用于轴突损伤模型的微流控芯片构建和实现多组学分析
2025年10月14日
该协议描述了一种微流体系统，该系统对轴突损伤后的神经元代谢动力学进行建模，从而实现内在代谢重塑的成像、多组学分析和机制研究。
我们开发了大规模微流体芯片来进行多组学分析，旨在说明轴突损伤后神经元的代谢机制。我们主要利用微流控技术、代谢通量分析和转录组学来推进神经元在轴突损伤和再生过程中的代谢机制的研究。我们发现，不同发育疾病的皮质神经元之间存在代谢差异，年轻神经元在外伤后发生代谢重塑。
我们协议的核心优势在于更大规模的微流控平台设计和作标准，可实现精确的多组学和数百万个细胞的大小。首先，将 PDMS 基质和固化剂转移到离心管中。将装有混合物的离心管放入离心搅拌器混合器中。
以 2， 000 G 离心 4 分钟两次，以混合和脱气。将13至15克脱气后的PDMS倒入微流控模具中，确保模具底部完全覆盖。现在，将模具放入真空干燥器中，然后使用真空泵排出空气 5 到 10 分钟，以彻底去除 PDMS 中的气泡。
使用橡胶球轻轻敲击 PDMS 的表面，以打破任何残留的表面气泡。将模具转移到对流烤箱中，在80摄氏度下烘烤100分钟，以固化聚二甲基硅氧烷。PDMS 完全固化后，将手术刀的尖端轻轻滑到 PDMS 边缘下方，小心地将其提起并与模具分离。
使用直径为2.0至2.5毫米的活检冲头，在PDMS上打孔，用于培养基输注和细胞上样。使用胶带去除 PDMS 上的任何表面杂质，然后将其放入干净的玻璃盘中并用铝箔包裹储存。实验前，将微流体装置在121摄氏度和101千帕下高压灭菌5分钟，以确保无菌。
将用于传统微流控设备的盖玻片放入 35 毫米培养皿中。在培养皿中加入两毫升每毫升 0.1 毫克的聚 D-赖氨酸溶液。将培养皿在 37 摄氏度下孵育六小时或过夜。
孵育后，小心地取出聚-D-赖氨酸溶液以供重复使用或正确处置。现在，在培养皿中加入两毫升无菌超纯水。顺时针旋转 50 次，然后逆时针旋转 50 次。
使用连接到无菌移液器吸头的真空泵吸出水，将废物收集在液体废物容器中。所有清洗完成后，使用前让盖玻片在生物安全柜中自然风干。使用无菌细尖镊子，将高压灭菌的微流控芯片放置在玻璃表面的中心，微通道朝下。
使用 200 微升移液器吸头将芯片轻轻压在玻璃表面上，以确保完全粘附。接下来，使用永久性记号笔用点标记左腔室，以指定体细胞隔室。用 10 微升移液器吸出 10 微升神经元悬浮液，然后将悬浮液缓慢分配到标记的体细胞隔间上方的装载口中。
确认流体正确流入左腔室的下储液罐。将培养皿转移到设置为37摄氏度和5%二氧化碳的加湿培养箱中20分钟。孵育后，将培养皿置于20X显微镜下，以确认通过微通道从体细胞室到轴突室的培养基丰富。
现在，将 150 微升神经元基础培养基移液到轴突隔室的上端口。类似地，将 150 微升完整神经元培养基添加到体细胞室的上部端口中。接下来，将 20 毫升超纯水倒入 150 毫米培养皿中，形成一个湿度室。
将 35 毫米培养皿放入大培养皿内，然后将整个培养系统转移到培养箱中并保持所需的时间。使用10厘米宽的培养皿放置大型微流控装置。根据实验需要选择全通道或间隔通道播种，因为每种方法都需要不同的轴突损伤方案。
接种完成后，向培养皿中加入五毫升完全神经元培养基，以维持神经元生长。将适量的神经元基础培养基转移到新的15毫升离心管中备用。将包含皮质神经元的微流体装置放在干净的工作台上。
使用无绒纸擦干 35 毫米培养皿的底部，然后使用 200 微升移液器从微流控装置的两个右侧孔中吸出培养基。接下来，将真空泵管连接到无菌、无过滤器的 200 微升移液器吸头。以每分钟60升的吸力打开真空泵，将尖端对准轴突末端室下孔与腔室之间的连接点，吸出旧介质，因负压导致轴突断裂。
更换移液器吸头并抽取 150 微升神经元基础培养基，通过右腔室的下孔缓慢添加。进行四次添加和抽吸后，更换为新鲜的完全神经元培养基，然后从细胞体侧孔中吸出旧培养基，并根据需要添加含有药物的新鲜完全神经元培养基。将微流控装置与培养皿一起放入150毫米培养皿中，并继续培养所需的时间，例如24小时。
对于手动轴突损伤，将神经元接种到大型微流控装置的所有腔室中。将设备在37摄氏度下在含有5%二氧化碳的加湿培养箱中孵育三天。在体外第七天，从培养箱中取出含有微流体装置的培养皿，并将其置于无菌阶段。
准备20倍放大倍率的显微镜，并使用75%乙醇对工作区域进行消毒。握住 10 微升无菌过滤移液器吸头，并在显微镜引导下识别原始微通道中的轴突束。使用移液器吸头沿每个轴突束进行纵向划痕。
在显微镜下实时观察轴突断裂情况。标准微流控装置的微通道允许轴突的生长，但不允许体细胞生长，正如体外 7 天的 β 3 微管蛋白染色所证实的那样。轴突损伤后神经元密度没有显着差异，表明没有观察到的神经元死亡。
开发了一种具有三维可扩展设计的大型微流控装置，用于多组学分析。未打孔和穿孔的 PDMS 复制品都牢固地粘附在 10 厘米的盘子或 PC 板上。移液器吸头刮擦引起的轴突损伤导致轴突明显切断，形态被破坏，这与受伤前的完整轴突形成鲜明对比。
在受伤后 6 小时和 24 小时观察到轴突再生，而未受伤的轴突保持稳定。神经元蛋白浓度从基线的 1420.4 微克/毫升显着上升到受伤后 6 小时的 1748.9 微克/毫升和 1823.7 微克/毫升。对照组和轴突损伤组的 RNA 产量几乎相同。
RNA测序发现损伤特异性基因595个，对照特异性基因609个，组间共有17， 471个基因。KEGG 通路分析确定了损伤后氧化磷酸化、活性氧反应、自噬和 TCA 循环通路的显着上调。
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概述
本研究提出了一种旨在研究轴突损伤后神经元代谢动态的微流控系统。该平台允许进行成像和多组学分析，以了解此过程中神经元的内在代谢重塑。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经生物学
- 代谢动态
背景
- 神经元通过各种代谢调整来应对轴突损伤。
- 皮质神经元在不同发育阶段显示出不同的代谢特征。
- 理解这些机制可以为神经元再生的洞见做出贡献。
- 先前的研究表明需要创新平台来研究这些过程。
研究目的
- 阐明轴突损伤后神经元中发生的代谢机制。
- 利用大规模微流控平台进行全面分析。
- 提供关于受伤后年轻神经元代谢重塑的新见解。
使用的方法
- 主要平台是一个大规模的微流控芯片，便于操控和观察神经元细胞。
- 皮质神经元作为生物模型，重点关注其对诱导轴突损伤的反应。
- 采用多组学工作流，包括转录组学和代谢通量分析，以收集全面的数据。
- 关键步骤包括准备和高压灭菌微流控设备，以及精确处理神经元培养。
- 操作协议明确列出，以确保方法的可重复性和准确性。
主要结果
- 研究结果揭示了皮质神经元之间的代谢差异与其发育阶段相关。
- 年轻神经元在轴突损伤后表现出显著的代谢重塑。
- 数据表明了对神经元损伤反应和再生能力的关键机制洞见。
- 结论强化了多组学方法在神经生物学研究中的潜力。
结论
- 本研究为探索损伤后神经元代谢过程提供了新的方法。
- 通过多组学分析获得的洞见增强了对神经元可塑性和恢复的理解。
