Name: 使用天然海洋海水接种物和闭环呼吸计对材料进行好氧生物降解测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 了解使用天然海洋海水接种物和闭环呼吸计对材料进行好氧生物降解测试的标准化方法。该技术可量化合成材料与天然材料在海洋环境中的生物降解速率，为环境科学研究提供可靠数据。

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作者感谢哥伦布仪器公司以及马萨诸塞大学达特茅斯分校海洋科学与技术学院的生物降解实验室在技术支援和设施使用方面提供的帮助。哥伦布仪器公司 Micro-Oxymax 呼吸测定系统的购置经费及实验室启动资金由 PrimaLoft 公司和马萨诸塞技术合作组织提供。

1. 海水的采集与表征
<ol>
	<li>选择一个未受废水、化学品、油膜或强烈淡水影响的海水采集点。</li>
	<li>在采样点记录水源信息（位置、经纬度、采样深度、总水深和温度）、样品采集日期以及观察到的水体状况。</li>
	<li>从多个深度、不同地点及多次采样活动中收集并混合海水样品，以促进形成多样化的微生物群落组成。</li>
	<li>使用大型Niskin采水器，在20 L经酸洗处理的塑料桶中采集10 L至20 L海水，并运回实验室。</li>
	<li>从塑料桶中取出1 L未经过滤的海水子样品，转移至一个经酸洗处理的1 L棕色高密度聚乙烯（HDPE）瓶中，用于实验室测定颗粒态碳和氮，以评估初始海水条件。从该1 L样品中，使用0.2 µm低氮醋酸纤维素滤膜过滤，并收集60 mL滤后子样品至经酸洗处理的聚乙烯瓶中，用于分析溶解性无机氮和有机氮（N）以及磷（P）组分。</li>
	<li>用项目名称、样品编号和日期标记子样品。采用靛酚法（4500-NH3）13,14测定NH4+浓度，采用单溶液法（4500-P E）13,15测定PO43-浓度。采用元素分析法16定量测定颗粒态氮和碳。按照Parsons等17(10150 A, 10150 C)13所述方案测定叶绿素a浓度。 
	注：与营养盐相关的水质分析为可选步骤。本方案假定此类分析由外部实验室完成。</li>
	<li>将塑料桶开口松散覆盖，以维持好氧条件，并将海水在黑暗环境中30 °C下储存最多7天。 
	注：也可使用空气泵和曝气系统对海水进行通气。</li>
</ol>
2. 实验基质的制备
<ol>
	<li>将10–15 g实验底物（例如天然多糖、木材、纤维板、聚合物）加入50 mL不锈钢研磨罐中，底物可呈颗粒、碎片或成型块状，并放入一个20 mm钢球。在测试开始前，将实验底物研磨至均匀的粒径（0.10–0.25 mm）。</li>
	<li>将研磨罐浸入液氮中，脆化15分钟，直至液氮停止沸腾。 
	警告：液氮为低温液体，可能导致冻伤、损伤或低温灼伤。使用前请阅读并遵守所有安全数据表（SDS）说明，穿戴适当个人防护装备。</li>
	<li>将研磨罐固定在球磨机装置上，设置仪器参数为30 Hz，运行2分30秒，然后按开始。重复4次，每次之间在液氮中冷却30秒。若材料为玻璃化转变温度较低的聚合物，可根据需要增加研磨循环次数，以获得均匀的粒径分布。</li>
	<li>通过筛分分析验证粒径均匀性，并按照ASTM D1921-9618所述方法表征粒径分布。组装标准筛组，覆盖预期粒径范围，最小孔径筛置于底部。将研磨后的样品置于最上层筛网上，将筛组固定于机械振荡器中。振荡至颗粒通过筛网。收集并称量各筛网上残留物料，以计算粒径分布。各处理组应使用同一套筛网，以保证可比性。将分布结果记录于数据表中。</li>
	<li>通过元素分析16测定研磨后实验底物各亚样品干重的碳含量。 
	注：本方案假设元素分析由外部实验室完成。</li>
</ol>
3. 海水附加营养物质的制备
<ol>
	<li>用海水将一个2 L或4 L的容量瓶填充至半满。所需总体积取决于实验中将使用的反应器数量。每个反应器将含有75 mL海水。如果海水来源中含有较高浓度的颗粒有机物，请通过20 µm筛网过滤海水，以去除大颗粒物带来的非均相污染。</li>
	<li>使用精度为0.001 g的精密天平，将称量盘去皮后，根据2 L或4 L海水的体积，称取0.5 g/L的氯化铵（NH4Cl），然后称取0.1 g/L的磷酸二氢钾（KH2PO4）。 
	警告：氯化铵可能引起眼部损伤或刺激。使用前请阅读并遵守所有安全数据表中的说明，并佩戴适当的个人防护装备。 
	注意：根据机构规程和当地法规，将氯化铵和磷酸二氢钾的废液 disposed于专用的危险废物容器中。若机构和当地废水管理部门允许，少量稀释（&lt;1%）的NH4Cl和KH2PO4溶液在用大量水稀释后，可能符合排入下水道的条件。</li>
	<li>将无机营养物加入2 L或4 L容量瓶中，用海水定容，加入搅拌子，并在搅拌器上搅拌至所有盐类完全溶解。溶液应澄清，无可见颗粒物。</li>
	<li>取20–30 mL添加了营养物的海水作为子样品，用于pH和盐度测定。另取60 mL样品，通过0.2 µm低氮醋酸纤维素滤膜过滤至经酸洗过的聚乙烯瓶中，用于后续按照步骤1.5中的标准方法测定溶解态无机氮和磷。</li>
	<li>按照制造商说明，使用台式仪器测定pH和盐度。由于营养添加剂呈酸性，预期全盐度海水的pH值会下降约一个单位。</li>
</ol>
4. 反应器容器孵育的准备工作
<ol>
	<li>将所有玻璃器皿（包括样品用的 250 mL 反应瓶和 75 mL 移液管）在 10% 盐酸（HCl）中酸浸 24 小时，然后用去离子水冲洗 3 次。 
	警告：HCl 可能导致严重灼伤和眼部损伤。使用前请阅读并遵守所有安全数据表（SDS）说明。佩戴适当的个人防护装备。 
	注意：10% HCl 废液可在丢弃前用碳酸氢钠中和，形成中性溶液。中和操作应按照机构的危险废物处理程序和适用的地方法规进行。</li>
	<li>在实验前一天，将经酸浸处理的 250 mL 空反应瓶、带端口的瓶盖、硅密封 O 形圈和螺口盖在高压灭菌器中于 121 °C 灭菌 15 分钟。</li>
	<li>用与接收样品或对照材料的反应瓶相对应的通道编号/ID 标记样品瓶。</li>
	<li>使用分析天平，将样品瓶（带盖）去皮归零，准确称取 20 mg（± 0.1 mg）的实验样品或对照样品，记录完整的读数重量，并放置备用。对所有实验组和对照组重复该操作。 
