，并用伊红复染，然后采用自动载玻片扫描显微镜以20×放大倍数进行扫描，并使用配套软件进行分析。</li>
	<li>根据国际骨关节炎研究学会（OARSI）组织病理学评估标准43对病变进行评分：评分为0表示软骨正常；评分为1表示存在表层纤维化但无软骨丢失；评分为2表示垂直裂隙已延伸至表层下方的区域，并伴有表层板的部分缺失；评分为3表示垂直裂隙或糜烂已延伸至钙化软骨层，且累及关节面面积小于25%；评分4、5和6分别表示垂直裂隙或糜烂已达到钙化软骨层，并分别累及关节面面积的25–50%、50–75%以及超过75%。 
	注：本研究中，凡垂直裂隙或糜烂延伸至钙化软骨层且累及关节面面积超过25%的病变，均评为4分。</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

为了克服软骨治疗中的挑战，例如软骨细胞分化不足和细胞外基质（ECM）成熟不充分，非临床研究对于评估治疗策略仍然至关重要。既往已有研究报道了采用多种技术建立损伤软骨组织的非临床模型的方法45。然而，目前文献中仍缺乏关于在大型动物膝关节中诱导急性骨软骨损伤的详细报告和标准化操作流程，导致不同研究之间存在较大差异。本文所述方案提供了一种可重复且可靠的方法，用于在大型动物的骨软骨组织中诱导局灶性损伤。
根据巴西卫生监管局（ANVISA）关于先进治疗药物产品（N° 506/2021）的规定，为将创新疗法引入临床实践，非临床研究至关重要。这些研究必须依照GMP标准进行，并有助于评估安全性、生物分布、药代动力学、药效学以及对转化研究至关重要的其他参数45。对于旨在开发治疗受损关节软骨工具的非临床研究而言，动物模型的选择是关键因素之一43。动物体型对应关节大小和软骨厚度，这两个因素对于判断其在人类疾病建模中的适用性至关重要<sup class="xref"...

