评估SHIP缺陷型小鼠克罗恩病样回肠炎及纤维化模型中的治疗干预

我们使用 SHIP 缺陷型小鼠研究克罗恩病中肠道炎症和纤维化的发生机制，并评估治疗克罗恩病的新药或治疗策略。因此，我们已在临床前研究中利用该模型证明了糖原 IBD 药物在靶向递送方面的有效性。本方案采用 SHIP 缺陷型小鼠，此类小鼠可自然发生回肠炎症和纤维化，相较于传统的化学诱导或损伤模型，具有更高的生理相关性。

我们的研究结果确立了 SHIP 缺陷型小鼠作为回肠炎症和纤维化的可靠模型，可用于克罗恩病的机制研究及治疗方案的临床前测试。实验开始前，先将小鼠禁食四小时。将 4 千道尔顿的 FITC-葡聚糖溶于无菌 PBS 中，配制成终浓度为 80 毫克/毫升的溶液。

接下来，轻轻固定每只小鼠，通过口服灌胃给予 150 微升 FITC-葡聚糖溶液，灌胃后继续禁食 4 小时。处死小鼠后，使用 25 号针头和 1 毫升注射器进行心脏穿刺以采集血液。立即向每 100 微升采集的血液中加入 10 微升酸-柠檬酸-右旋糖溶液作为抗凝剂。

通过反复倒置离心管数次，充分混匀。在4°C条件下，以1,500 G离心收集的血液样本10分钟。小心将血浆转移至已标记的1.7毫升微量离心管中。

所有样品在分析前均需置于冰上并避光保存。现在，使用 PBS 将每份血浆样品按 1:2 和 1:10 的比例进行稀释。将每种血浆稀释液各 100 微升加入不透光的 96 孔板中，每样重复加两孔。

用PBS对原始浓度为80毫克/毫升的FITC-葡聚糖储备液进行一至两次连续稀释，以制备不同浓度的溶液。将每种稀释液各100微升加入96孔板的复孔中。然后，使用酶标仪在激发波长485纳米、发射波长535纳米的条件下测定荧光。

进行 FITC-葡聚糖实验时，在采集血液后，小心地从小鼠体内完整切除小肠。轻柔地去除肠道上附着的脂肪和结缔组织。将清理后的小肠平铺在一张空白白纸上，以增强视觉对比度。

肉眼观察组织是否存在任何宏观病变迹象，特别注意SHIP基因敲除小鼠远端10厘米处，该区域常出现炎症。将肠道与尺子并列放置以提供尺寸参照，并对整个标本进行拍照，记录任何大体病理学发现。使用注射器以PBS轻柔冲洗肠腔，清除肠内容物，注意避免用力过大，以防绒毛和隐窝结构发生变形。

选取远端回肠中最具代表性的大体病理学区域，切取约一厘米长的组织。将切除的组织平铺于组织学包埋盒中，并用两块海绵夹住，以防止固定过程中发生折叠。用于苏木精-伊红染色和马松三色染色时，将组织置于10%中性缓冲福尔马林中固定，固定液体积为组织体积的10至20倍，在4°C下固定过夜。

固定后，将包埋盒转移至70%乙醇中保存，并确保在处理前组织始终完全浸没。对于阿利新蓝和过碘酸-希夫染色，需在4摄氏度下用卡诺氏液固定组织过夜。固定后，将包埋盒转移至100%乙醇中保存，直至进行后续处理。

然后，将固定的组织包埋于石蜡中，并切成5 µm厚的切片，用于后续染色。根据既定的组织病理学标准，采用16分制对苏木精-伊红染色的回肠切片进行评分。依据预设标准，采用6分制对马松三色染色的横切面进行评估。

将两名对实验条件设盲的独立评审人所给出的评分取中位数，计算最终的纤维化评分。在解剖并取下组织学样本后，收集回肠远端剩余的10厘米部分。用纸巾或无绒擦拭布将收集的组织吸干，然后使用校准过的天平记录组织重量。

在液氮中快速冷冻组织，然后于零下80摄氏度保存，以备后续处理。准备处理时，取出冷冻组织，并始终在冰上操作。随后再次称量组织样品，以确认质量准确。

通过向 PBS 中加入蛋白酶抑制剂来制备匀浆缓冲液。每毫克组织使用 10 微升缓冲液。使用台式匀浆器，在冰冻的匀浆缓冲液中对全层回肠组织进行匀浆处理。

继续操作直至匀浆均匀且无可见组织碎片。在不同样品之间，用PBS彻底冲洗匀浆器探头，以防止交叉污染。将组织匀浆在4°C条件下以10,000 G离心10分钟。

将澄清的上清液分装成小体积，以避免反复冻融，随后于-80摄氏度保存，用于后续分析。组织学分析显示，与SHIP对照小鼠相比，SHIP缺陷型小鼠的肠道损伤显著加重。地塞米松治疗可减轻SHIP缺陷型小鼠的组织学损伤，但差异未达到统计学显著性。

Masson 三色染色显示，与 SHIP 对照小鼠相比，SHIP 缺陷型小鼠的胶原沉积显著增加，提示纤维化评分更高。地塞米松治疗显著减轻了 SHIP 缺陷型小鼠的纤维化程度，使评分接近 SHIP 阳性对照组。阿利新蓝与 PAS 染色证实 SHIP 缺陷型小鼠存在杯状细胞增生，而地塞米松治疗后该现象明显减轻。

与SHIP对照组小鼠相比，SHIP缺陷型小鼠的IL-1β浓度显著升高。地塞米松显著降低了SHIP缺陷型小鼠的IL-1β浓度。与SHIP对照组相比，SHIP缺陷型小鼠的MPO浓度显著升高，地塞米松可降低该升高程度，但未达到统计学显著性。

SHIP缺陷型小鼠中LCN-2浓度也升高，但地塞米松未能持续降低其高水平。IL-1β浓度与组织学损伤评分和纤维化评分呈正相关，表明炎症与组织损伤之间存在关联。组织学损伤评分与纤维化评分呈正相关，提示组织损伤与纤维化重塑同步进展。