	注意：确保称量准确。建议在同一天由同一人完成所有底物的称量。</li>
	<li>在向培养箱中放入反应瓶的前一天开启培养箱，并将温度设定为 30 °C。在运行系统诊断和传感器校准前至少 2 小时开启呼吸计，具体操作依据制造商说明进行。 
	注意：当培养箱温度达到并稳定在 30 ± 2 °C 后，即可开始反应瓶的准备工作。</li>
	<li>通过记录样品 ID/重复编号及其对应的通道编号来准备数据表。按通道编号/ID 顺序整理反应瓶和瓶盖组件（带端口的盖子/O 形圈）。检查 O 形圈和盖子/端口，确保其清洁、干燥且完好无损。</li>
</ol>
5. 反应容器的设置
<ol>
	<li>使用经酸处理的75 mL刻度移液管和电动移液控制器，向每个反应容器中加入75 mL添加了营养物质的海水。</li>
	<li>从每个容器中移除一支一次性移液管体积的海水（约3 mL），并将其放置在容器旁的清洁表面上。该海水将用于冲洗研磨后的实验组和对照组底物，使其从已去皮重的小瓶中转移出来（图1）。</li>
	<li>将底物转移至相应的容器中。</li>
	<li>在反应容器口部放置一个O形圈，然后将双通道盖子直接置于O形圈上方。用螺帽固定O形圈和盖子。</li>
	<li>将反应容器与其对应的气体/冷凝管路连接。将气体管路牢固地插入容器盖上的相应进/出口。</li>
	<li>开启摇床平台，设置为0.05 × g（连续模式）。进行目视检查以确保所有容器均已固定，然后关闭培养箱门。</li>
	<li>使用气压计记录培养箱内的温度（读数及热敏探头数据）和大气压。</li>
</ol>
<img alt="使用移液器在实验室装置中进行液体转移，用于体积分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68950/68950fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：容器的组装与准备。（A） 加入海水，（B） 加入样品，以及（C） 加入O型圈、金属盖和螺帽。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68950/68950fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
6. 启动呼吸测量系统
<ol>
	<li>在连接的计算机上启动软件。确认系统通过 RS-232 连接检测到硬件。如果未找到硬件，将出现通知提示设备未连接，此时必须重新启动程序。</li>
	<li>在软件主菜单中，选择 工具 &gt; 诊断 &gt; 基本操作。点击 保存日志文件。点击 阀门与传感器。软件将显示每项测试的“通过”或“未通过”结果。仅当两项测试均通过后，方可进行 CO2 传感器的两点校准。</li>
</ol>
7. 校准 CO2 传感器
<ol>
	<li>将苏打石灰柱连接到样品泵背板的氮气端口，以去除环境中的 CO2，用于零点校准。确保苏打石灰呈 chalky white（ chalky white），无变色（例如粉红色或紫色）。</li>
	<li>选择 工具 &gt; 校准。点击右下角的开始校准。当系统提示时，使用前面板的样品泵控制将样品流量调节至 0.5 L/min。点击确定。</li>
	<li>当计时器归零后，按下 CO2 传感器上的上调和下调偏移按钮，将屏幕上读数调整为 0.000（或尽可能接近）。当数值处于可接受范围内时，其颜色将变为绿色。点击下一种气体。</li>
	<li>当系统提示时，将校准气瓶连接至样品泵背板上的校准端口。将校准气体出口压力调节至 5 PSIG。确保过量气体流经 T 型接头，用户可在接头附近听到并感受到气体流动，然后点击确定。</li>
	<li>当计时器归零后，按下 CO2 传感器上的上调和下调量程按钮，将屏幕上读数调整为 2.700（或尽可能接近）。当数值处于可接受范围内时，其颜色将变为绿色。点击下一种气体以完成校准。 
	注：量程气体浓度由供应商分析证书中注明的认证一级标准气体混合物确定。</li>
</ol>
8. 软件中的实验设置
<ol>
	<li>选择 实验 &gt; 设置。根据已占用的通道，从下拉菜单中输入起始和结束通道编号。
	<ol>
		<li>将刷新阈值 (%) 设置为 0.50，刷新间隔设置为 N.A.，刷新窗口 (秒) 设置为自动。</li>
		<li>在杂项设置中，勾选“清洗传感器”选项；确保未选中“自动体积测量”、“O2 消耗为正”和“启用开放流模式”。</li>
		<li>将采样间隔 (小时) 设置为 8.00，实验持续时间 (小时) 设置为 N.A.。根据需要设置气体和时间单位。</li>
		<li>如果使用主温度探头进行培养温度校正，请确保未选中“手动输入腔室温度”。勾选“通风模式”选项，并确保未选中“排水模式”。</li>
		<li>确保未选中厌氧通风模式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择 腔室设置。输入描述性通道标签（例如，NegCtrl_1、PosCtrl_2、Test_PHA_3）。</li>
	<li>点击 工具。仅对已占用的通道点击 EN 列中的细胞。点击 限制。软件将显示每个通道的 PASS（通过）或 FAIL（失败）。仅当所有限制测试均通过后方可继续。</li>
	<li>点击 体积 以测量顶空体积。 
	注：顶空体积等于样品反应器容器及闭合回路管路内空气的体积。请确认体积值与容器尺寸和管路长度相符。</li>
	<li>点击 泄漏检测。软件将根据顶空体积判断每个通道是否通过。若某通道未通过，请执行以下步骤。
	<ol>
		<li>确保 O 型圈清洁，无颗粒或纤维，并正确安装在容器边缘与金属盖之间。</li>
		<li>拧紧螺钉盖。检查 IN/OUT 端口及接头处的连接和管路。使用锋利刀片修剪磨损或变形的管路末端，确保切口平整、笔直。</li>
		<li>若该通道仍无法通过，请更换为制造商指定的新且兼容的 O 型圈。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击 体积 重新测量顶空体积。点击 退出。确保“腔室设置”选项卡中的“体积”列已填写所有已占用通道的数据。</li>
