Name: 用于无支架小鼠卵巢卵泡培养的定制琼脂糖模具的生产和使用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-24T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学习使用定制琼脂糖模具对小鼠卵巢卵泡进行无支架培养的方法。该技术通过3D打印生物相容性模具改善卵泡生长和排卵率，为生殖生物学研究提供更接近生理条件的体外培养环境。

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本工作由美国儿童健康与人类发展国立研究所（R01HD105752 资助 F.E.D.，T32HD094699 资助 E.J.Z）、NIH 共同基金的 SenNet 计划（U54AG075932 和 UH3CA268105 资助 F.E.D.）以及比尔 &amp;#38; 梅琳达·盖茨基金会资助（编号 INV-003385，授予 F.E.D.）。根据比尔 &amp;#38; 比尔及梅琳达·盖茨基金会，本投稿可能产生的作者接受稿件版本已授予知识共享署名4.0通用许可。

作者无任何利益冲突需要披露。

体外配子发生和成熟是深入理解卵母细胞生物学的基础技术，在辅助生殖技术、生育力保存以及物种保护方面具有潜在应用价值。支持体外配子发生（IVG）的方法通常依赖于与体细胞共培养，以构建重构卵巢30。这些支持细胞的重要性在体内已被广泛认知，其中卵泡体细胞微环境对卵母细胞的正常生长和发育至关重要2,3,8,9。然而，目前的体外卵泡培养方法所产生的卵母细胞激活能力下降，与体内配子相比，受精率和胚胎发育能力均受到影响，且转录组特征存在差异64,65,66。据报道，体外培养所得卵...

