Name: 用于体内双光子显微镜的微血管栓塞小鼠模型，使用荧光聚苯乙烯微球 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学习建立小鼠微血管栓塞模型，利用荧光聚苯乙烯微球和双光子显微镜进行实时活体成像，研究毛细血管堵塞对脑血流和血脑屏障的影响机制。该方法有助于深入理解微血管闭塞引起的组织损伤，为开发新的治疗策略提供重要依据。

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作者谨向 Iwan Dobbe 博士致以诚挚感谢，感谢他开发了用于原位三维图像重建的 Articulus 软件。我们还感谢 Nikolaus&#160;Plesnila 教授慷慨提供用于本单位繁育的 TIE2-GFP 小鼠（Jackson 实验室，货号 003658）。
本研究由阿姆斯特丹神经科学研究所（项目编号：813294，资助对象：I.M.）、阿姆斯特丹心血管科学研究所（2021年和2023年设备资助项目，资助对象：I.M.）以及荷兰心脏基金会（项目编号：03-006-2021-T019，资助对象：I.M.）提供资金支持。&#160;
本研究还由荷兰心脏基金会和荷兰脑基金会资助，并与荷兰心血管联盟合作开展，项目编号为01-002-2022-0126 CONTRAST 2.0。此外，部分研究经费来自Stryker、Medtronic和Penumbra的无限制资助。资助方未参与研究设计、监测、数据收集、统计分析、结果解释或论文撰写。