	<li>在主菜单中，选择 工具 &gt; 服务菜单。确认测量培养箱温度的主温度探头处于 30 °C ± 2 °C 范围内且稳定。</li>
	<li>点击 运行。使用包含日期的描述性文件名保存文件（例如，030325PositiveControlValidation）。在数据表上记录文件名。</li>
	<li>选择 实验 &gt; 查看 &gt; 图形 以查看实时曲线图。生物气产生表现为正的 CO2 生成速率。阴性对照可能在零附近波动，但其平均速率应为零或正值。</li>
	<li>若系统包含冷凝式空气干燥器，需每日记录管路中可见的冷凝情况。必要时轻轻摇动管路以消除堵塞，促进排水。</li>
	<li>在每次采样间隔结束时更新数据文件（ASCII 文本文件）。实验过程中或结束后，可将包括温度、气体百分比（气体组成）、速率和累积量在内的数据下载至其他多种软件包。
	<ol>
		<li>要在电子表格中打开 .dat 文件，请启动 Excel 并选择 文件 &gt; 打开。导航至包含 .dat 文件的文件夹。在文件类型下拉菜单中选择 所有文件，然后选择目标文件。</li>
		<li>当文本导入向导提示时，选择 分隔符号 作为文件类型，然后点击 下一步。</li>
		<li>在分隔符下，勾选“逗号”选项。确保未选中其他任何分隔符。预览窗口应显示数据按列分隔。点击“完成”以将数据加载到电子表格中。</li>
		<li>将文件另存为 .xlsx 或 .csv 格式，以便进一步分析和归档。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定期分析数据，确保处理组重复样本之间具有一致性。处理组重复样本的标准误差应小于累积 CO2 生成量均值的 5%。未达到此阈值的测试应重复进行。</li>
	<li>当培养完成后点击 停止。
	<ol>
		<li>培养时间可持续 10 至 90 天。若测试材料高度可生物降解，则在累积 CO2 生成量达到平台期时终止培养；若 90 天后仍未观察到降解，可适当延长培养时间。</li>
		<li>当对照组和测试组容器在至少连续 5 天内均无净气体产生时，可结束实验。净气体产生为零的定义是：5 天内降解百分比变化小于 1%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭系统或准备进行下一次实验。</li>
</ol>
9. 分解实验步骤
<ol>
	<li>记录培养箱温度（热敏电阻探头和培养箱读数）。将反应器容器与呼吸计的管路断开，并使用精密天平称量每个样品反应器容器。记录重量，以确定在培养期间是否发生任何失重或水分损失。</li>
	<li>从每个反应器容器中取 20–30 mL 海水进行分样，测定 pH 和盐度，并将这些数值与步骤 3.4 中记录的数值进行比较，以验证培养期间参数的稳定性。另取 60 mL 样品，通过 0.2 µm 低氮醋酸纤维素滤膜过滤至经酸浸处理的聚乙烯瓶中，用于溶解无机氮和磷的分析，分析方法遵循步骤 1.5 中的标准方法。 
	注意：残留的海水样品可经过滤去除残余塑料，稀释以降低营养盐浓度，并根据机构和当地法规通过下水道排放处理。</li>
	<li>用自来水冲洗容器、O 形圈、金属盖和螺口盖。将玻璃器皿置于 10% 盐酸酸浴中至少 24 小时。高压灭菌后用铝箔覆盖保存，供下一次培养使用。</li>
</ol>
10. 计算降解百分比
<ol>
	<li>按下述方法计算实验组/对照组底物中的总碳量： 
	<img alt="静态平衡方程；化学浓度计算；公式转换图示。" src="/files/ftp_upload/68950/68950eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程 1"> 
	其中 % C（碳含量）通过元素分析测定。 
	注意：实验组和对照组底物中的总碳在好氧培养过程中可能发生如下生化转化： 
	C + O2 → CO2 
	每毫摩尔（12 mg）实验组/对照组底物中的有机碳可转化为 1 mmol 气态 CO2。在标准温度和压力（STP）下，1 mmol 气体占据 22.4 mL 体积。</li>
	<li>按下述方法计算生物降解率百分比： 
	<img alt="用于计算降解率百分比的生物降解方程，涉及实验中的底物与对照。" src="/files/ftp_upload/68950/68950eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程 2"> 
	其中 Cg = 实验组/对照组底物及阴性对照（仅海水接种物）产生的气态碳量，单位为 mmol；Ci = 加入的实验组底物中的碳量，单位为 mmol。</li>
	<li>按下述方法计算生物降解百分比的标准误 se： 
	<img alt="静态平衡方程，Se=SQRT((s²_substrate/n1)+(s²_negative control/n2))×100÷Ci(底物)。" src="/files/ftp_upload/68950/68950eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程 3"> 
	其中 n1 和 n2 分别为实验组/对照组底物和阴性对照反应器的重复数量，s 为产生的总气态碳量的标准差。</li>
	<li>按下述方法计算 95% 置信区间（CL）： 
	<img alt="静态平衡公式；生物降解分析中的 95% 置信区间；方程。" src="/files/ftp_upload/68950/68950eq4.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="方程 4"> 
	其中 t = 自由度为 (n1 + n2 − 2) 时对应 95% 概率的 t 分布值，因此当 n = 3 + 3 − 2 = 4 时，自由度为 4。</li>
</ol>
11. 实验方案结束
<ol>
	<li>完成计算和数据分析后，根据项目或机构的数据管理计划，将结果汇编成最终报告或录入共享数据库。确保所有材料均按照机构危险废物处理指南进行处置，并对所有设备进行清洁和存放。</li>
</ol>