卵母细胞（即雌性配子）在受精时为胚胎提供大部分细胞质以及一半的遗传物质，这对下一代的发育至关重要。卵子发生始于胚胎发育时期，此时原始生殖细胞进入减数分裂并停滞于减数分裂Ⅰ前期。这些卵母细胞位于原始卵泡内，构成卵巢储备——一个有限且不可再生的卵泡库，卵母细胞随后被逐步募集。卵泡通过称为卵泡发生的过程发育，其最终目标是产生一个能够受精的成熟配子1,2,3,4,5。卵泡发育始于一个早期的、促性腺激素非依赖性阶段，此阶段旁分泌信号对卵泡的存活和生长至关重要。当卵泡发育至次级阶段时，其功能转而依赖促性腺激素，标志着信号调控由旁分泌向内分泌转变。次级卵泡的一个关键特征是卵母细胞周围至少有两层完整的立方状颗粒细胞，同时出现新形成的膜细胞层。膜细胞构成卵泡的最外层，提供雄激素并起结构支持作用6,7。最终，在排卵期间，卵泡内形成充满液体的囊腔，并在黄体生成素（LH）激增的刺激下破裂，释放出一个处于减数分裂Ⅱ期停滞状态、具备受精能力的配子2,8,9。
卵母细胞在卵子发生和卵泡发生过程中获得受精所需的发育能力以及支持早期着床前胚胎发育的能力，这一过程称为核成熟和胞质成熟。10,11,12细胞质成熟在形态上表现为卵母细胞在整个卵泡发生过程中逐渐增大。由于体细胞（包括膜细胞、颗粒细胞和卵丘细胞）的增殖，卵泡本身经历显著的体积扩张。在小鼠中，从早期次级卵泡发育至排卵前卵泡，卵泡直径增大五倍。. 卵母细胞与其周围体细胞之间的双向通讯对卵子发生至关重要。在初级卵泡中，透明带由卵母细胞分泌的蛋白质形成，而卵泡这两个区室之间的通讯部分通过跨 zona 突起实现，后者为这两个卵泡区室提供了物理接触。13,14因此，卵泡微环境对于卵母细胞的正常生长以及核成熟和胞质成熟至关重要。2,5为了更好地理解支持这些过程的离散机制，需要采用先进且具有生理相关性的方法 体外 培养技术。培养卵泡的能力 体外 具有广泛的应用，包括辅助生殖技术和生育力保存15,16,17,18物种保护19,20药物开发21，以及毒理学筛查22,23.
体外 卵泡培养系统也是从多能干细胞（即所谓的）生成配子能力所必需的中间步骤 体外 配子发生（IVG）24研究人员已利用胚胎干细胞、间充质干细胞和诱导多能干细胞在多种物种中培育配子，通常依赖体细胞来重建天然卵泡微环境25,26,27,28,29,30尽管通过这些方法已实现主要的概念验证里程碑，但仍存在卵母细胞质量较低的挑战，这体现在胚胎发育率和出生后代率较低。 体外 小鼠受精31,32目前其他物种中尚未实现活产，这凸显出需要持续优化方案以全面支持卵子发生和卵泡发育。
目前，卵泡培养采用多种策略。其中技术要求最低且通量最高的方法是无支架法，即将卵泡置于塑料培养皿或膜插件中。33,34此处，颗粒细胞贴附于培养表面，与卵母细胞失去接触33,34卵泡结构的破坏限制了这些技术的可用性和生物学相关性。然而，在低吸附培养板或倒置液滴中进行无支架培养，可在多种哺乳动物物种中维持卵泡的结构完整性。35,36,37遗憾的是，使用这些技术难以控制卵泡之间的相互作用及其所获得的机械支持程度。因此，为了更准确地模拟 体内 生理学，已开发出将卵泡包埋于具有明确且可调控化学成分和/或机械特性的水凝胶中的培养方法33,34,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53例如，海藻酸盐包封的 体外 卵泡生长系统可重现所观察到的关键转录组特征 体内21.
尽管包埋培养方案已取得成功并具有重要价值，但仍存在若干缺点。这些方法在技术上具有挑战性，操作繁琐，通量较低，且无法与自动化成像技术兼容。此外，由于较大哺乳动物卵泡的体积扩张更为显著，包埋培养方法需要采用多步骤操作流程。37此外，封装技术在各个方向上提供均匀的支撑，而毛囊需要在排卵前从水凝胶中释放出来，但这一过程并不会发生。 体内，其中卵泡与周围的卵巢微环境相互作用，后者提供动态的生物力学支持54例如，坚硬的卵巢皮质可维持原始卵泡的静止状态，而较大的生长卵泡通常位于较柔软的髓质区域。55,56一旦含有成熟卵母细胞的卵泡达到终末大小，卵泡壁和卵巢表面上皮发生改变，从而允许排卵发生。因此，若培养技术允许卵泡在单一方向上生长且受到的阻力较小，则更能模拟这一生理过程 体内 生理学
本研究提出了一种新颖的方法，建立了一种可重复、可扩展、技术要求较低且成本效益高的小鼠多层次级卵泡培养体系57。该方法采用经济可行的技术制备超低吸附性的琼脂糖微孔阵列，其几何结构（形状、尺寸）和空间排列（数量、间距）均可精确控制。卵泡在琼脂糖模具中仅在一个方向上无机械支撑，并在同一焦平面上进行培养，从而实现延时成像，便于进行高级形态动力学分析。本研究采用立体光刻（SLA）3D打印技术制备主模具，随后通过复制工艺获得无浸出物的硅胶模具用于琼脂糖成型。与传统的体外卵泡生长（eIVFG）方法相比，新体系在不损害卵泡整体存活率、成熟率或黄体化能力的前提下，显著改善了卵泡生长和排卵结果57。本实验方案详细描述了琼脂糖模具的定制与制备步骤、多层次级卵泡的接种与培养过程，以及最终的延时成像分析方法（图1）。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;材料与化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;50 mL 聚苯乙烯离心管</td><td>Globe Scientific</td><td>941-11017-CS</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>MCT-150</td><td>快速冷冻并储存培养基</td></tr><tr><td>100 毫米培养皿，未处理</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D&amp;nbsp;</td><td>制备并储存琼脂糖微模具</td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>Mercedes