Name: 用于轴突损伤模型的微流控芯片构建和实现多组学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学习利用大规模微流控芯片技术结合代谢通量分析与转录组学，研究轴突损伤后神经元的代谢重塑机制。该方法可揭示年轻神经元的代谢动态变化，为神经再生研究提供多组学数据支持。

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本工作得到北京市自然科学基金（资助号：L222080、F251031、Z240011、7192103）和国家自然科学基金委员会（资助号：82271513）的支持

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<li>Donato, A., Kagias, K., Zhang, Y., Hilliard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+sub-compartmentalization%3A+a+strategy+to+optimize+neuronal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Rev+Camb+Philos+Soc%22%5BJournal%5D)">Neuronal sub-compartmentalization: a strategy to optimize neuronal function.</a> Biol Rev Camb Philos Soc. 94 (3), 1023-1037 (2019).</li>
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<li>Huang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+an+energetic+AKT-PAK5+axis+boosts+axon+energy+supply+and+facilitates+neuron+survival+and+regeneration+after+injury+and+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming an energetic AKT-PAK5 axis boosts axon energy supply and facilitates neuron survival and regeneration after injury and ischemia.</a> Curr Biol. 31 (14), 3098-3114 (2021).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+axon+regeneration+by+enhancing+mitochondrial+transport+and+rescuing+energy+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Facilitation of axon regeneration by enhancing mitochondrial transport and rescuing energy deficits.</a> J Cell Biol. 214 (1), 103-119 (2016).</li>
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<li>Yuan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+and+in+vivo+stable+isotope+labelling+of+central+carbon+metabolism+and+related+pathways+with+analysis+by+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by LC-MS/MS.</a> Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).</li>
<li>Mercimek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+effects+of+3D+printed+mold+material%2C+curing+temperature%2C+and+duration+on+polydimethylsiloxane+%28PDMS%29+curing+characteristics+for+lab-on-a-chip+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">On the effects of 3D printed mold material, curing temperature, and duration on polydimethylsiloxane (PDMS) curing characteristics for lab-on-a-chip applications.</a> Micromachines (Basel). 16 (6), 684(2025).</li>
<li>Derosa, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergent+pathways+in+idiopathic+autism+revealed+by+time+course+transcriptomic+analysis+of+patient-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Convergent pathways in idiopathic autism revealed by time course transcriptomic analysis of patient-derived neurons.</a> Sci Rep. 8 (1), 8423(2018).</li>
<li>Cheng, X. T., Huang, N., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programming+axonal+mitochondrial+maintenance+and+bioenergetics+in+neurodegeneration+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Programming axonal mitochondrial maintenance and bioenergetics in neurodegeneration and regeneration.</a> Neuron. 110 (12), 1899-1923 (2022).</li>
<li>Huang, N., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+as+model+platforms+of+CNS+injury-ischemia+to+study+axonal+regeneration+by+regulating+mitochondrial+transport+and+bioenergetic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regen%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices as model platforms of CNS injury-ischemia to study axonal regeneration by regulating mitochondrial transport and bioenergetic metabolism.</a> Cell Regen. 11 (1), 33(2022).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

建立用于研究轴突损伤与再生的先进体外模型，对于揭示神经元修复过程中涉及的分子与代谢机制至关重要16,19。在本研究中，我们提出了一种标准化的工作流程，该流程整合了微流控装置、大规模神经元培养以及精确的轴突损伤方案，能够对受损皮层神经元进行可靠的多组学分析。
该方法的成功在很大程度上依赖于若干关键的操作步骤。在微流控芯片制备过程中，精确控制PDMS的固化时间（80 °C下100–120分钟）和灭菌时间（5–10分钟）至关重要，以防止芯片过度硬化，从而避免后续出现滑脱或泄漏问题25。此外，轴突切断过程中真空泵的参数设置必须准确：吸力过大可能损伤神经元胞体，而吸力不足则可能导致轴突切断不完全。值得注意的是，常规装置和大规模装置均采用相同的制备流程，主要区别在于模具设计以及固化后打孔的位置和直径。对于常规微流控装置，通孔直径为5 mm；而对于大规模微流控装置，通孔直径为3 mm。另一个关键的操作细节是在轴突切...