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作者声明不存在竞争性财务利益。

阳性对照的表现决定测试的有效性。基于其理论最大产气量，易在海洋环境中生物降解的阳性对照底物（如分析级纤维素、牛皮纸等）的生物降解率必须达到至少70%。该标准用于验证孵育期间天然海水中的环境条件适宜且微生物活性充足。若未达到此阈值，则表明可能存在平行样本制备、海水接种物处理（即微生物群落失活）或呼吸测量系统功能方面的问题，需判定该测试无效。
为尽量减少重复制备过程中可能产生的变异，所有样品材料应保持相同的物理形态，且平均粒径应小于0.25 mm。物理形态的差异会导致可用于微生物降解的表面积不同，从而影响矿化程度和速率。若采用低温研磨处理样品，应使用筛分装置或粒径分析仪验证其粒径分布的一致性。当物理性质相似的材料采用标准化研磨方案（例如，固定研磨次数和频率）处理时，通常可获得一致的粒径。强烈建议不同材料之间保持粒径的一致性，以确保不同处理组和测试之间的可比性。
实验误差的一个常见来源是加入样品反应容器中的聚合物质量不准确或不一致。为减少误差，所有样品材料应在同一天由同一名技术人员使用经过适当校准的分析天平进行称量。为确保样品材料完...