Scientific</td><td>1200</td><td>组织处理</td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L&amp;nbsp; 移液器吸头，低吸附</td><td>MIDSCI</td><td>PR-1000BK</td><td>培养小贴士&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L&amp;nbsp; 移液器吸头，低吸附</td><td>MIDSCI</td><td>PR-200BK</td><td>培养小贴士&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>康宁</td><td>353047</td><td>培养</td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td>分离卵巢并在酶解培养基中孵育</td></tr><tr><td>95% 乙醇</td><td>Mercedes Scientific</td><td>1210</td><td>组织处理</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Hoefer</td><td>GR140</td><td>微模具</td></tr><tr><td>BioXtra 矿物油，轻质油，适用于小鼠胚胎细胞培养</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310-500ML</td><td>用作生物相容性脱模剂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>103700</td><td>培养基</td></tr><tr><td>清洁除尘布，10盎司，6片装</td><td>Office Depot&amp;nbsp;</td><td>110284</td><td>压缩空气</td></tr><tr><td>Clear V4 树脂 1 L</td><td>Formlabs, Inc</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td>3D打印树脂</td></tr><tr><td>康宁可重复使用塑料低型100 mL烧杯，聚丙烯，带刻度</td><td>康宁</td><td>1000P-100</td><td>用于混合硅胶组分的烧杯&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DNA酶I</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>酶解培养基</td></tr><tr><td>Ecoflex 00-45 近无色</td><td>Smooth-On, Inc</td><td>B09M8Y9PTV</td><td>硅胶材料</td></tr><tr><td>F-12 + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31765-035</td><td>培养基</td></tr><tr><td>胎牛胎球蛋白</td><td>Sigma</td><td>F-3385</td><td>培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>峰值血清</td><td>PS-FB2</td><td>解剖培养基，酶解培养基&amp;nbsp; 维持培养基 &amp;与成熟培养基</td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;灭菌袋</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-50&amp;nbsp;</td><td>灭菌袋</td></tr><tr><td>促卵泡激素（FSH）</td><td>EMD Serono, Inc.</td><td>Gonal-F 处方药&amp;nbsp;</td><td>培养基 &amp;与成熟培养基</td></tr><tr><td>Gibco&amp;nbsp;DPBS、钙、镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-040-182&amp;nbsp;</td><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素（hCG）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1063-1VL</td><td>成熟培养基</td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>41400045</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Invitrogen Molecular Probes 罗丹明鬼笔环肽</td><td>Fisher Scientific</td><td>R415</td><td>卵细胞骨架染色</td></tr><tr><td>体外受精培养皿</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>150260</td><td>分离、筛选并预平衡卵泡</td></tr><tr><td>Leibovit'z 15 (L15)</td><td>Gibco</td><td>11415-064</td><td>解剖介质 &amp;和酶解培养基</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401119001</td><td>酶解培养基</td></tr><tr><td>MEM? + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>32561-037</td><td>维持培养基，&amp;nbsp; 培养基 &amp;与成熟培养基</td></tr><tr><td>小鼠表皮生长因子（EGF）</td><td>BD 生物科学</td><td>354010</td><td>成熟培养基</td></tr><tr><td>Nalgene 透明聚碳酸酯经典设计干燥器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>5311-0250</td><td>真空干燥器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Fisher Scientific</td><td>83-30</td><td>组织处理 &amp;和包埋</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>解剖培养基，酶解培养基 &amp;amp; 维持培养基</td></tr><tr><td>移液器吸头剥离器</td><td>Origio</td><td>MXL3-200</td><td>培养</td></tr><tr><td>含DAPI的VECTASHIELD PLUS抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-2000</td><td>卵核染色</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Mercedes Scientific</td><td>9840</td><td>组织处理</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Tubulin（11H10）兔单克隆抗体（Alexa Fluor 488 标记）</td><td>细胞信号技术公司</td><td>5063S</td><td>卵细胞微管蛋白染色</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>构建平台 2</td><td>Formlabs, Inc</td><td>BP-F3-02-01&amp;nbsp;</td><td>3D 打印机组件</td></tr><tr><td>Dino-Lite Edge AF4915ZTL，USB 2.0</td><td>Dino-Lite</td><td>AF4915ZTL</td><td>用于延时成像设置的成像仪</td></tr><tr><td>Form 3 树脂槽 V2.1&amp;nbsp;</td><td>Formlabs, Inc</td><td>RT-F3-02-01</td><td>3D 打印机部件</td></tr><tr><td>Form 3B+ 3D 打印机</td><td>Formlabs, Inc</td><td>F3B-P-PRINTER</td><td>Formlabs 的立体光刻（SLA）3D 打印机</td></tr><tr><td>后固化&amp;nbsp;</td><td>Formlabs, Inc</td><td>FH-CU-01</td><td>固化平台&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>形成洗涤液</td><td>Formlabs, Inc</td><td>FH-WA-01</td><td>洗涤平台</td></tr><tr><td>喷雾瓶配泵式雾化器</td><td>VWR</td><td>0309-3005</td><td>涂抹脱模剂</td></tr><tr><td>Edge 系列聚光罩（T5、T8 型号除外）</td><td>Dino-Lite</td><td>N3C-R</td><td>延时成像装置的成像组件</td></tr><tr><td>结合RK-10支架与RK-10-EX臂扩展装置的安装支架组件</td><td>Dino-Lite</td><td>RK-10A</td><td>延时成像装置的成像组件</td></tr><tr><td>组织包埋机</td><td>Leica</td><td>HistoCore Arcadia</td><td>嵌入微模具</td></tr><tr><td>组织处理仪</td><td>Leica</td><td>TP1020</td><td>处理微模具</td></tr><tr><td>211DS 摇床培养箱（往复式摇床）</td><td>Labnet International</td><td>I-5211-DS</td><td>将卵巢在酶解培养基中孵育以释放卵泡</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Autodesk Fusion</td><td>欧特克有限公司</td><td></td><td>计算机辅助设计（CAD）软件。Autodesk 通过其 Autodesk 教育计划提供免费的教育用途访问权限。</td></tr><tr><td>DinoCapture 3.0 版本 1.1.1.3&amp;nbsp;</td><td>Dino-Lite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>分析OCT图像并测量卵泡</td></tr><tr><td>PreForm</td><td>Formlabs, Inc</td><td></td><td>一款专为 Formlabs 公司的光固化立体成型（SLA）3D 打印机设计的免费打印准备软件。&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