神经元在发育过程中通过极化形成两种具有特殊功能的突起：轴突和树突1,2。神经再生是指神经损伤后轴突重新生长的过程3，其研究重点在于中枢神经系统（CNS）的修复。与周围神经系统不同，中枢神经系统再生能力有限4,5,6，常导致脊髓损伤或创伤性脑损伤患者出现持续性功能障碍或永久性残疾7,8。因此，开发促进中枢神经系统修复的策略，并阐明轴突再生的潜在机制至关重要。
微流控装置，作为集成化、低成本且高通量的 体外 培养系统，近年来在细胞与神经元研究中展现出显著优势9,10与传统方法相比，微流控技术能够精确调控流体剪切应力、浓度梯度和空间结构，从而更真实地模拟生理和病理微环境，促进细胞的生长、迁移、分化及相互作用11,12,13,14基于微流控技术的 体外 轴突损伤模型通过空间极化实现神经元胞体与突起的区室化培养，为研究神经元的内在再生能力及其损伤后的代谢适应提供了不可或缺的工具15,16,17,18为研究神经元如何响应损伤、调控代谢过程提供了关键窗口19并促进轴突再生20然而，现有的用于轴突损伤和代谢研究的微流控平台仍面临诸多挑战，包括神经元细胞得率低、代谢测量准确性下降，以及缺乏标准化的操作流程。
针对这些局限性，本研究开发了一种新型的大规模微流控平台，可实现标准化、高通量的轴突损伤诱导，并提供足够的细胞材料用于分区化的多组学分析。该集成化设计直接应对了神经损伤研究中长期未满足的关键需求。具体而言，我们设计的微流控芯片采用胞体室与轴突室交替排列的结构，通过微沟道相互连接，并利用可控的真空抽吸实现轴突切断。该方法特别适用于需要可重复、高通量轴突损伤模型及精确代谢谱分析的研究，例如探究轴突再生过程中潜在的代谢机制。与传统方法相比，该技术具有更高的通量、更精确的代谢分析能力，以及建立标准化损伤模型的优势。例如，先前的研究已证实线粒体运输在轴突再生中的重要作用20,21,22,23，而我们的平台进一步揭示了损伤后葡萄糖代谢在轴突再生中的作用。本实验方案建立了一个兼具可视化验证与操作标准化的大规模轴突切断与代谢分析技术体系。