塑料废物对海洋生态系统和人类健康构成威胁1。人们对塑料污染以及海洋中各类材料形成的海洋垃圾日益关注，凸显出对可持续解决方案的需求，例如改进废弃物的终端管理，以及开发可在海洋环境中快速生物降解的可生物降解材料。与传统的合成塑料不同，后者可在环境中存留数十年至数百年，并产生在食物网中累积的微塑料2,3,4，而可生物降解材料作为含碳有机成分，可能被微生物代谢为CO2和甲烷（CH4），或同化为微生物生物量5。因此，理解材料在海水中的生物降解过程，对于量化和减轻海洋垃圾的环境影响至关重要。
海洋环境中生物降解过程受时空变量相互作用的调控，包括光照和营养物质的可利用性、压力、温度、微生物物种组成以及聚合物的理化性质与结构，这些因素共同决定了降解的速率、程度和机制6这些变量为模拟海洋环境的实验室生物降解研究带来了重大挑战。本标准操作程序（SOP）采用天然海水作为接种物，以捕获 原位 存在的微生物群落，并记录相关变量，包括海水中溶解性营养盐、颗粒态碳和氮、叶绿素、盐度、pH 和温度。这种受控的基于实验室的方法可优化促进矿化作用的条件，并实现直接的生物降解测量，而这些在自然条件下难以实现 原位ASTM国际D6691-24a《通过特定微生物群落或天然海水接种物测定塑料材料在海洋环境中需氧生物降解的标准试验方法》（以下简称ASTM D6691）以及本标准操作程序（SOP）被开发为一种快速、可靠的筛选工具，用于评估材料的生物降解性7,8,9,10.
与 ASTM D6691（聚合物固有生物降解性筛选试验标准）一致，本方案在最佳条件下评估材料的生物降解性，包括温度 30 °C、样品经研磨以获得最大表面积，以及过量无机营养物质（氮，130 mg/L；磷，23 mg/L）。9，以促进矿化并防止营养限制。尽管筛选试验可提供有价值的初步信息，但在自然海洋条件下进行全面评估时，可能还需进行其他测试，例如近海和深海系泊试验，这类试验通过测量随时间变化的重量损失来评估材料降解情况。由于这些近海和深海系泊试验是基于随时间变化的重量损失来估算生物降解程度的10,11，研究人员应在进行下一步之前，首先执行此筛选试验，该试验可直接测定微生物的代谢活动 原位 近海与深海锚系实验，其成本也更高。
ASTM D6691 标准测试方法规定了评估非漂浮性塑料材料在海洋环境中好氧生物降解性能的程序。该标准与规范类标准（如 ASTM D7081《海洋环境中非漂浮性可生物降解塑料的标准规范》；该标准专注于水相介质中的生物降解性，目前已被 ASTM 撤回并正在重新投票）共同为实验性聚合物的海洋可生物降解性认证提供了框架9,12。通常情况下，规范是由 ASTM International 制定的共识性标准，规定了材料、产品或系统必须满足的技术要求。此类规范确保设计用于在海洋环境中生物降解的材料在可接受的时间范围内完成降解，并且不会释放潜在的有毒添加剂，例如染料或增塑剂。
基于 ASTM D6691，本实验方案用于定量测定材料（实验底物）在天然海水中好氧生物降解的速率和程度，并扩展了阳性材料对照（如纤维素、牛皮纸、壳聚糖/壳多糖）的应用，这些对照在历史上已被证实可在海洋环境中生物降解7,9,10。该方法的目标是在优化条件下对材料进行筛选，以评估其是否可在海洋环境中发生生物降解。实验所用接种物来源于符合 ASTM 规定指南采集的海水中天然存在的微生物群落。这些指南强调应使用盐度约为 32、且采自无污水、化学品倾倒或油污泄漏等污染源区域的海水。实验采用自动封闭式呼吸计系统，反应器体积为 250 mL，运行温度维持在 30 °C，每个反应器中含有 75 mL 海水及约 20 mg 的实验底物或对照底物8。矿化作用（即生物降解）以产生的净碳气体（CO2-C）占初始添加碳质量的百分比表示。本方法未考虑碳同化进入微生物生物量的部分。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m，47 mm 醋酸纤维素滤膜</td><td>Geotech Geofilter</td><td>83100056</td><td>过滤海水</td></tr><tr><td>100 mL 容量吸管</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>13-650-2U</td><td>A 级；经酸浸处理并用去离子水冲洗</td></tr><tr><td>100–600 mL 玻璃烧杯</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>50-194-5690</td><td>A 级；经酸浸处理并用去离子水冲洗</td></tr><tr><td>20 mm 研磨球</td><td>Retsch</td><td>53680062</td><td>不锈钢材质。与研磨罐配合用于聚合物的低温研磨</td></tr><tr><td>50 mL 研磨罐</td><td>Retsch</td><td>14620216</td><td>不锈钢材质。与 Mixer Mill 400 及 20 mm 研磨球配合用于聚合物的低温研磨</td></tr><tr><td>75 mL 容量吸管</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>13-650-2T</td><td>A 级；经酸浸处理并用去离子水冲洗</td></tr><tr><td>空气泵与鼓泡系统</td><td>Tetra</td><td>77846</td><td>在预培养平衡期间对海水进行曝气</td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisherbrand</td><td>01-213-100</td><td>用于高压灭菌和清洁储存的覆盖物</td></tr><tr><td>氯化铵（NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical</td><td>A661-500</td><td>海水营养加标物</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler</td><td>AT201</td><td>用于称量实验组和对照组底物</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Tuttnauer</td><td>MFI-TTN-3870EA</td><td>用于灭菌容器及盖组件</td></tr><tr><td>Base Micro-Oxymax 120VAC 单通道系统</td><td>Columbus Instruments</td><td>0135-8000</td><td>用于存放阳性对照和聚合物</td></tr><tr><td>校准气体</td><td>Airgas</td><td>X03NI92P3000001</td><td>一级标准气体混合物；含 2.7% 二氧化碳、4.5% 甲烷，余量为氮气</td></tr><tr><td>计算机显示器</td><td>Dell</td><td>210-BMKK</td><td>Dell Pro 24 Plus USB-C 集线器显示器。与计算机配合运行 Micro-Oxymax 软件</td></tr><tr><td>低温手套</td><td>Thermo Fisher Scientific, Tempshield, Cryo Gloves</td><td>11-394-306</td><td>用于操作液氮</td></tr><tr><td>指针式温度计</td><td>Thermo Fisher Scientific, H-B Instrument Durac</td><td>13-201-433</td><td>用于校准采集海水时的水温</td></tr><tr><td>一次性移液管</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td>冲洗容器内壁以释放附着物质</td></tr><tr><td>ENC52 温度与光照控制箱</td><td>Columbus Instruments</td><td>4740-4054</td><td>维持恒定的温度和光照条件</td></tr><tr><td>烧瓶夹</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>S07387</td><td>用于在液氮中操作研磨罐</td></tr><tr><td>250 mL 锥形瓶</td><td>DWK Life Sciences</td><td>14395-250</td><td>样品反应容器</td></tr><tr><td>带插口式盖的玻璃小瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>03-339-26D</td><td>样品储存</td></tr><tr><td>H22PX 手持式测深仪</td><td>West Marine, Norcross Marine</td><td>6849368</td><td>测定海水采集点的水深</td></tr><tr><td>手持式 GPS 73</td><td>Garmin</td><td>10-01504-00</td><td>用于确定海水采集点的位置</td></tr><tr><td>高密度聚乙烯（HDPE）盆</td><td>Thermo Scientific, Nalgene</td><td>13-359-26</td><td>用于在 10% HCl 溶液中对玻璃器皿进行酸浸处理&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盐酸（酸性水溶液）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical</td><td>A144-212</td><td>经认证的 ACS Plus 级，浓度为 36.5% 至 38.0%。