可定制琼脂糖模具的制备及其在无支架小鼠卵巢卵泡培养中的应用

Production and Use of Customizable Agarose Molds for Scaffold-Free Mouse Ovarian Follicle Culture

卵巢卵泡是卵巢的功能单位，可产生维持女性生殖功能和健康所必需的激素和配子。体外重现卵泡发育、排卵和黄体化过程的能力在基础研究、转化研究和临床应用中具有广泛用途。目前最先进的体外卵泡培养系统可维持卵泡的三维（3D）结构，这对于人类减数分裂成熟至中期II（MII）的卵母细胞发育至关重要。最近，一种无需支架的体外培养小鼠多层次级卵泡的方法已被开发并验证。该方法采用定制的3D打印模具，在琼脂糖上微图案化出微孔阵列，以容纳卵泡的体积扩张。在此无支架环境中培养的卵泡，其激素分泌水平和存活率与成熟的基于海藻酸盐包封的体外卵泡生长（eIVFG）系统相当。重要的是，琼脂糖微孔阵列方法具有可扩展性，技术要求较低，并且相较于eIVFG系统，表现出更优的卵泡生长和排卵率。该方法所制备的模具具有良好的生物相容性，适用于对材料特异性浸出物及其他环境污染物高度敏感的卵母细胞。此外，该系统中的卵泡在同一焦平面上培养，便于进行实时延时成像与分析。为提高该新技术的可及性，本文详细描述了设计和3D打印主模具、制备适用于24孔或96孔板的硅胶模具，以及在琼脂糖模具中培养分离的多层次级卵巢卵泡所需的方法。该系统还可与低成本的延时成像系统整合，实现形态动力学分析。此外，模具可进行石蜡包埋，用于后续组织学分析。总体而言，这一用户友好的方法是一种多功能的卵泡培养工具，还可进一步定制，以促进卵泡微环境中生殖细胞的分化与成熟，从而实现完整的体外配子发生。