软骨通过在双轴关节中提供骨与骨之间的无摩擦表面，防止关节面磨损，对维持骨骼系统的力学功能至关重要1。软骨实现这些高要求力学功能的能力，在很大程度上依赖于其细胞外基质独特的组成和结构，尤其是其极高的含水量。水在关节软骨的结构与功能中起着关键作用，约占其总组成的70–80%。水是软骨在受压时承担负荷的主要成分。该组织抵抗压缩力的能力，取决于水在基质中的结构化程度及其运动受限情况。这种结构的形成依赖于水与软骨主要大分子（如胶原和蛋白聚糖，尤其是与透明质酸结合的聚集体）之间的相互作用1。这些大分子起到限制性结构的作用，有序地约束水的运动。这种相互作用不仅赋予组织刚度，还提供弹性和变形后恢复的能力。自由水、结合水与大分子基质之间的相互作用构成了软骨生物力学行为的核心2。
尽管关节软骨（AC）具有卓越的承受和分散传递至关节的物理与机械负荷的能力，但一旦受损，由于软骨细胞有丝分裂活性低且组织血管化程度差，其自我修复能力十分有限2。关节损伤通常伴随着细胞外基质（ECM）分子和蛋白质的进行性丢失，这些成分占组织总量的95%，并赋予关节软骨生物力学特性3。当ECM组分的合成与降解之间出现失衡，并向分解代谢过程偏移时，可能导致骨关节炎（OA），这是全球最常见的退行性关节疾病。骨关节炎影响约10-12%的成年人群，引起疼痛、限制活动能力，并显著降低患者的生活自主性4。由于一生中对关节的累积性损伤，骨关节炎在老年人群中更为普遍；然而，多种风险因素也与该疾病的临床发生相关，如性别、遗传易感性、肥胖以及日常习惯等4。迄今为止，骨关节炎的治疗手段主要局限于临床症状管理，以及在最严重情况下进行全关节置换5。&#160;由于尚缺乏强效、可重复且可靠的治疗策略来有效干预骨关节炎，目前正积极探索新的方法，以深入理解并应对关节软骨损伤相关的问题。
为了修复、再生并改善关节炎关节的活动功能，再生医学的进步为恢复受损软骨（AC）带来了新的希望6,7自体软骨细胞联合细胞外基质植入及干细胞关节内注射代表了该领域目前的先进水平8,9,10主要挑战在于确保植入细胞能够实现适当的分化并合成功能性细胞外基质（ECM）。自体软骨细胞倾向于形成纤维软骨或进展为肥大状态，产生无法重现关节软骨（AC）生理特征的异常组织，导致修复不完全且常出现晚期退变11生物材料可用于引导组织再生过程中的细胞行为，为细胞提供临时支架，使其附着并合成新的、天然的、具有功能的细胞外基质12,13,14理想的软骨组织工程生物材料必须确保与周围组织（尤其是软骨下骨）形成牢固的结合，因为该界面的失效会损害长期修复效果。然而，骨软骨支架中软骨层与骨层之间的结合力较弱，以及与宿主组织的整合效果不佳，仍是当前面临的主要挑战。15尽管支架材料致力于模拟天然的骨软骨结构，但要复制其复杂的界面微结构仍然具有挑战性。这凸显了研发具有生物学特性的支架的重要性，这类支架需能够同时支持软骨与骨组织再生，并维持界面的稳定性。16明胶源自胶原蛋白——软骨组织的关键成分——具有细胞结合基序和可生物降解等特性，提示其在与再生因子联合用于骨软骨缺损治疗时，可作为支持性生物材料。经甲基丙烯酸酐化学修饰形成甲基丙烯酰化明胶（GelMA）后，可实现光交联，从而支持注射和 原位 光聚合，可增强再生医学应用中的机械稳定性17.
骨软骨损伤的自我再生能力有限，这构成了临床治疗上的挑战。采用大型动物膝关节损伤模型进行的临床前研究对于转化医学研究至关重要，因为这些模型能够系统地评估影响疾病机制和治疗效果的各种变量。常用的动物种类包括猪、山羊、犬、马和绵羊，每种动物在实验设计中都有其特定的优势和局限性，需加以考虑。此外，与人类相似，这些动物对软骨和骨软骨缺损的内源性修复能力也十分有限18。为了确保这些动物模型能够有效预测人类的治疗结果，它们必须能够重现与人类相关的解剖结构、生理特征和生物力学特性等关键参数18。作为对比，人类股骨髁关节软骨的厚度为1.8至2 mm19，而通常需要治疗的软骨缺损直径为10 mm或更大20。