作者声明无利益冲突。

为模拟微血管栓塞，已描述了一种将微球注入小鼠脑循环的方案，该方案可用于研究微栓塞 体内 双光子显微镜技术。该方法优化了微球在脑内的截留，使多个微球被截留在同侧皮层前500 µm范围内，从而实现有效的双光子成像。
脑皮质区域中微球的高数量对于体内双光子成像至关重要。在制备微球混合液过程中，通过使用5% BSA或0.1% Tween20包被移液器吸头，可最大限度减少微球的损失，从而降低微球的黏附性（见补充文件1）。尽管无法定量黏附在吸头上的微球确切数量，但平均强度测量结果反映了包被处理的效果。此外，Tween20似乎还能防止微球在导管内聚集，导致通过导管流动的单个微球数量在视觉上更高，尽管该现象尚未被量化。这降低了大血管阻塞以及形成大面积缺血和缺氧区域的风险，而后者在模拟微血管栓塞的研究目标下是不可取的。此外，当注射含有低浓度Tween20的微球混合液时，小鼠体重下降较少，并能更快恢复至术前体重。Tween20是一种常用的分散剂45,46,47，因此本研究中使用的低浓度预计不会引起任何毒性或对血脑屏障（BBB）完整性产生不良影响。此外，我们的数据显示，BBB渗漏仅发生在微球嵌顿部位附近（或微球通过之后），并非系统性发生，且未引起白细胞总覆盖面积的显著增加（见补充文件2），这支持了使用0.1% Tween20的合理性。总体而言，添加Tween20有助于减少微球聚集，并提高微球向脑循环系统的输送效率，这一点已通过脑组织切片中的微球计数得到证实，最终使双光子显微镜下可观察到足够数量的微球。尽管使用Tween20可增加滞留在脑内的微球数量，但微球注射的变异性仍然存在。多种因素可能导致这种变异：第一，导管或血管内血栓形成可导致微球黏附于血凝块上；第二，气泡的存在可能干扰微球的平稳输送；第三，颈总动脉（CCA）或颈内动脉（ICA）血流恢复不完全可能改变血流动力学，从而促进微球黏附于血管壁或在管腔内聚集。遗憾的是，这些异常情况在注射过程中无法被及时察觉。
聚苯乙烯微球的密度大于水，因此当微球混合物被装入导管后会导致分布不均。大多数微球会沉降在导管壁附近，此处流体摩擦力使其移动速度慢于中央较快的流速。最终导致微球在导管末端最后20 µL的区域内积聚。应避免注射这一浓缩部分，因为它可能引起较大的栓塞和缺血事件。为防止这种情况，微球混合物的制备体积应为预定注射体积的两倍。
微血管栓塞手术需要大量的训练和极高的精确度。其中技术上最具挑战性的步骤之一，是在后交通动脉（PPA）、眼动脉（OA）以及颈内动脉（ICA）的侧支周围放置缝线，以确保微球混合物能够准确输送至威尔氏环（circle of Willis）及大脑中动脉（MCA）供血区域。由于迷走神经紧邻颈总动脉（CCA），且血管直径细小、手术操作空间有限，使得在不造成神经损伤或血管损伤的情况下准确放置缝线变得尤为困难。
尽管可以考虑使用血管夹作为暂时结扎后壁动脉（PPA）的替代方法，但其会引入额外风险。血管夹可能意外脱落，导致血管重新开放。此外，在颈内动脉（ICA）已有一个夹子的情况下，若在PPA处使用第二个夹子，由于空间有限，会增加ICA夹子脱落的可能性。一旦发生这种情况，将引起严重出血，若不立即干预，可能导致实验提前终止。因此，不建议使用血管夹闭合PPA。
本方案采用导管而非注射器33进行微球注射。该方法可更精确地控制注射速度和注射体积，并支持更远距离的微球注射（例如，在显微镜或磁共振成像仪等成像设备内操作时）。
选择ECA而非CCA作为入路点，可使CCA在注射过程中保持完全开放，从而有助于在整个手术过程中维持更接近生理状态的脑灌注。此外，注射微球 通过 与CCA相比，ECA具有其他优势48：i）再灌注期间总操作时间缩短；ii）注射过程中及手术结束后出血风险降低；iii）采用颈总动脉入口法时，拔针后颈总动脉处易形成不稳定的狭窄和血栓49这将导致血流紊乱，并增加微血栓形成的风险，微血栓可能最终进入大脑。此外，进入 通过 CCA将存在永久性闭塞CCA的较大风险，可能导致术后存活期间脑部再灌注不充分，而小鼠Willis环的个体差异较大，会进一步加重这一问题50,51
尽管该方案已得到充分优化，但仍存在一些局限性。首先，观察发现微球在注射过程中沿导管壁移动较慢且分布不均匀，提示进入颈内动脉（ICA）的微球数量可能低于预期。尽管使用了Tween-20以减少黏附，部分微球仍会黏附在移液器吸头、Eppendorf管和导管上。因此，实际注入的微球数量可能低于计算值7.2 x 104&#160;每只小鼠的微球数量。尽管如此，仍有足够数量的微球到达脑部循环，可用于成像 通过 双光子显微镜。注射方案和混合液成分已针对10 µm聚苯乙烯微球进行优化。如果所使用的材料（如吸头、管路、导管）或微球尺寸发生改变，应对溶液配方和注射程序相应地重新评估。其次，针对大血管闭塞最佳方法的研究 通过 大脑中动脉管腔内阻塞研究表明，血管系统的进入 通过 永久性结扎颈外动脉（ECA）会导致咀嚼和吞咽肌缺血52这可能导致小鼠进食量减少，从而引起过度体重下降、运动功能受损以及神经功能缺损加重。然而，这一说法已被其他研究者所质疑。48在本研究中，体重监测显示手术后体重出现预期的下降，但在数天内迅速恢复至术前水平，表明小鼠在永久性颈外动脉结扎后能够恢复并正常进食和饮水。尽管对动物体重进行了监测，但这仅是动物健康状况的间接指标，无法完全排除局部咀嚼功能或运动功能障碍等潜在功能损伤。本研究未进行功能恢复的直接评估，这是本研究的一项局限性。另一项研究比较了血管系统入口处 通过 CCA 或 ECA 并表明其进入 通过 CCA 可能导致脑循环再灌注受损，因此得出结论：应优先采用 ECA 进入法53第三，正确且安全地放置导管，避免引入气泡、血凝块或发生泄漏，同时确保颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）血流不受阻塞，需要大量练习才能掌握。最后，与其他微栓塞方法（如通过玫瑰红染料注射进行的光化学血栓法）相比22因此，无法预测微球最终将在循环系统中的何处滞留。
本研究未特意设置阴性（假手术）或阳性（光化学血栓）对照组，因为这些对照组对于主要研究目标并无额外价值。该模型成功的标准是滞留在脑微循环内（尤其是颅窗区域）的微球数量，以实现高分辨率成像 体内 显微镜检查。根据定义，假手术组在目标区域不会产生微球，因此无法提供相关的比较依据 体内 成像终点。类似地，纳入光化学血栓模型将涉及一种根本不同的病理生理机制，因此超出了本研究的范围，因为本研究的重点是表征微血管栓塞模型，而非比较不同方法学。本研究未进一步开展针对栓塞及其对血脑屏障或局部神经组织潜在影响的更广泛组织学分析，因为实验设计优先考虑 体内 组织水平验证与三维可视化。
颅窗制备和微血管栓塞模型的详细手术方案，可支持对微血管栓塞相关的微血管改变以及同侧半球静默性脑梗死发生情况进行可靠且可重复的研究。优化的微球混合物制备与注射方法进一步提高了该实验方法的一致性和有效性。