为了确定使用本研究方案第7节中所述的新型技术是否能够支持卵泡的存活与生长，从同一批小鼠中分离卵泡，并平行培养于琼脂糖微模具中或包埋于0.5%海藻酸盐中。培养期间每隔一天的代表性图像显示，卵泡表现出正常的发育、生长以及卵泡腔的形成（图6A）。先前发表的研究结果表明，两种培养方法在卵泡存活率方面无显著差异，但琼脂糖微模具中培养的卵泡直径显著更大57。这表明，与海藻酸盐包埋法相比，琼脂糖微模具能以更高的效率支持卵泡发生。
通过琼脂糖微模具培养的卵泡中卵母细胞的减数分裂进程和纺锤体排列情况进行了评估。按照方案第7.11步所述，对两种条件下的卵泡均诱导排卵。存活至第8天的卵泡进行了后续分析。 体外 排卵，以及两种条件下排卵前（pre-hCG）和排卵后（post-hCG）的代表性图像如下所示（图6B). 既往实验表明，与海藻酸盐相比，琼脂糖中培养的卵泡排卵率显著更高。在排出的卵母细胞中，不同条件下MII期卵母细...

我们描述了一种在新型无支架琼脂糖模具中培养卵巢卵泡的方法，该方法可作为补充 体外 配子发生

卵巢卵泡是卵巢的功能单位，可产生维持女性生殖功能和健康所必需的激素和配子。

我们的研究旨在开发一种可定制、生理模拟且无支架的卵泡培养方法，以确定该方法是否能够提高体外生长卵泡及其发育卵母细胞的质量。目前最先进的培养方法采用水凝胶包埋的体外卵泡生长系统，可使卵泡在卵泡发育过程中维持其三维结构。然而，水凝胶包埋技术操作复杂、耗时耗力、通量低，且遗憾地无法与自动成像技术兼容。此外，三维包封提供的支持较为均匀，无法模拟体内生理环境。我们制备了可生物相容的3D打印模具，以支持卵母细胞这类高度敏感的细胞。与现有技术相比，在无支架环境中培养的卵泡表现出更优的生长和排卵能力，且未影响激素的产生。我们正在致力于开发一种用户友好且可定制的培养系统，以更好地模拟卵泡的天然环境。延时成像技术还可实现对卵泡动态行为的实时追踪与分析。首先，在计算机系统上启动CAD软件。在软件中打开24孔主模具基底设计步骤文件。选择物体的内表面区域，然后转到设计工作区中的“实体”选项卡，选择“创建草图”以插入所需的微模具设计。现在，输入所需的微孔阵列的 x 和 y 方向尺寸及微孔数量，然后在工具栏中选择“完成草图”。通过依次选择“实体”、“创建”和“拉伸”功能，使用“拉伸”命令创建深度为 800 µm 的微孔。现在，通过点击“设计”、“实体”、“修改”和“倒圆角”，为微孔顶部选择一个半径为 0.1 毫米的倒圆角。再添加一个半径为 0.25 毫米的倒圆角，以形成圆底微孔。保存新的母模设计，并通过选择“文件”然后点击“导出”，以 STEP 格式导出一份副本。打开24孔硅胶铸模容器的单步文件。然后通过右键单击已保存的文件并选择“插入到当前设计中”，将新的主模具设计作为外部组件插入。接下来，右键单击已插入的组件，选择“断开链接”，以移除对主模具设计的引用。将新的主模具设计居中放置于24孔硅胶铸模容器的一个表面内侧，确保其朝向内侧。选择“确定”以对齐对象。选择“切割”操作，以容器为目标体，主模具为工具体，从而创建硅胶成型腔体。保存并导出新的24孔硅胶模具一的stl和step文件。使用3D打印准备软件打开新的24孔硅胶模具一和24孔硅胶铸造成型容器二的stl文件。将打印方向设置为微柱朝上，并使用钻孔功能在打印件侧面创建一个宽度为1毫米的开口。以25微米的层厚打印两种容器设计。根据制造商的说明清洗打印完成的样品，然后用95%异丙醇对微柱部分进行充分喷洒。使用压缩空气去除残留的乙醇。干燥和固化后，使用体视显微镜检查每一份打印样品。仔细确认所有微柱均彼此分离，且大小和外观均匀一致。固化后，若钻孔通道未填充，则用Parafilm覆盖打印件外部，并储存以备后续使用。接着，将制备好的硅胶放入真空干燥器中抽真空五分钟，以去除气泡。将硅胶混合物以均匀的流速倒入3D打印模具中，确保液面与模具表面齐平或略低于表面，以保证平整度。使用 P200 移液器吸头去除 trapped air（滞留气泡），必要时再次进行脱气。将硅胶置于干燥器中，在室温下固化至少五小时，或更佳情况下过夜。固化完成后，将硅胶从模具中取出，并在体视显微镜下检查微模具。清除钻孔通道中的任何多余材料，并丢弃存在桥接或孔壁损坏的模具。接下来，将硅胶模具放入硅胶模具容器二中以进行第二次成型步骤，确保侧边开口对齐。用胚胎安全的矿物油轻轻喷洒硅胶模具。使用压缩空气去除微孔中多余的油。重复硅胶混合步骤，将新混合物倒入第二个容器中，保持液面高度在模具表面或以下。第二天，将硅胶从3D打印模具上分离，并将硅胶模具一和硅胶模具二彼此分开。在显微镜下检查后，丢弃微柱结构受损或孔中有过量油渍的模具。随后，用70%乙醇清洗硅胶模具，并在超净工作台中静置风干30分钟。干燥后，将模具放入灭菌袋中，再进行高压灭菌。轻微弯曲剥离针头以提高毛囊转移过程中的精确度。快速转移毛囊，以防止pH值或温度波动。在显微镜下，使用200微米的剥离吸头将10个多层次级卵泡转移至每个微模具中，将其放置在相邻的微孔内。在最终确定设置前，确认所有10个卵泡大小相似。接着，将一个聚光帽安装到手持式显微镜上。将显微镜连同支架放入培养箱中，并连接至安装有软件的笔记本电脑。将培养孔板置于显微镜下并进行定位和对准，调节高度和焦距，使所有卵泡均清晰可见。使用自动白平衡（AWB）和LED控制功能。关闭自动曝光（AE），选择最佳曝光时间。开始持续八天、间隔30分钟的延时成像。在不拍摄图像时选择拍照模式并关闭LED光源。在琼脂糖微模具中培养的卵泡表现出持续生长和卵泡腔形成。诱导排卵后，琼脂糖微模具中培养的卵泡产生的排卵卵母细胞数量多于海藻酸盐组。进一步证明其生物相容性，两组间M2期卵母细胞的纺锤体形态无显著差异。海藻酸盐包封的卵泡在培养过程中无法保持其位置，因此不适用于延时成像。在延时成像过程中，可实时连续追踪并测量每个卵泡的形态学参数，包括Feret直径、圆形度和长宽比。光学相干断层扫描技术可实现卵泡内部结构的三维可视化，并能捕捉排卵过程中卵泡破裂的动态事件。琼脂糖微模具可实现多个卵泡在石蜡包埋和切片后处于同一平面上的组织学分析，有助于识别组织的存在或缺失，并支持苏木精-伊红（H&E）染色。为展示该方法的可定制性，研究人员设计了一种高通量的96孔版本，每模包含10个微孔，并成功制备。与24孔设计类似，该版本同样适用于卵泡的延时成像。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

用于无支架小鼠卵巢卵泡培养的定制琼脂糖模具的生产和使用

介绍了一种将卵巢卵泡包埋于三维纤维蛋白-海藻酸盐互穿网络的新方法。该系统结合了结构支撑与蛋白水解降解特性，可支持未成熟卵泡发育并产生成熟卵母细胞。该方法也可用于培养细胞聚集体，以维持细胞间接触，同时不限制其扩展。...