猪模型在软骨和骨软骨再生研究中具有优势，因为其关节尺寸、软骨厚度以及负重需求与人类相近18。一些小型猪品种，例如哥廷根小型猪，易于操作，并在18至22个月龄之间达到骨骼成熟21。其软骨厚度为1至2 mm，可制备6至8 mm的缺损18。骨组织特征，包括小梁骨厚度、骨沉积速率和胶原纤维排列，也与人类相似22。然而，猪模型也存在局限性：即使在小型品种中，膝关节（胫股关节）仍小于人类，限制了大尺寸实验缺损的制备。此外，由于饲养成本因素，大多数研究使用骨骼尚未成熟的动物，这可能会高估修复潜力23。
山羊的关节解剖结构、生物力学特性以及软骨厚度与人类相似24。它们不需要特殊的饲养设施，易于操作，且相对经济实惠25。山羊软骨厚度范围为0.8至2.0 mm，最常报道的关键缺损尺寸为6 mm26。然而，不同品种、体型和性别的山羊在软骨厚度上存在显著差异，可能导致实验结果不一致27。其软骨与软骨下骨的比例以及小梁骨结构也与人类相近28。骨骼成熟相对较晚，通常发生在24至36月龄之间29。从生物力学角度来看，山羊膝关节所承受的关节压力和循环载荷与人类相似25，尽管在步态过程中膝关节屈曲角度更大（山羊为50°–70°，而人类为&#60;30°），导致接触区域存在差异30。这种差异加上更高的峰值压力，可能会影响软骨修复的效率30。
在大型动物模型中，犬类因其能够耐受康复训练、关节固定以及跑步机行走、游泳和受控负重锻炼的训练而尤为突出18。其关节软骨厚度介于0.9至1.3 mm之间，临界缺损尺寸约为4 mm，这限制了其与人类模型的直接比较25。骨骼成熟发生在8.5至13.7个月龄之间31。解剖学上，犬膝关节与人类膝关节存在差异，且不同犬种在生物力学、负荷模式和成熟度方面的变异使研究结果的外推变得复杂32。尽管存在这些解剖学差异和较小的缺损尺寸，犬模型在涉及康复方案或类似于人类自发性软骨病变的研究中仍具有重要价值。然而，其在实验中的应用受到伦理因素的限制29。
马是目前可用于软骨修复研究的最大动物模型，能够自然地产生与人类相似的与年龄或创伤相关的软骨损伤及骨关节炎33。马具有与人类相似的解剖学和生物力学特征，例如直立的膝关节、较大的关节尺寸、2至3 mm的软骨厚度（接近人类软骨）、步态周期中的完全膝关节伸展，以及相似的骨矿物质密度34。马的骨骼成熟期在24至48个月之间，常用的研究缺损尺寸范围为6至20 mm32,33。其局限性包括运动过程中马膝关节承受较大的垂直负荷，导致植入物所受力学作用强于人类，从而影响长期愈合效果35。此外，饲养和维护成本较高，且需要专门的设施36。
绵羊因其易于获取、性情温顺、对关节手术耐受性好且便于操作，被广泛用作软骨修复研究的动物模型37。绵羊通常在约2至3岁时达到骨骼成熟25。此外，绵羊膝关节在解剖结构和生物力学方面与人类膝关节具有相似性38。内侧股骨髁的软骨厚度范围为0.7至1.7 mm，骨密度和接触压力也与人类相近，尽管绵羊的骨体积分数较高39。由于软骨较薄，所诱导的缺损常延伸至软骨下骨，因此该模型更适用于骨软骨缺损研究32。通常在股骨髁和滑车等部位制造直径为6至8 mm的病损32。此外，绵羊模型适用于双侧对照研究，可在同一动物体内比较处理部位与对照部位，从而减少个体差异，提高实验的一致性和可重复性，并降低所需动物数量40。不同模型在人体生理和生物力学相似性方面各有差异，因此模型的选择应综合考虑生物学相关性、实际可行性及伦理因素。本研究纳入了12月龄的经产前雌性绵羊，并在其季节性乏情期进行评估。
本研究旨在设计一种在大型动物中建立急性骨软骨缺损的有效方案。该方案通过制造全层骨软骨损伤，以建立适用于再生医学研究的动物模型。此外，本研究还探索了 GelMA 水凝胶在组织修复中的引导作用，及其作为递送再生分子和细胞的潜在方法。该方案详细描述了在绵羊膝关节关节软骨上制造骨软骨损伤的外科手术步骤。该方法可适用于多种组织工程应用，包括在其他大型动物模型中诱导类似损伤，以用于再生医学研究。