由于大脑主要动脉栓塞所致的缺血性卒中是一种急性且常具破坏性的事件1。栓子也可能出现在更远端的血管中。因此，可能发生静止性脑梗死（SBIs）；顾名思义，这些梗死无症状，通常在因其他原因进行影像学检查时偶然发现2,3。SBIs较为常见，在老年人尸检中属于最常观察到的脑血管病变之一4,5。流行病学研究显示，在无卒中病史的人群中，其患病率为20%。SBIs可导致认知功能障碍和痴呆，增加总体死亡率，并是未来发生卒中的危险因素6,7,8。这些梗死灶直径通常仅数毫米，与直径约为100 µm的穿支动脉闭塞相关。这些穿支动脉进一步形成广泛的微动脉和毛细血管床。微小血栓若通过穿支动脉并嵌顿于下游微循环中，通常在血管造影上难以被检测到9。然而，在心房颤动、动脉粥样硬化斑块以及其他来源情况下，可能释放大量微血栓10,11,12,13,14。除微血栓外，其他微粒（MPs），包括脂肪颗粒、细胞聚集体，甚至微塑料，也可能引起微血管栓塞。多项研究显示，血液和大脑中存在直径超过5 µm毛细血管管径的塑料微粒15,16。
与急性卒中和脑微出血相比，微血管闭塞的研究仍相对不足。目前对微血管闭塞的事件发生率、长期后果以及可能的清除机制了解甚少。然而，随着机械取栓在卒中治疗中的成功临床应用，人们对微血管闭塞的兴趣正在迅速增加；在大血管成功再通后，微血管栓塞可能导致微循环再灌注受损17。此外，关于微塑料的研究也急剧增多，其部分效应可能正是通过微血管栓塞介导的18,19,20。
通过颅窗结合多光子显微镜等技术，可对小鼠大脑皮层的微血管阻塞进行研究。目前研究脑微血管阻塞最常用的模型包括光化学血栓模型和微球模型。光化学血栓模型利用光敏染料，通过光激活在特定血管（通常为非毛细血管）中诱导血栓形成。via然而，由于纤溶系统被激活并溶解血栓，该模型无法用于长期观察血栓的演变过程21,22。此外，光敏染料的激活会产生单线态氧，导致内皮细胞和血脑屏障（BBB）损伤23。因此，在研究脑血栓过程中内皮细胞和血脑屏障功能，以及对脑循环和脑功能的长期影响时，更倾向于采用微球模型。微球注射模型通过将微球注入脑循环，实现对脑微血管系统的阻塞9,24,25,26,27,28,29,30。该模型的潜在缺点在于无法预先确定血栓形成的位置，这与光化学血栓法不同31,32。其优势在于可使用直径明确的微球进行注射，从而特异性地阻塞特定直径的（微）血管33,34,35。
多年来，已开发出多种将微球注入啮齿类动物脑循环的方法。这些方案在进入颈动脉三角区域方面达成共识，该区域由颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）组成，是进行动脉内微球注射的通路。不同方案在动脉内微球注射的具体操作上存在若干差异。首先，研究中使用的注射装置包括注射器9,26,27,29,33,34或导管25,28,30,36。其次，注射微球的数量和尺寸存在较大差异。微球直径通常在10至50 µm之间，具体选择取决于靶血管的大小。一般而言，微球越大，注射数量应越少，因为小动脉的数量少于毛细血管25,26,30。
实现稳定的动脉内微球注射仍具挑战性。在实际操作中，尽管注入了大量微球，但仅有部分微球能够到达脑循环。这对于研究滞留微球所产生效应尤为困难 体内 双光子显微成像技术的成功依赖于在制备好的颅窗视野内，小鼠皮层外层存在微球。选择合适的微球荧光染料至关重要，因为微球的强荧光以及发射光谱的重叠问题，可能在与转基因小鼠模型和血管内染色联合使用时带来挑战。
微血管阻塞在啮齿类动物模型中进行研究，此前已证明多个微球具有协同作用 离体 啮齿类动物大脑9，以及这些颗粒明显的外渗现象，该过程称为血管吞噬作用（angiophagy）33,35,37,38. 以使其能够 体内 研究开发了用于安装颅窗小鼠的多光子显微镜技术。本研究的目的是建立并报告一种优化的小鼠动脉内微球注射详细实验方案，以更好地研究微球对脑组织的影响及其在体内的去向。该方案的主要优势在于提高了递送效率，减少微球损失，并增加微球出现在颅窗成像区域内大脑中动脉（MCA）供血区的概率。该优化的微球注射方案通过以下方法进行评估 体内 双光子显微镜与死后检查 原位 专用成像冷冻切片机的三维成像39.