<table><tbody><tr><td>Neurobasal-A 培养基</td><td>Gibco</td><td>10888022</td><td>培养基</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠</td><td>Invitrogen</td><td>A-21042</td><td>免疫荧光</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>上海舜宇恒平科学仪器有限公司</td><td>FA1004</td><td>试剂/样品的精确称量</td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>培养基</td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Boster</td><td>AR1189</td><td>蛋白质浓度测定</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Genview</td><td>FA016</td><td>免疫荧光</td></tr><tr><td>离心搅拌脱气混合器</td><td>THINK</td><td>ARE-310</td><td>混合 PDMS 并进行脱气</td></tr><tr><td>CLARIOstarPlus-ACU 分析仪</td><td>BMG LABTECH</td><td>CLARIOstar Plus</td><td>蛋白质浓度测定</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技（阿什维尔）有限责任公司</td><td>3111</td><td>细胞培养，37 &amp;deg;C，5% CO?</td></tr><tr><td>耐腐蚀隔膜真空泵</td><td>上海力辰邦西仪器科技有限公司</td><td>LC-85DLC</td><td>吸除废液及为轴突切断提供负压</td></tr><tr><td>D-葡萄糖 (U-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;, 99%)</td><td>剑桥同位素实验室</td><td>CLM-1396</td><td>代谢通量分析</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>神经元培养</td></tr><tr><td>Dr.TOM2 平台&amp;nbsp;</td><td>BGI Genomics</td><td></td><td>执行并分析 RNA-seq&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>电热鼓风干燥箱</td><td>BIOM 华宏邦恩 / 华英博思</td><td>DHG-9070A</td><td>PDMS 固化</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>上海华超工贸有限公司</td><td>HC313</td><td>常规物料称量</td></tr><tr><td>Fluoromount 水性封片剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td>免疫荧光</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>培养基</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Solarbio</td><td>G8200</td><td>免疫荧光</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>神经元培养</td></tr><tr><td>HBSS，无钙、无镁</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>神经元培养</td></tr><tr><td>高压蒸汽灭菌器</td><td>斯泰克仪器（上海）有限公司</td><td>HMJ-54A</td><td>实验器材和培养基的灭菌</td></tr><tr><td>低氧培养舱</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27310</td><td>低氧处理</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>用于显微图像分析</td></tr><tr><td>Leica 显微镜</td><td>徕卡显微系统 CMS 股份有限公司</td><td>DMIL LED Fluo</td><td>活细胞及荧光观察</td></tr><tr><td>活细胞成像溶液</td><td>Invitrogen</td><td>A14291DJ</td><td>活细胞成像</td></tr><tr><td>医用低温储存箱 (-80 &amp;deg;C)</td><td>青岛海尔生物医疗股份有限公司</td><td>DW-86L388J</td><td>在 -80 &amp;deg;C 长期保存样品</td></tr><tr><td>迷你台式真空泵</td><td>海门麒麟贝尔仪器制造有限公司</td><td>GL-805</td><td>小规模真空应用</td></tr><tr><td>MitoTracker Orange CMTMRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7510</td><td>线粒体膜电位染色</td></tr><tr><td>MRMPROBS 程序</td><td></td><td>Version 2.60</td><td>用于提取原始质谱数据&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>培养基</td></tr><tr><td>无葡萄糖 Neurobasal-A 培养基</td><td>Gibco</td><td>A2477501</td><td>培养基</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington</td><td>LS003127</td><td>神经元培养</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>细胞固定</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>DC184</td><td>器件制备</td></tr><tr><td>PDS 试剂盒抑制剂瓶</td><td>Worthington</td><td>LK003182</td><td>神经元培养</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>培养基</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td>稀释物质及清洗细胞容器</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>ODC-32G-2</td><td>表面活化</td></tr><tr><td>多聚赖氨酸（Poly-D-lysine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>神经元培养</td></tr><tr><td>Prism&amp;nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>Version 8.4.3</td><td>统计分析</td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Eppendorf AG（德国）</td><td>5430R</td><td>在控温条件下进行样品分离</td></tr><tr><td>RNArep Pure 细胞/细菌总 RNA 提取试剂盒</td><td>天根</td><td>dp430</td><td>转录组学</td></tr><tr><td>转子流量计</td><td>Dwyer</td><td>RMA-23-SSV</td><td>控制低氧气体流速</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>奥林巴斯公司</td><td>SZ2-ILST</td><td>样品观察与解剖</td></tr><tr><td>Stuart 轨道摇床</td><td>Kylin-Bell</td><td>TS-200</td><td>以可调速度混合细胞培养物/溶液</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>免疫荧光</td></tr><tr><td>ULVAC 旋片式真空泵</td><td>ULVAC（宁波）有限公司</td><td>GLD-N202</td><td>为过滤/干燥提供真空环境</td></tr><tr><td>&amp;beta;III-微管蛋白</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td>免疫荧光</td></tr></tbody></table>

用于构建轴突损伤模型并实现多组学分析的微流控芯片

Microfluidic Chip for Axonal Injury Models Construction and Enabling Multi-Omics Analysis

神经元通过极化形成树突和轴突，从而实现细胞间通讯。轴突损伤会破坏这些连接，并将损伤信号传递至胞体，常导致神经元变性。因此，维持轴突稳态对于促进局部轴突再生及防止神经变性至关重要。该过程依赖细胞代谢提供能量和生物合成前体，并由调节代谢平衡及清除代谢副产物的机制维持。然而，神经元代谢在胞体与轴突之间具有区室化特征，且进一步受到其他因素影响 在体内 由周围微环境因素所影响，例如星形胶质细胞来源的代谢活动（如星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭）。这些因素使得神经元内在代谢机制的研究变得复杂。为应对这些挑战，本文建立了一种用于培养原代皮层神经元的微流控平台 体外 保留所观察到的关键代谢特征 体内，包括生理性糖酵解通量和线粒体呼吸。该系统为研究轴突损伤后神经元内在的代谢重塑提供了一个简化的模型。传统的微流控芯片支持 体外 轴突损伤模型，且兼容活细胞成像、免疫荧光染色和缺氧处理。为满足涉及数百万细胞的大规模转录组学和代谢组学分析需求，我们进一步设计并制备了高通量微流控芯片，并优化了操作流程。该装置具有交替排列的胞体室和轴突室，二者通过微通道连接，轴突损伤通过抽吸轴突室内的液体产生负压实现。该平台可快速评估代谢物和酶的动力学变化，提升多组学研究的准确性和可重复性。