<table><tbody><tr><td>25号聚甘醇酸缝合线，2-0规格</td><td>Ethicon</td><td></td><td>用于一般软组织缝合的缝合线，用于缝合关节囊和皮下疏松结缔组织。</td></tr><tr><td>抗&amp;beta;-微管蛋白抗体</td><td>Invitrogen</td><td>PA516863</td><td>针对&amp;beta;-微管蛋白的抗体，该蛋白与&amp;alpha;/&amp;beta;两个亚基共同构成细胞骨架中的微管结构</td></tr><tr><td>麻醉设备</td><td>HB hospitalar</td><td></td><td>吸入式麻醉装置</td></tr><tr><td>Axio Scan Z1</td><td>Zeiss, Munich, Germany</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>苄星青霉素G</td><td>Ourofino</td><td></td><td>抗生素</td></tr><tr><td>18 G静脉导管&amp;nbsp;</td><td>Solidor</td><td></td><td>静脉穿刺导管</td></tr><tr><td>头孢氨苄</td><td>Virbac</td><td></td><td>抗菌治疗药物</td></tr><tr><td>葡萄糖酸氯己定水溶液</td><td>RIOQU&amp;Iacute;MICA</td><td></td><td>用于皮肤消毒的抗菌剂</td></tr><tr><td>带套囊气管插管 7.5&amp;ndash;8.0 mm</td><td>Solidor</td><td></td><td>带套囊气管插管</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>&lt;br/&gt; 细胞培养基</td></tr><tr><td>硫酸二氢链霉素</td><td>Ourofino</td><td></td><td>抗生素</td></tr><tr><td>EDTA采血管</td><td>Becton Dickinson</td><td>362788</td><td>采血管</td></tr><tr><td>伊红</td><td>Neon</td><td>1795</td><td>用于观察细胞形态的染料，可对细胞质进行染色&amp;nbsp;。</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>促进骨组织的逐步脱矿</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>含生长因子的细胞培养添加剂</td></tr><tr><td>福尔马林</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td>用于保存组织形态</td></tr><tr><td>冻干GelMA</td><td>TissueLabs</td><td>GLMA-LYO-1</td><td>光交联水凝胶</td></tr><tr><td>哈里斯苏木精染液&amp;nbsp;</td><td>Laborclin</td><td>620503</td><td>用于观察细胞形态的染料，可对细胞核进行染色。</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Crist&amp;aacute;lia</td><td></td><td>麻醉维持用药</td></tr><tr><td>10%氯胺酮</td><td>VETNIL</td><td></td><td>安乐死操作用药</td></tr><tr><td>乳酸林格氏液</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>液体疗法</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>细胞培养必需氨基酸</td></tr><tr><td>盐酸利多卡因&amp;nbsp;</td><td>Crist&amp;aacute;lia</td><td></td><td>局部麻醉药</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 细胞活性/细胞毒性检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>用于评估细胞活性的荧光检测试剂盒</td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>Ouro fino</td><td></td><td>术后抗炎镇痛药</td></tr><tr><td>盐酸咪达唑仑</td><td>Crist&amp;aacute;lia</td><td></td><td>麻醉前用药</td></tr><tr><td>单股尼龙缝合线，3-0规格</td><td>Ethicon</td><td></td><td>用于皮肤缝合的缝线</td></tr><tr><td>0.9%氯化钠溶液</td><td>Cristalia</td><td></td><td>生理盐水</td></tr><tr><td>神经定位仪</td><td>Neurolocalizador DL 250 DeltaLife</td><td></td><td>通过神经定位仪和外周神经电刺激器引导实施局部麻醉。</td></tr><tr><td>骨科钻</td><td>空心微型骨科钻（精细型）- 铬合金钻杆 - Makita品牌</td><td></td><td>用于骨科手术。</td></tr><tr><td>骨科锤&amp;nbsp;</td><td>Edlo</td><td>Neufield锤（10-3155）</td><td>基本参数：长度20 cm，重量560 g；材质：优质不锈钢；用途：适用于需要精确冲击力的创伤科和骨科手术。认证信息：产品通过ISO（国际标准化组织）13485:2016质量认证，符合欧洲标准及良好生产规范。</td></tr><tr><td>Lambotte骨凿</td><td>Edlo</td><td>Lambotte骨凿（10-0749）</td><td>Lambotte骨凿（6 mm × 17 cm / 6 3/4&quot;）是一种高精度外科器械，主要用于涉及骨组织操作的骨科手术和神经外科手术。&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; 其尖端宽6 mm，适用于精细切割、修整以及致密软骨和软骨下骨的去除。</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>广谱抗生素，广泛用于细胞培养</td></tr><tr><td>盐酸哌替啶&amp;nbsp;</td><td>Crist&amp;aacute;lia</td><td></td><td>麻醉前用药</td></tr><tr><td>19.1%氯化钾</td><td>Samtec</td><td></td><td>安乐死操作用药</td></tr><tr><td>普鲁卡因青霉素G</td><td>Ourofino</td><td></td><td>抗生素</td></tr><tr><td>丙泊酚</td><td>Crist&amp;aacute;lia</td><td></td><td>麻醉诱导与维持用药</td></tr><tr><td>乳酸钠林格液</td><td>Crist&amp;aacute;lia</td><td></td><td>液体疗法</td></tr><tr><td>半闭合循环呼吸系统&amp;nbsp;</td><td>HB hospitalar</td><td></td><td>麻醉用呼吸回路</td></tr><tr><td>无菌弹力绷带</td><td>Cremer</td><td></td><td>无菌弹力绷带，用于覆盖手术肢体的远端。</td></tr><tr><td>Stimuplex D型，22 G × 2 英寸（50 mm）带延长管的绝缘针，30&amp;deg;斜面（STIMD2250/30）</td><td>BBRAUN</td><td></td><td>神经周围局部麻醉</td></tr><tr><td>盐酸曲马多</td><td>Crist&amp;aacute;lia</td><td></td><td>术后镇痛药</td></tr><tr><td>环钻</td><td>骨用环钻，直径&amp;ndash;型号：反角式，品牌：外科WF</td><td></td><td>8.0 mm骨采集环钻；由外科级不锈钢制成；用于骨移植手术；可用于获取骨块以进行组织学分析或自体移植。</td></tr><tr><td>10%赛拉嗪</td><td>VETNIL</td><td></td><td>安乐死操作用药</td></tr></tbody></table>