<table><tbody><tr><td>27号针头（0.1×16 mm）</td><td>Terumo</td><td>-</td><td>27号针头（步骤2.1.2）</td></tr><tr><td>Articulus 软件</td><td>-</td><td>-</td><td>3D分析软件（步骤4.2.2） &amp;& 4.3.3)</td></tr><tr><td>聚维酮碘 30 ml（100 mg/ml）</td><td>Mylan</td><td>8712207037612</td><td>聚维酮碘/碘（步骤 1.1.8） &amp;& 2.2.10.)</td></tr><tr><td>C&amp;amp;B 单体</td><td>Sun Medical</td><td>7111</td><td>超级胶水的组分（步骤 1.3.1）</td></tr><tr><td>碳素钢手术刀片（编号15）</td><td>Swann-Morton</td><td>205</td><td>用于刮擦颅骨的刀片（步骤 1.2.4）</td></tr><tr><td>卡洛芬（50 mg/ml）</td><td>硕腾</td><td>-</td><td>镇痛药物（步骤 1.1、1.6、2.2） &amp;& 2.8)</td></tr><tr><td>催化剂</td><td>Sun Medical</td><td>7110</td><td>超级胶水的组分（步骤 1.3.1.）</td></tr><tr><td>导管（内径 0.31，外径 0.64 mm）</td><td>Freudenberg</td><td>228-0661</td><td>透明导管（步骤 2.1.1.）</td></tr><tr><td>定制组织钩</td><td>-</td><td>-</td><td>组织钩（步骤 2.3.4.）</td></tr><tr><td>棉签</td><td>-</td><td>-</td><td>棉签（步骤 1.1.8，1.2.4） &amp;& 1.5.1.)</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0724</td><td>颅窗盖玻片（步骤 1.4.2.）</td></tr><tr><td>定制小鼠头部固定杆</td><td>-</td><td>-</td><td>用于成像固定装置的头杆（步骤 1.3.2）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>定制小鼠成像固定装置&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>小鼠成像固定装置（步骤 1.4.1. &amp;& 3.1.1.)</td></tr><tr><td>定制立体定位仪框架</td><td>-</td><td>-</td><td>立体定向框架（步骤 1.1.7.）</td></tr><tr><td>牙骨质液</td><td>Kulzer</td><td>64707937</td><td>牙科水泥组分（步骤 1.3.3.）</td></tr><tr><td>牙科粘固粉粉末</td><td>Kulzer</td><td>64707945</td><td>牙科水泥组分（步骤 1.3.3.）</td></tr><tr><td>牙科钻头&amp;nbsp;</td><td>Saeshin</td><td>&amp;nbsp;L-206</td><td>钻孔（步骤 1.4.3.）</td></tr><tr><td>地塞米松（4 mg/ml）</td><td>Centrafarm</td><td>-</td><td>术前用药（步骤1.1.4）</td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>Braun-Aesculap</td><td>BD023R</td><td>镊子（步骤 1.2.2. &amp;& 2.3.2.)</td></tr><tr><td>钻头 PK/100,5（0.5 mm）</td><td>精细科学</td><td>19007-05</td><td>钻头（步骤 1.4.3.）</td></tr><tr><td>Duratears（3.5 克）</td><td>爱尔康</td><td>-</td><td>眼膏（步骤 1.1.8） &amp;& 2.2.7.)</td></tr><tr><td>环氧树脂胶（1g）</td><td>Pattex</td><td>9H PSMG3X</td><td>环氧胶（步骤 1.5.2. &amp;& 2.1.1.)</td></tr><tr><td>精细微型镊子 直头</td><td>精细科学工具</td><td>Dumont #5</td><td>精细微型镊子（步骤 2.6.6.）</td></tr><tr><td>FITC-葡聚糖（70 KDa）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70S</td><td>FITC-葡聚糖溶液（步骤 2.5.2.）</td></tr><tr><td>异氟烷（1000 mg/g）</td><td>Laboratorios Karizoo S.A.</td><td>118938</td><td>麻醉（步骤 1.1.6） &amp;& 2.2.5.)</td></tr><tr><td>大型三维荧光成像冷冻切片机&amp;nbsp;</td><td>定制</td><td>-</td><td>大型3D-FICS（步骤4.3.3）</td></tr><tr><td>利多卡因（100 mg/ml）</td><td>杨树</td><td>-</td><td>局部麻醉药（步骤 1.2.3. &amp;& 2.2.10)</td></tr><tr><td>微型剪刀 Vannas 3-3/8 英寸</td><td>Braun-Aesculap</td><td>OC498R</td><td>微型剪刀（步骤 2.6.2）</td></tr><tr><td>带圆柄微型缝合打结镊</td><td>Braun-Aesculap</td><td>FD280R</td><td>微型持针器（步骤 2.3.3）</td></tr><tr><td>带圆柄弯头微型持针钳</td><td>Braun-Aesculap</td><td>FD281R</td><td>微持针器弯曲（步骤 1.5.1. &amp;& 2.3.3.)</td></tr><tr><td>微型血管夹</td><td>Braun-Aesculap</td><td>FD562R</td><td>血管夹（步骤 2.6.1.）</td></tr><tr><td>微导管（内径 0.23114 mm，外径 0.27432 mm）</td><td>微腔</td><td></td><td>微导管（步骤 2.1.1.）</td></tr><tr><td>小鼠加热垫与直肠探头</td><td>斯托尔廷</td><td>53800R</td><td>加热垫（步骤 1.1.2. &amp;& 2.2.2.)</td></tr><tr><td>NG2-DsRed 小鼠</td><td>美国巴港杰克逊实验室，货号 008241</td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇单月桂酸山梨醇酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td>Tween20（步骤 2.5.2.）</td></tr><tr><td>聚苯乙烯荧光微球 蓝色（365/415）</td><td>Invitrogen</td><td>F8829</td><td>蓝色微球（步骤 2.5.1.）</td></tr><tr><td>聚苯乙烯FluorSpheres红色（580/605）</td><td>Invitrogen</td><td>F8834</td><td>红色微球（步骤 2.5.1.）</td></tr><tr><td>恢复笼</td><td>-</td><td>-</td><td>恢复笼（步骤 1.6.2. &amp;& 2.8.2.)</td></tr><tr><td>反向切割3/8弧形针（12毫米）带缝线</td><td>Bbraun</td><td>0762067</td><td>缝合（步骤 2.7.5）</td></tr><tr><td>罗哌卡因&amp;iuml;ne（2 mg/ml）</td><td>-</td><td>-</td><td>药物&amp;nbsp; （步骤 1.1.5）</td></tr><tr><td>小型三维荧光成像冷冻切片机&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>定制</td><td></td><td>小规模3D-FICS（步骤4.2.2）</td></tr><tr><td>Spongostan</td><td>Ethicon</td><td>MS0005</td><td>Spongostan（步骤 1.4.6）</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Euromex Microscopen B.V.</td><td>NZ.1903-B</td><td>手术显微镜（步骤 1.2.2.1.1.）</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Braun-Aesculap</td><td>BC303R</td><td>手术剪（步骤 1.2.2. &amp;& 2.3.2.)</td></tr><tr><td>注射泵（适用于1 ml注射器）</td><td>哈佛仪器</td><td>70-2208</td><td>1 ml 注射泵（步骤 2.5.6）</td></tr><tr><td>线，100米&amp;nbsp; 4/0 1.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Bbraun</td><td>F1134035</td><td>4/0.15 螺纹（步骤 2.4.3）</td></tr><tr><td>TIE2-GFP 小鼠</td><td>美国巴港杰克逊实验室，货号 003658</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超纯除尘刷</td><td>Thorlabs</td><td>CA6-EU</td><td>压缩空气（步骤 1.2.5）</td></tr><tr><td>通用聚合物透明剂</td><td>Sun Medical</td><td>T058E</td><td>超级胶水的组分（步骤 1.3.1.）</td></tr></tbody></table>