为了建立一个用于研究皮层神经元代谢调控机制的综合性研究平台，我们首先在传统的微流控装置中培养皮层神经元，精确控制轴突沿微通道生长（图2A）。通过合理的设计，微通道具有较低的高度（5 µm）和较大的宽度（10 µm），使得每个通道能够容纳更多的轴突，同时阻止细胞体进入。βIII-微管蛋白的免疫荧光染色证实了轴突通过微通道生长至轴突终末室（图2B）。为进一步确定轴突损伤是否影响神经元存活，我们定量分析了轴突损伤前后神经元的密度。结果显示，轴突损伤后神经元密度无显著差异，表明轴突损伤未导致明显的神经元死亡（图2C）。为满足多组学分析所需的样本量（通常每样本约3 × 106个细胞），我们开发了一种具有可扩展布局和三维结构的大规模微流控装置，以确保实验数据的准确性（图3A–C...

本方案描述了一种用于模拟轴突损伤后神经元代谢动态的微流控系统，可实现成像、多组学分析以及内在代谢重塑的机制研究。

神经元通过极化形成树突和轴突，从而实现细胞间通讯。轴突损伤会破坏这些连接并传递损伤信号……

我们开发了大规模微流控芯片，以实现多组学分析，旨在阐明轴突损伤后神经元的代谢机制。我们主要利用微流控技术、代谢通量分析和转录组学，推动神经元在轴突损伤与再生过程中的代谢机制研究。我们发现，不同发育阶段的皮层神经元存在代谢差异，且年轻神经元在外伤后会发生代谢重塑。本方案的核心优势在于其大规模微流控平台的设计与操作标准，能够实现对数百万个细胞进行精确的多组学分析及细胞尺寸测量。首先，将PDMS基质与固化剂转移至离心管中。随后，将装有混合物的离心管放入离心搅拌混合器中。以 2,000 G 离心 4 分钟，重复两次，以混合并脱气。将 13 至 15 克脱气后的 PDMS 倒入微流控模具中，确保模具底部完全覆盖。随后，将模具放入真空干燥器中，使用真空泵抽真空 5 至 10 分钟，彻底去除 PDMS 中的气泡。使用橡胶球轻轻敲击PDMS表面，以消除残留的表面气泡。将模具转移至对流烘箱中，在80摄氏度下烘烤100分钟，以固化聚二甲基硅氧烷。待PDMS完全固化后，将手术刀刀尖轻轻插入PDMS边缘下方，小心抬起并将其从模具上分离。使用直径为 2.0 至 2.5 毫米的活检打孔器，在 PDMS 上打孔，用于培养基灌注和细胞加载。用胶带去除 PDMS 表面的任何杂质，然后将其放入洁净的玻璃培养皿中，并用铝箔包裹以储存。实验前，将微流控装置在 121 摄氏度和 101 千帕条件下高压灭菌 5 分钟，以确保无菌。将适用于传统微流控装置的盖玻片放入35毫米的培养皿中。向培养皿中加入2毫升浓度为0.1毫克/毫升的聚-D-赖氨酸溶液。在37摄氏度下孵育培养皿6小时或过夜。孵育后，小心取出聚-D-赖氨酸溶液，以备重复使用或进行妥善处理。随后，向培养皿中加入 2 mL 无菌超纯水，顺时针旋转 50 次，再逆时针旋转 50 次。使用连接无菌移液器吸头的真空泵吸取液体，并将废液收集至液体废液容器中。所有洗涤步骤完成后，将盖玻片置于生物安全柜中自然晾干后再使用。用无菌细尖镊子将经高压灭菌的微流控芯片放置在玻璃表面中央，微通道面朝下。使用200微升移液枪头轻轻按压芯片，使其完全贴附于玻璃表面。接着，用永久性记号笔在左侧腔室上标记一个点，以标识胞体区。用10微升移液枪吸取10微升神经元悬液，然后缓慢将悬液加入已标记的胞体区上方的加样孔中。确认液体正确流入左侧室的下部储液区。将培养皿转移至设定为37摄氏度和5%二氧化碳的加湿培养箱中孵育20分钟。孵育后，将培养皿置于20倍显微镜下，通过微通道确认培养基从胞体区充分流入轴突区。