用于 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 传感器校准及玻璃器皿的酸浸处理</td></tr><tr><td>层流罩</td><td>Air Science</td><td>FLOW-48-A</td><td>在样品制备过程中最大限度减少空气中的污染物</td></tr><tr><td>大容量 Niskin 采水器；Beta Plus 瓶体（仅 8.2 L 水平式，PVC）</td><td>Science First</td><td>3-1980-H65</td><td>用于从码头或船上采集海水</td></tr><tr><td>液氮盆</td><td>Thermo Fisher Scientific, Bel Art Magic Touch 2</td><td>11-999-063</td><td>用于盛装液氮&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 L 液氮转移容器</td><td>Thermo Scientific</td><td>TY509X2</td><td>用于储存和分配液氮，以进行低温研磨</td></tr><tr><td>工业级液氮，22 PSI</td><td>Airgas</td><td>NI 180LT22</td><td>用于使聚合物变脆并进行研磨</td></tr><tr><td>机械筛分振荡器</td><td>Humbolt, Grainger</td><td>5DPL6</td><td>用于粒径分布的筛分分析</td></tr><tr><td>Micro-Oxymax&amp;nbsp;</td><td>Columbus Instrumentts</td><td>7395-113-D64</td><td>硅胶密封 O 型圈，金属接口带 3 个接头，以及 GL45 螺口盖&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Micro-Oxymax 10 通道扩展接口</td><td>Columbus Instruments</td><td>0135-8101</td><td>呼吸测定系统组件</td></tr><tr><td>Micro-Oxymax 呼吸测定仪（3% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 传感器）</td><td>Columbus Instruments</td><td>0135-8403</td><td>非色散红外检测</td></tr><tr><td>Mixer Mill 400</td><td>Retsch</td><td>207450001</td><td>Mixer Mill 400。用于聚合物的低温研磨</td></tr><tr><td>电动移液控制器</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td>将海水转移至样品反应容器</td></tr><tr><td>窄口琥珀色高密度聚乙烯（HDPE）实验室级瓶，1 L</td><td>Thermo Scientific, Nalgene</td><td>02-923-5</td><td>用于采集离散的全水海水样品</td></tr><tr><td>20 微米尼龙筛网</td><td>ELKO Filtering Co.</td><td>41718</td><td>用于筛除原始海水中较大的异质颗粒</td></tr><tr><td>开放式轨道摇床</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SK4000</td><td>在孵育期间维持反应容器的轨道运动</td></tr><tr><td>OptiPlex 5090 小型台式计算机</td><td>Dell</td><td>C0SL03</td><td>台式计算机，用于运行 Micro-Oxymax 软件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pH/电导率仪</td><td>Mettler Toledo, SevenExcellence S470-Basic</td><td>30046252</td><td>台式 pH/电导率仪，用于测量海水接种物的初始和最终值</td></tr><tr><td>60 mL 聚乙烯瓶</td><td>Qorpak</td><td>PLC-03564</td><td>用于采集离散的过滤海水样品</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;(PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)）</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisher BioReagents</td><td>BP362-500</td><td>海水营养加标物</td></tr><tr><td>精密天平</td><td>Sartorius</td><td>Practum2102-1S</td><td>用于称量容器的皮重和总重</td></tr><tr><td>20 L 圆形大瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02961A</td><td>经酸浸处理，用于储存海水</td></tr><tr><td>护目镜</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>19-181-513</td><td></td></tr><tr><td>药勺</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand, Scoopula</td><td>01-257-567</td><td>不锈钢实验室药勺</td></tr><tr><td>筛网</td><td>Advantech, Grainger</td><td>40PR18-40PR55</td><td>不锈钢筛网。筛网的数量和规格取决于待测材料。</td></tr><tr><td>Sigmacell 纤维素，101 型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435236-250G</td><td>粉末状，阳性对照底物</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisher Chemical</td><td>S233-500</td><td>用于 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 传感器校准</td></tr><tr><td>无水亚硫酸钠，98%</td><td>Thermo Fisher Scientific, Thermo Scientific Chemicals</td><td>AAA1793336</td><td>用于 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 传感器校准</td></tr><tr><td>温度计/热敏电阻探头</td><td>Fisherbrand</td><td>15-079-700</td><td>验证培养箱温度</td></tr><tr><td>可追溯精密指针式气压计</td><td>Fisherbrand</td><td>14-648-51</td><td>记录实验开始时的大气压力</td></tr><tr><td>Victor 中型氢气、甲烷双级减压阀，CGA-350</td><td>AirGas</td><td>VIC0781-3559</td><td>校准气体减压阀&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2 L 容量瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific, Fisherbrand</td><td>FB4002000</td><td>A 级；经酸浸处理并用去离子水冲洗。用于配制营养加标海水。</td></tr><tr><td>称量盘</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-202-101</td><td>聚乙烯材质</td></tr></tbody></table>