用于微血管栓塞的小鼠模型 体内 使用荧光聚苯乙烯微球的双光子显微镜技术

Microvascular Embolism Mouse Model for In Vivo Two-photon Microscopy Using Fluorescent Polystyrene Microspheres

脑部微血管阻塞相对常见，但目前仍缺乏深入研究。其发生率、长期后果以及潜在的清除机制在很大程度上尚不明确。当前用于研究此类事件的模型，如光化学血栓形成和微栓子注射，各自具有优缺点。本研究建立了一种详细方案，结合慢性颅窗制备与脑微血管栓塞的诱导 通过 小鼠动脉内注射微球。该设置可实现长期 体内 使用双光子显微镜对微血管和微小阻塞进行成像。微球通过置于颈外动脉（ECA）的导管输送，随后该动脉被永久结扎。重要的是，在整个操作过程及术后，颈总动脉（CCA）和颈内动脉（ICA）均保持完整，从而最大程度减少对脑血流的干扰。为实现即时观察 体内 成像并防止微球聚集或黏附于移液头和导管，将微球悬浮于FITC-葡聚糖与0.1% Tween 20的混合液中。该注射技术通过以下方法进行了验证： 死后原位 利用三维成像确定微球的分布。本研究进一步验证了其应用价值 体内 双光子显微镜示例。该方法为诱导和研究微血管栓塞提供了一种稳定且可靠的技术，可利用高分辨率成像来探究其影响及清除动力学过程 体内 成像