建立与评估一种全层骨软骨缺损的绵羊模型

Establishment and Evaluation of a Sheep Model of Full-thickness Osteochondral Defect

衰老、创伤、遗传易感性和生活方式均会影响人体软骨的退化。一旦受损，日常活动带来的持续性损伤可能引发病理性状况，例如骨关节炎，后者是全球范围内导致残疾和社会经济损失的主要原因。所有治疗关节软骨损伤的骨科医生的主要目标一直是解剖学上减小病变范围、修复软骨表面并重建关节稳定性。动物模型对于治疗药物的开发至关重要，但目前用于软骨缺损的模型仍不理想。绵羊的骨软骨缺损是测试新型疗法和生物材料的宝贵模型，有助于在人体关节环境中实现软骨和骨组织的修复。本研究建立了一种在大型动物中诱导急性骨软骨缺损的高效方案。在双侧股骨内侧髁上创建标准化的缺损。一只膝关节被随机分配接受明胶甲基丙烯酰胺（gelatin-methacryloyl）治疗，而对侧膝关节作为对照。手术后六个月，切除股骨髁区域，将解剖出的膝关节脱钙、石蜡包埋并切片，随后进行苏木精-伊红染色。采用评分系统对病变进行评估。该方法可在损伤诱导后立即进行大体观察。此外，该模型能有效模拟临床软骨缺损，为研究其病理机制及开发创新治疗策略提供了有价值的模型。

骨软骨缺损诱导
本研究旨在建立一种在大型动物中诱导急性骨软骨缺损的高效方案。损伤通过外科手术期间的机械方法产生，形成直径约8 mm、深度5 mm的病灶（图1）。根据国际软骨再生与关节 preservation 学会（International Cartilage Regeneration &amp; Joint Preservation Society）制定的评分标准，此类损伤属于4级损伤，其特征为软骨损伤已累及软骨下骨。
正确的骨钻对齐和精确的深度控制是确保模型可重复性的关键步骤。本研究中，所有穿孔均以0°（直角）进行，以降低软骨和软骨下骨非对称性切除的风险。选择股骨髁最远端区域，并与解剖中心对齐，可减少缺损位置的变异，提高动物间实验的标准化程度。此外，所使用的骨钻带有环形深度标记，能够精确监测穿孔过程中达到的深度，确保缺损特征的一致性。
<img alt="手术技术涉及软骨切...

本文介绍了一种在绵羊膝关节中制备可控性骨软骨缺损的整合性实验方案，旨在建立适用于骨与软骨组织再生研究的实验模型。该方案详细阐述了在股骨髁上诱导全层骨软骨缺损的方法，采用的技术可最大限度减少对动物福利的影响，并降低实验结果的变异性。

衰老、创伤、遗传易感性和生活方式均会影响人体软骨的退化。一旦受损，由持续性损伤导致的……

软骨通过在双轴关节中提供光滑且润滑的表面，在维持骨骼系统机械功能方面发挥着至关重要的作用，可避免关节面发生磨损。尽管软骨具有优异的支撑和分散关节内物理及机械负荷的能力，但在发生损伤时，关节软骨的自我修复能力极为有限。关节软骨中应变的累积可导致一种称为骨关节炎的病理状态，这是全球最常见的退行性关节疾病，影响着全球约10%至12%的成年人口。软骨再生及修复关节炎关节的功能是再生医学领域的重要进展。有前景的方法包括联合使用自体软骨细胞、干细胞与生物材料。为了验证这些策略，需要合适的动物模型；尽管大鼠和兔子等小型动物适用于初步研究，但绵羊等大型动物由于其关节在解剖学和生物力学上与人类更为相似，因此更为合适。接下来，我们介绍一种在大型动物中诱导骨软骨缺损的有效方案，该方案为再生医学研究提供了理想的模型。在手术室中对剃毛后的膝关节进行消毒后，将动物置于仰卧位。为了确定手术切口的准确位置，触诊动物膝关节以定位关节腔。进行手术切割，切口长度约为三至五厘米。确保切口位于动物髁突区域。剥离皮肤下方的组织层，以暴露髁突。保持切口区域清洁，以避免潜在污染，并确保手术视野清晰。使用注射器和针头采集滑膜液。放置拉钩以充分暴露髁突表面。髁突暴露得越多，下一步诱导损伤就越容易。使用连接八毫米环钻的骨科钻头，对动物的髁突造成损伤。开始钻孔前，务必确保环钻准确地位于髁突中心，以避免产生非预期尺寸的损伤。使用骨科锤和骨凿进行骨软骨栓的手术摘除。用无菌纱布清洁创面，确保病灶内部无血液和组织碎片。小心地将200微升液态gelMA制剂滴加至损伤内部，直至填满至表面。将紫外光在约五厘米的距离下照射损伤部位三分钟，以实现 gelMA 的交联。小心移除牵开器。使用独立缝线逐层缝合各组织层，以避免血清肿的形成。缝合线的数量取决于手术切口的大小。在缝合处覆盖敷料以避免感染。手术后七天，绵羊仍会出现运动困难。这些困难在动物行走评估过程中观察到的旋转运动中得到证实。该观察结果表明，我们的实验方案能够有效诱导动物关节内的骨软骨损伤。根据对损伤部位所采取的不同治疗措施，动物的步态在四天内逐渐恢复，并开始正常行走。术后六个月进行苏木精和伊红染色的组织学评估。病变表现为完全的垂直裂隙，对应于国际骨关节炎研究学会评分标准的4分。在部分样本中，观察到轻度滑膜增生以及软骨被纤维结缔组织替代的现象。组织学评分显示，在自然进展组和gelMA处理组中均存在显著的变异性，统计分析表明各治疗组之间无显著差异。由于本实验为动物实验，且结合了侵入性外科手术，动物个体在行为和恢复过程中可能出现差异。本研究展示了一种在大型动物中高效诱导骨软骨损伤的实验方案，且未出现长期细菌感染。