利用天然海水接种物和闭环呼吸计进行材料的好氧生物降解测试

Aerobic Biodegradation Testing of Materials Using a Natural Marine Seawater Inoculum and Closed Loop Respirometer

正确评估可生物降解材料依赖于标准测试方法的广泛采用。尽管已有此类方法，但由于成本高昂以及新建实验室所需启动时间较长，测试能力仍然受限。本改良筛选方案基于美国材料与试验协会（ASTM International）标准方法 D6691-24a《通过确定的微生物群落或天然海水接种物测定塑料材料在海洋环境中需氧生物降解的标准试验方法》，用于评估材料在海洋环境中的生物降解情况，并通过与阳性对照和阴性对照的结果进行比较，采用添加了铵盐和磷酸盐的天然海水接种物，以防止营养限制。材料被暴露于这种营养富集的海水中，并在 30 °C 下培养。使用 Micro-Oxymax 呼吸仪随时间测量生物气体（二氧化碳，CO2）的生成量。通过计算材料来源的碳转化为生物气态碳的比例，确定矿化程度（即生物降解程度）。以实测或理论碳含量的分数形式表示的 CO2 生成百分比，作为时间的函数进行报告。该封闭式呼吸测定系统可容纳多种反应容器，每种材料设三个平行样，同时包括阴性对照（仅含海水接种物）和阳性对照（薄层色谱级纤维素）。该方法对于评估材料在海洋环境中的降解性能具有重要意义，并有助于应对全球性污染防控问题。

展示了海洋生物降解测试的结果。通过测量转化为二氧化碳的碳的比例，评估每个样品的生物降解情况。累积生物降解、降解速率和降解百分比曲线通常表现出一个滞后期，随后是增长期，最终达到平稳期。这些阶段的时间和程度取决于样品材料、实验条件以及海水接种物的组成。
全年从温带海湾采集的海水在水质组分上表现出变异性。例如，微生物群落的多样性和丰度在日际到季节尺度上均存在变化19,20。此外，海水中接种物所含的活性有机碳可能引起重复样本间二氧化碳生成的异质性。有机碳，尤其是缓慢降解的颗粒态有机碳，可能影响微生物群落对碳的可利用性21。尽管这种异质性可能不会影响生物降解的程度，但它可能增加重复样本之间的变异，从而降低结果的稳健性。
表1 和 图2 展示了生物降解测试中的典型阳性结果。<stro...