死后 原位 成像
微血管栓塞手术的成功通过术后4天的全身及全脑原位尸检成像得以确认（图3A）。小鼠的矢状切面显示微球滞留在脑组织中。图3B、C展示了微血管栓塞手术后1天取出的小鼠脑组织示例。微球主要滞留在同侧半球，位于大脑中动脉和前动脉的血流供应区域。当在混合物中添加Tween20后，脑切片中的微球数量显著增加（图3E）。术后恢复期间的体重监测显示，注射含Tween20微球混合物的小鼠术后体重下降较少，且恢复更快（图3F）。
<img alt="显示微球分布的整只小鼠矢状面图像、脑部切面图及组织微球分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68939/68939fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图3"> 
图3：小鼠微血管栓塞手术后微球的分布情况。使用Articulus软件可视化小鼠体内10 µm微球的原位定位41。（A）微血管栓塞手术后，使用大型3D-FICS对整只小鼠成像的矢状面示例。（B-D）使用小型3D-FICS获取的小鼠脑部代表性轴向、冠状和矢状图像。（E）对照组和Tween20组在前囟±0.5 mm处每50 µm冠状脑切片中检测到的微球平均数量。柱状图表示均值±标准差，单个数据点以圆点表示。采用非配对t检验进行统计学比较；图中显示了p值。使用四分位距（IQR）方法识别并剔除异常值（两组各n = 1），最终对照组n = 3，Tween20组n = 14。（F）微血管栓塞手术后（时间点为0）随时间变化的体重归一化变化。体重数据已归一化至各动物手术时的基线值。线条表示每组均值±标准差（对照组，n = 4；Tween20组，n = 5），对照组用蓝色表示，Tween20组用深橙色表示。各时间点组间差异的统计学显著性通过非配对双尾t检验评估。（* = p &lt; 0.05，** = p &lt; 0.01）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/68939fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
微球注射与 体内双光子显微镜成像
在微球注射过程中，涂有5% BSA的导管表面附着大量微球，流动的微球也常出现聚集现象，可能导致较大的阻塞（见补充视频1）。此外，由于注射后可能引发免疫反应，不希望在微球混合液中添加5% BSA以防止粘附和聚集43,44。为避免此问题，在微球混合液中使用了0.1% Tween20溶液，结果明显有更多微球顺利通过导管，并在成像窗口中观察到理想数量（&gt; 20）的微球（图4 和 补充视频2）。图4A、B 显示了微血管栓塞手术后0.5小时脑皮层的荧光显微镜概览图像，每个白色斑点代表一个阻塞脑部微血管毛细血管的微球。图4C、D 展示了一个双光子z轴层扫图像的二维投影示例。微球导致脑部微血管发生栓塞，血流灌注受损，表现为微球下游管腔内染料缺失（图4E 和 补充视频3）。此外，这些栓塞还引起血脑屏障（BBB）破坏，表现为FITC-葡聚糖染料外渗（图4F、G）。
这些结果与注射微球-吐温混合物时观察到的导管上黏附的微球数量较少以及微球聚集程度极低的现象一致。然而，在导管中微球混合物最后的 20 µL 中，有大量微球发生聚集，这部分不应被注射，以避免可能引起较大梗死的发生（见 补充视频 4）。
<img alt="Fluorescent microscopy showing cerebral microvascular embolization with green vessels, pink microspheres." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68939/68939fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 4"> 
图4双光子 体内 嵌顿微球的显微镜检查 示例 体内 小鼠皮层中滞留微球的荧光和双光子图像。（A) 通过颅窗观察 lodges 微球的荧光概览。B选定 ROI 的荧光图像。C,D双光子显微镜图像显示脑微循环中被截留的微球，其中选定感兴趣区域（ROI）进行详细成像。通过计算Z轴堆栈中各像素强度的标准差，将Z轴堆栈图像以二维形式呈现。E-G代表性 在体 双光子显微镜图像显示三处脑微血管栓塞。红色箭头标示出FITC-葡聚糖外渗区域，提示血脑屏障破坏及染料渗漏。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/68939fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充表1：双光子显微镜系统参数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary%20table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 2： FITC-葡聚糖和微球成像的双光子显微镜设置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary%20table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表3： 使用蓝色微球对小鼠脑组织成像的小型三维荧光成像冷冻切片系统设置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary%20table%203.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 4： 使用蓝色微球进行小鼠脑成像的小型三维荧光成像冷冻切片系统技术参数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary%20table%204.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表5： 使用红色微球对整只小鼠进行大体积三维荧光成像的冷冻切片系统设置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary%20table%205.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表6：用于全小鼠红微球成像的大体积三维荧光成像冷冻切片系统技术参数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary%20table%206.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充视频 1：在注射过程中，5% BSA 包被的导管管壁上出现微球黏附，以及在 25 mg/mL FITC-葡聚糖微球混合液中出现微球聚集现象。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary%20video%201.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 2：经 0.1% Tween20 包被的导管，其管壁上有少量微球黏附，但在注射过程中，25 mg/mL FITC-葡聚糖与 0.1% Tween20 的混合液中未出现微球聚集现象。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary%20video%202.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 3：通过微球对微血管阻塞进行三维分割。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary%20video%203.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充视频 4：在含有 0.1% Tween20 的 25 mg/ml FITC-葡聚糖混合液中，以高浓度微球进行注射的最终体积。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary%20video%204.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
补充文件1： 微球黏附移液器吸头验证。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary%20file%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：通过免疫组织化学方法评估微栓塞手术后 1、7 和 28 天同侧与对侧大脑半球 CD45 的覆盖情况。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68939/JoVE68939_Supplementary%20file%202.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案详细描述了一种优化的慢性颅窗结合微血管栓塞小鼠模型的逐步操作方法，适用于 体内 使用荧光聚苯乙烯微球进行双光子显微成像。