现在，用移液器将150微升神经元基础培养基加入轴突室的上端口。同样，将150微升完全神经元培养基加入胞体室的上端口。接下来，将20毫升超纯水倒入150毫米的培养皿中，以创建一个湿度 chamber。将35毫米培养皿放入大培养皿内，然后将整个培养系统转移至培养箱中，并维持所需的时间。使用直径10厘米的培养皿放置大规模微流控装置。根据实验需求选择全通道或间隔通道接种方式，因为每种方法需要不同的轴突损伤实验方案。接种完成后，向培养皿中加入 5 毫升完全神经元培养基，以维持神经元生长。将适量神经元基础培养基转移至新的 15 毫升离心管中，备用。将含有皮层神经元的微流控装置置于洁净台中。 使用无绒纸擦干 35 毫米培养皿的底部，然后用 200 微升移液器吸取微流控装置右侧两个孔中的培养基。接着，将真空泵管路连接至一个无菌、无滤膜的 200 微升移液器吸头。打开真空泵，设置抽吸速率为 60 升每分钟，将吸头对准轴突末端室下方孔与腔室之间的连接处，以吸取旧培养基，利用负压导致轴突断裂。更换移液枪头，吸取 150 微升神经元基础培养基，通过右侧腔室的下孔缓慢加入。完成加样和抽吸操作四次后，更换为新鲜的完全神经元培养基，然后从胞体侧孔中抽吸旧培养基，根据需要加入含有药物的新鲜完全神经元培养基。将微流控装置与培养皿一同放入 150 毫米的培养皿中，继续培养所需时间，例如 24 小时。进行手动轴突损伤时，将神经元接种至大规模微流控装置的所有腔室中。将装置置于含5%二氧化碳的湿润化培养箱中，37摄氏度孵育三天。体外培养第七天，从培养箱中取出含有微流控装置的培养皿，放置于无菌载台之上。使用20倍放大倍数的显微镜，并用75%乙醇对工作区域进行消毒。手持10微升无菌滤芯吸头，在显微镜引导下识别原始微通道中的轴突束。利用吸头沿每束轴突进行纵向划痕。在显微镜下实时观察轴突断裂情况。标准微流控装置中的微通道允许轴突生长，但不允许胞体通过，这一点已通过体外培养7天后的βIII微管蛋白染色结果证实。轴突损伤后，神经元密度未显示显著差异，表明未观察到明显的神经元死亡。开发了一种具有三维可扩展设计的大规模微流控装置，用于多组学分析。未打孔和已打孔的PDMS复制品均能牢固地粘附在10厘米培养皿或PC板上。通过移液枪头刮擦诱导的轴突损伤导致轴突明显断裂且形态破坏，与损伤前完整的轴突形成对比。在损伤后6小时和24小时均观察到轴突再生，而未损伤的轴突保持稳定。神经元蛋白浓度从基线水平的1420.4微克/毫升显著上升至损伤后6小时的1748.9微克/毫升，以及损伤后24小时的1823.7微克/毫升。对照组与轴突损伤组的RNA得率几乎相同。RNA测序鉴定出595个损伤特异性基因和609个对照特异性基因，两组间共有17,471个共享基因。KEGG通路分析显示，损伤后氧化磷酸化、活性氧应答、自噬以及三羧酸循环通路显著上调。

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用于轴突损伤模型的微流控芯片构建和实现多组学分析

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学习利用大规模微流控芯片技术结合代谢通量分析与转录组学，研究轴突损伤后神经元的代谢重塑机制。该方法可揭示年轻神经元的代谢动态变化，为神经再生研究提供多组学数据支持。

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