本方案描述了在有氧条件下，利用天然海水接种物和自动化封闭回路呼吸测量系统，对潜在可生物降解材料（包括合成材料和天然材料）进行测试的标准操作程序。

可降解材料的准确评估依赖于标准测试方法的广泛应用。尽管此类方法已存在，但测试能力仍然……

本研究利用天然海水接种物，量化自然材料在海洋环境中的有氧生物降解速率和降解程度，以实现数据间的可比性。目前实验面临的挑战包括测试能力有限，以及缺乏满足日益增长的生物降解测试需求的基础设施，同时需确保各实验室间方法的统一性和透明度。首先，使用大型Niskin采水器将10至20升海水收集至一个20升经酸清洗过的容器中。将装满的塑料桶运回实验室。从塑料桶中转移一升全海水至一个经酸浸处理的、一升容量的琥珀色高密度聚乙烯（HDPE）瓶中，用于颗粒态碳和氮分析。使用0.2微米、低氮含量的醋酸纤维素膜对其进行过滤。现在，用海水将一个一升、两升或四升的容量瓶装至半满。如果海水中的颗粒有机物含量较高，需通过20微米筛网过滤，以去除较大的不均一颗粒。然后，取60毫升滤液，收集到经酸浸处理的聚乙烯瓶中，用于溶解性无机氮、有机氮以及磷的分析。松散地覆盖烧瓶口以保持有氧条件。在30摄氏度避光条件下储存，最长七天。接下来，将10至15克实验底物放入50毫升不锈钢研磨罐中。使用一个20毫米的钢球。将研磨罐浸入液氮中15分钟以使其变脆。将研磨罐固定在球磨机的夹具上。然后将仪器设置为30赫兹，运行时间为2分30秒，按下启动键。每个循环之间用液氮冷却30秒，共进行4次研磨。在开始测试前，将基质研磨至粒径均匀，介于0.10至0.25毫米之间。使用精度为0.001克的精密天平，称取每升0.5克氯化铵和每升0.1克磷酸二氢钾。将无机营养物质加入锥形瓶中。用海水定容至刻度。然后放入一个搅拌子，在搅拌器上搅拌，直至所有盐完全溶解。使用分析天平称取20毫克的实验组或对照组底物。记录完整的读数重量，并将小瓶置于一旁备用。为准备反应器容器，使用经酸处理的75毫升刻度移液管，并配合电动移液控制器，吸取海水，向每个反应器容器中加入75毫升添加了营养物质的海水。从每个容器中取出约3毫升海水，然后将其放置在容器旁的洁净表面上，用于冲洗研磨后小瓶中的底物残渣。现在将研磨后的底物从撕开的样品瓶转移至相应的反应釜容器中。在反应釜口部放置一个O形圈，然后将双端口盖置于O形圈上，并用螺纹盖固定。将每个反应器容器连接到对应的气体或冷凝管路。将气体管路牢固地插入盖子上的相应进样口和出样口。将摇床平台调至连续模式，加速度设为 0.05G。目视检查所有容器是否固定牢固，然后关闭培养箱门。在仪器软件中，进入“实验”页面并点击“设置”。从下拉菜单中输入已占用通道的起始和结束通道编号。将刷新阈值设置为 0.50，刷新间隔设为 NA，刷新窗口设为自动。然后在杂项设置中勾选清除传感器选项。确保未选中自动体积测量、氧气消耗正值以及启用开放气流模式。将采样间隔设置为 8.00，然后根据需要设置气体和时间单位。如果使用主温度探针对孵育温度进行校正，请确保未选中“手动输入腔室温度”。勾选“通风模式”复选框，并确保未选中“排水模式”。然后，选择“腔室设置”并输入描述性通道标签。如果发现泄漏，则需确保O形圈清洁、安装到位，且无颗粒或纤维污染。拧紧螺钉盖。检查进液口和出液口的管路连接。 使用锋利刀片修剪磨损或变形的管端，以获得整齐的切口。从菜单中选择“工具”，然后点击“服务菜单”，并确认主温度探头测量值为30摄氏度，允许±2摄氏度的波动，且读数稳定。点击“运行”以开始实验。将实验文件另存为包含日期的描述性名称，并在数据表上记录文件名。84 天内的累积二氧化碳产量证实了预期性能。在 84 天内，纤维素在短暂迟滞后显示出快速的二氧化碳生成，产量达到约 700 微摩尔。PHA在三天内的初始速率较慢。海水对照组保持在150微摩尔的低水平。各个阴性对照重复组显示出较低的变异性，所有曲线均紧密接近。纤维素阳性对照组的重复实验显示出持续较低的变异性，表明在全部四个重复样本中性能稳定。在阴性结果数据集中，第五个重复样本出现了二氧化碳产生速率的异常峰值，可能是由于存在不稳定的有机物质所致，但其累积产量在100微摩尔时开始趋于平缓。第六组中的第一个重复样本的累积二氧化碳产量低于其他样本，提示可能存在技术问题。阴性对照中平均累积二氧化碳产量的标准误为2.5%，表明重复样本间的变异性较低。纤维素阳性对照的标准误为0.83%，进一步证实了生物降解测定实验具有高度可重复性。PHA的矿化程度接近阳性对照，其标准误与对照组相当。本方案旨在弥补工业界、学术界及监管机构在海洋环境中对材料生物降解性进行标准化筛查时缺乏便捷方法的空白。该方案提供了一种更快速的标准化方法，可直接测量材料的生物降解过程，并在同时评估多个样品时缩短测试周期。本方案支持高通量的标准化测试，实现不同材料和实验室之间的可比性，从而为材料性能的机器学习与预测建模提供数据基础。

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了解使用天然海洋海水接种物和闭环呼吸计对材料进行好氧生物降解测试的标准化方法。该技术可量化合成材料与天然材料在海洋环境中的生物降解速率，为环境科学研究提供可靠数据。

利用天然海水接种物和闭环呼吸计进行材料的好氧生物降解测试

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