脑部微血管阻塞相对常见，但迄今仍缺乏深入研究。其发生率、长期后果及潜在……

通过这种微球注射方法，我们旨在揭示毛细血管堵塞对脑皮层毛细血管网络中栓子清除潜在机制的短期和长期影响。该方法可实现对皮层毛细血管网络中荧光颗粒的实时活体成像与追踪。注射后可连续数周追踪微球及其局部效应。我们的研究有助于理解由微血管阻塞引起的局部组织损伤。这些结果有望为新的治疗策略提供依据。现在，我们可以逐日并持续数周地研究毛细血管堵塞如何改变血管、激活细胞、改变血流以及损害血脑屏障。首先，捏住麻醉小鼠的脚趾以确认麻醉深度。使用手术剪和解剖镊在下颌下方气管位置沿中线做一条约0.5厘米的切口。用显微缝合打结镊分离颈筋膜表层的结缔组织，暴露其下方的胸骨舌骨肌。现在，轻轻撕开左右胸骨舌骨肌之间的结缔组织，将其分离。用组织钩将右侧肩胛舌骨肌向尾外侧牵拉。确保右侧颈动脉三角区域清晰可见，包括颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。接下来，去除颈总动脉周围残留的筋膜和脂肪组织。仔细分离颈总动脉与迷走神经。在颈总动脉周围放置两根4/0 1.5缝线，并松松结扎，确保结扎线结不影响血流。剥离颈内动脉和顶后动脉周围的筋膜和脂肪组织。随后使用4/0 1.5缝线结扎顶后动脉以及所有颈内动脉的分支，包括枕动脉，进行暂时性阻断。剥离颈外动脉和颞动脉周围的筋膜和脂肪组织。使用4/0号线在颈外动脉和颞动脉上各放置两个松结。将最远端的线尽可能远离Y形分叉处放置，并用其永久结扎颈外动脉和颞动脉。 proximal knot保持不打结状态。将10微米的微球均质并超声处理，以获得单个颗粒的均匀悬浮液。取20微升均质后的微球加入140微升FITC-葡聚糖中，得到终体积为160微升的混合液，其中含有1.44 × 10⁵个微球。短暂回抽连接于导管的注射器，以形成气锁。然后将导管尖端浸入已配制好的 FITC-葡聚糖/Tween20/微球混合液中，缓慢回抽注射器，使混合液进入导管内。确保导管内无气泡存在。将装有混合液的导管与注射器一同放入注射泵中。将泵速设定为每分钟10微升，并运行至导管尖端出现微球混合液的小液滴。随后，在颈内动脉上放置血管夹，并收紧先前准备好的近端结扎线之一，围绕颈总动脉进行结扎。使用显微剪刀，在结扎线远端约0.5毫米处的颈外动脉上做一个小的斜向切口，确保切口大小略小于导管直径。用无菌纱布吸去血液。短暂启动注射泵，使微球混合物在导管尖端形成液滴，确认导管尖端无残留空气。打开颈外动脉切口，使用精细显微镊插入导管。然后通过收紧颈外动脉周围的近端缝线，将导管固定在颈外动脉中。以每分钟10 µL的速度缓慢泵入，直至动脉明显扩张，且绿色FITC染料充满颈外动脉，以确认注射成功。接下来，移除颈内动脉上的血管夹。然后将注射泵的流速增加至 20 微升每分钟。通过确认后顶叶动脉分叉远端的颈内动脉已被 FITC 染料填充，以验证微球注射成功。注射成功后，移除结扎颈总动脉的缝线，使微球混合物能够流入颈内动脉。注射过程中，仍可在颈外动脉中观察到FITC染料。当导管内的混合液体达到80 µL刻度时，关闭注射泵以停止注射。随后结扎颈总动脉，夹闭颈内动脉，并轻轻取出导管，同时保留固定用的缝线。通过拉紧固定导管的缝线，永久结扎颈外动脉。移除围绕颈总动脉、颈内动脉和顶后动脉的血管夹及缝线，以恢复血流。术后4天通过全身及全脑原位尸检成像确认微血管栓塞手术的成功。矢状面脑切片显示微球滞留在脑组织中。术后一天成像的小鼠脑组织显示，微球主要滞留在同侧半球，位于大脑中动脉和前 cerebral 动脉的血流供应区域内。当在微球混合物中添加 Tween20 后，脑切片中的微球数量显著增加。注射含有Tween20的微球混合物后，小鼠术后体重减轻更少，恢复更快。术后0.5小时采集的脑皮层荧光显微镜图像显示单个白色斑点，代表微球阻塞毛细血管。双光子z轴层扫投影图像显示微球引起脑微血管栓塞，并导致灌注受损。栓塞还会导致血脑屏障破坏，表现为血管内染料明显外渗。