一种用于卵泡包封及在蛋白酶可降解三维系统中培养的方法

在三维环境中培养正常细胞是研究细胞转化和肿瘤发生早期事件的替代方法。该方法用于培养正常的卵巢和输卵管细胞，以研究卵巢癌形成过程中的早期事件。...

用于卵巢和输卵管三维器官培养的海藻酸盐水凝胶

本方案描述了小鼠卵巢组织的原代培养/共培养方法，使用新生小鼠的卵巢以及未成年小鼠的单个卵巢卵泡。该培养技术能够以高度生理化的方式支持卵泡发育，可用于研究外源性因子对卵巢的影响以及卵巢卵泡之间的相互作用。...

小鼠卵巢和卵巢卵泡的培养与共培养

本方案描述了一种利用定制的3D打印塑料模具制备不同尺寸自组装组织环的平台。将PDMS倒入3D打印模具中固化形成阴模，然后将琼脂糖注入固化的PDMS阴模中成型。将细胞接种至所得的琼脂糖孔中，细胞在其中聚集形成组织环。...

使用3D打印模具制备定制琼脂糖孔用于细胞接种和组织环自组装

本文展示了两种在三维培养条件下包封猪卵母细胞的实验方案。第一种方法是将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）包封于纤维蛋白-海藻酸盐微珠中；第二种方法是将其与氟化乙烯丙烯粉末颗粒（微型生物反应器）共同封装。这两种系统均可提供最佳条件，以维持卵母细胞的三维结构。...

蛋白酶可降解的海藻酸盐水凝胶与疏水性微型生物反应器用于猪卵母细胞包封

本文描述了四种利用新生小鼠睾丸原代细胞生成睾丸类器官的方法，即细胞外基质（ECM）依赖性和非依赖性的二维（2D）及三维（3D）培养环境。这些技术具有多种研究应用价值，尤其适用于体外研究睾丸的发育过程和生理功能。...

基于细胞外基质与无细胞外基质的小鼠睾丸类器官生成方法

本方案描述了一种利用3D打印的印章式装置，以低成本大规模制备组织球体的技术。...

组织类球体的生成 通过 一种3D打印的印章状装置

本方案描述了一种利用酪胺交联透明质酸水凝胶包封并培养小鼠卵巢前腔卵泡的新型三维（3-D）培养模型。我们还详细介绍了通过玻璃化冷冻法进行卵巢卵泡冷冻保存的两种方法。...

一种新型透明质酸水凝胶在卵泡三维培养中的应用及小鼠卵巢卵泡冷冻保存方法

本研究介绍了一种经济高效且简便的3D细胞结构制备方法，该方法采用基于印章的系统在琼脂糖模具中制备微孔。该系统可促进均一的类球体/类器官形成，从而增强细胞间相互作用。该方法降低了实验变异性，适用于药物筛选和组织工程等应用。...

利用新型印章装置从二维细胞培养生成三维球状体/类器官

我们描述了从小鼠卵巢的基质富集部分分离小鼠卵巢体细胞的方法，以及采用无支架方法生成小鼠卵巢体细胞类器官的技术。...

探究卵巢微环境：小鼠卵巢体细胞的分离、二维培养及类器官培养方法

学习使用定制琼脂糖模具对小鼠卵巢卵泡进行无支架培养的方法。该技术通过3D打印生物相容性模具改善卵泡生长和排卵率，为生殖生物学研究提供更接近生理条件的体外培养环境。

可定制琼脂糖模具的制备及其在无支架小鼠卵巢卵泡培养中的应用

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