- 研究结果对开发神经元损伤和再生的治疗策略具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput microfluidic platforms for axonal injury modeling enable robust, reproducible interrogation of neuronal metabolic remodeling, directly supporting early-stage neurodegeneration target validation. Multi-omics compatibility enhances predictive confidence in mechanistic hypotheses and accelerates risk-adjusted portfolio triage for neurotherapeutic discovery. This scalable system bridges the gap between in vitro modeling and translational biomarker development for CNS drug pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of neuronal metabolic pathways post-injury for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by isolating soma and axon compartments for independent analysis.
- Facilitates identification of injury-responsive genes and pathways relevant to neurodegeneration.
- Improves predictive confidence in target selection through quantitative multi-omics outputs.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible platform for preparing disease-relevant neuronal systems.
- Enables quantitative assessment of metabolite and enzyme dynamics for assay development.
- Supports high-throughput screening readiness by accommodating millions of cells per run.
- Delivers robust, scalable outputs suitable for downstream compound evaluation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro metabolic remodeling with in vivo neurodegeneration mechanisms for translational continuity.
- Enables multi-omics biomarker discovery for preclinical validation of neuroprotective strategies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insight into neuronal injury responses.
- Facilitates cross-platform data integration for comprehensive CNS disease modeling.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic platform integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through lead identification and preclinical biomarker validation in neurodegeneration pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of metabolic and injury-response pathways in compartmentalized neuronal systems.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative multi-omics outputs for assay standardization and compound triage.
- Analytics: Enables high-content transcriptomic and metabolomic readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo disease mechanisms for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, reusable platform adaptable to diverse CNS disease models and discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration research.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and supports high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early-stage de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication and neuronal culture techniques.
- Demands access to multi-omics analytical infrastructure for transcriptomic and metabolomic profiling.
- Necessitates cross-team standardization of operational protocols for reproducibility.
- Adaptable to various neuronal subtypes and injury paradigms with protocol optimization.
- Throughput and data integration may be limited by analytical capacity and sample handling logistics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:13
Fabrication and Sterilization of Polydimethylsiloxane (PDMS) Microfluidic Devices
3:04
Coating Coverslips with Poly-D-Lysine for Microfluidic Cell Culture
4:09
In Vitro Culture of Cortical Neurons in Conventional or Large-Scale Microfluidic Devices
6:24
Establishing an In Vitro Axonal Injury Model in Conventional Microfluidic Devices
8:02
Large-Scale Microfluidic Device Axonal Injury
9:01
Results