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用于体内双光子显微镜的微血管栓塞小鼠模型，使用荧光聚苯乙烯微球

本文介绍了一种优化的多模态成像流程，用于在啮齿类动物脑内对细胞移植物进行多模态成像，包括：（i）活体生物发光成像与磁共振成像，以及（ii）死后组织学分析。在单个动物上联合使用这些成像方式，可实现对细胞移植物的高分辨率、高灵敏度和高特异性的评估。...

小鼠中枢神经系统干细胞移植的多模态成像

本视频演示了通过在给予光敏染料后，对完整颅骨进行激光照射，在小鼠模型中诱导光栓塞性卒中的操作步骤。...

小鼠模型中光血栓性卒中的建模：通过小鼠颅骨进行激光照射的技术，在给予光敏染料后诱导光血栓形成

本视频展示了利用活体荧光显微技术在小鼠模型中研究血栓形成的方法。通过向小鼠注射荧光标记的多糖以监测血液循环。当耳部微血管受到高强度光照时，光毒性诱导产生损伤，进而导致血栓形成；通过观察血流阻塞现象可确认血栓的生成。...

活体荧光显微镜观察微血管血栓形成

来源： Jongbloets, B. C., et al．利用活体双光子荧光寿命成像显微技术在头部固定行为小鼠中可视化蛋白激酶A活性．J. Vis. Exp. (2019)...

利用双光子荧光寿命成像显微技术在小鼠体内可视化蛋白激酶A活性

来源： Nishimura, C. 等 利用双光子显微镜在HIV诱导的神经炎症小鼠模型中定量分析脑血管结构。 J. Vis. Exp. (2016)。...

双光子显微成像技术用于小鼠脑微血管的活体成像

来源： Kim, D., et. al. 结合近红外荧光成像与微型计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞。 J. Vis. Exp.

利用微型计算机断层扫描成像技术在小鼠中显示脑血栓

内皮糖萼/内皮表面层最适合通过活体显微镜进行研究。在肺等运动器官中，活体显微镜技术上具有挑战性。我们展示了如何结合明场与荧光显微镜技术，在自由运动的组织中估算内皮表面层厚度 体内...

in vivo 条件下小鼠肺血管内皮表面层的测量

本方案描述了联合近红外荧光（NIRF）成像与微型计算机断层扫描（microCT）技术用于可视化脑血栓栓塞的应用。该技术可实现对血栓负荷及其演变过程的定量分析。NIRF成像技术可用于观察离体脑组织中荧光标记的血栓，而microCT技术则利用金纳米颗粒在活体动物体内实现血栓的可视化。...

结合近红外荧光成像与显微计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞

活体成像是研究健康与疾病状态下生物学的有力工具。本方案描述了使用标准双光子显微镜对小鼠视网膜进行经瞳孔成像的方法。同时展示了多种活体成像技术，用于对视网膜中多个细胞群体进行荧光标记。...

经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

我们介绍了一种使用荧光蛋白mScarlet进行Epon包埋后共聚焦光镜与电镜联用的详细实验方案。该方法能够同时保持荧光信号与超微结构的完整性，适用于多种生物学研究应用。...

环氧树脂包埋后关联光学与电子显微镜技术

本方案描述了一种通过经皮穿刺途径将肿瘤细胞注入小鼠小脑延髓池以可靠诱导软脑膜转移的方法，该方法可减少创伤及颅外肿瘤负荷。...

用于小鼠软脑膜转移研究的微创大池注射模型

学习建立小鼠微血管栓塞模型，利用荧光聚苯乙烯微球和双光子显微镜进行实时活体成像，研究毛细血管堵塞对脑血流和血脑屏障的影响机制。该方法有助于深入理解微血管闭塞引起的组织损伤，为开发新的治疗策略提供重要依据。

用于微血管栓塞的小鼠模型体内使用荧光聚苯乙烯微球的双光子显微镜技术

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用于微血管栓塞的小鼠模型 体内 使用荧光聚苯乙烯微球的双光子显微镜技术

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