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全层骨软骨缺损绵羊模型的建立与评估

本文介绍了一种用于治疗兔膝关节软骨缺损的实验技术。将自体软骨细胞接种于基质后进行植入，是目前广泛认可的关节软骨损伤修复与重建方法，可获得令人满意的长期疗效。基质辅助的自体软骨细胞移植（MACT）提供了一种标准化且已在临床广泛应用的植入技术。...

基质辅助自体软骨细胞移植用于兔模型中软骨缺损的重塑与修复

介绍了一种用于治疗兔膝关节骨软骨缺损的实验技术。将同种异体间充质干细胞植入骨软骨缺损部位，为组织工程领域提供了有前景的发展方向。体外制备纤维蛋白-细胞凝块为细胞植入提供了一种标准化的方法。...

通过植入含同种异体间充质干细胞的纤维蛋白凝块治疗兔膝关节骨软骨缺损

尽管小鼠模型在骨组织工程中是不可或缺的工具，但长骨缺损模型却较为稀少。这一需求促使了本实验方案的开发，该方案采用带有四枚螺钉的锁定钢板和专用导板，以建立并稳定可重复的股骨临界尺寸缺损，且具有较低的并发症发生率。...

建立经钢板内固定稳定的鼠股骨节段性临界尺寸缺损模型

本文介绍了一种从牛膝关节中分离和培养软骨外植体的实验方案。该方法提供了一种简便且易于获取的工具，可用于描述组织在生物刺激或靶向关节的新型治疗手段作用下的变化。...

牛膝关节软骨外植体中软骨重塑的离体组织培养模型

一种非侵入性建立大鼠膝关节内关节软骨损伤模型的方法

本实验方案描述了在切断小鼠内侧半月板胫骨韧带以使膝关节失稳后，对关节软骨表面进行可控的微刃划伤操作。该动物模型可诱导骨关节炎（OA）的加速发展，适用于研究骨赘形成、骨硬化以及早期疼痛等病理过程。...

内侧半月板失稳与软骨划痕小鼠加速性骨关节炎模型

兔内侧股骨髁开放撞击模型是研究创伤后骨关节炎（PTOA）及减缓PTOA进展的新型治疗策略的可靠模型。本方案利用基于滑车的落塔装置配合撞击头，在兔后内侧股骨髁上制造孤立的软骨缺损。...

一种可重复的兔膝关节软骨撞击模型以诱导创伤后骨关节炎

本方案通过在大鼠股骨滑车沟处钻孔，建立全层软骨缺损（FTCD）模型，并检测随后的疼痛行为及组织病理学变化。...

全层软骨缺损大鼠模型的建立与评价

本方案提出一种综合性方法，通过多模态分析手段在全球范围内评估骨再生过程中的骨形成情况。该方法旨在提供有关新骨形成定性与定量的信息，从而提高基础研究和临床前研究的严谨性与有效性。...

体外模型中组织矿化的全面表征

为了更好地理解软骨细胞对机械性软骨超负荷的损伤反应，本方案描述了一种ex...

体外冲击模型用于在牛软骨组织外植体中诱导亚致死性软骨细胞损伤

了解如何在绵羊股骨髁建立全层骨软骨缺损模型，用于再生医学与软骨修复研究。该手术方案结合组织学评估与步态分析，为关节功能恢复治疗提供可靠的临床前动物模型。

建立与评估一种全层骨软骨缺损的绵羊模型

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