Name: 离 体 肺灌注期间的热预处理在移植前受损肺移植物的修复中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 了解离体肺灌注结合热预处理技术，用于修复移植前受损的大鼠肺移植物。该方法可激活内源性保护机制，为非药物治疗策略提供新途径，有望改善肺移植成功率。

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由瑞士国家科学基金会（编号 310030_212252）向 TK 和 LL 提供的资助支持。

作者声明无利益冲突。

建立可重复且具有生理相关性的大鼠离体肺灌注（EVLP）模型是肺移植研究中的重要进展。尽管大鼠肺与人肺之间存在显著的种属差异（最近已有综述1），尤其是大鼠肺更为脆弱，但大鼠EVLP模型仍能以高重复性和低成本实现药理学和非药理学干预。EVLP为评估供体肺功能、模拟缺血-再灌注损伤等临床损伤情况，并在移植前实施治疗干预提供了独特的平台2,39,40。在此背景下，大鼠EVLP模型可在严格控制的条件下实现高通量的机制性研究33。近年来，多个研究团队对大鼠EVLP技术进行了优化。Nelson等提供了基础的操作指导39；Wang等提出了一种模块化的EVLP系统，专门用于模拟循环死亡后捐献（DCD）的情况41；Gouchoe等探索了使用人工携氧剂的新型灌注液配方42；Oliveira等则聚焦于长时间冷缺血保存后的炎症反应38。在上述研究基础上，本方案引入了一种新颖的非药理学策略——热预处理，旨在激活内源性保护机制，以修复因热缺血而受损的大鼠肺移植物。本研究所用的受损肺模型模拟了DCD条件，实验在雄性Sprague-Dawley大鼠中进行33。
建立本方案需仔细关注若干技术上要求较高的步骤，这些步骤对肺脏的存活率和实验可重复性具有关键影响。肺脏获取过程中必须尽量减少操作，以避免实质组织损伤。麻醉深度至关重要，需充分防止因喘息导致的肺充血及排血不全。在插管和管路预充液过程中必须严格避免气泡进入，因为即使微小的气栓也可能诱发肺水肿43。针对常见实验问题的具体解决方案见表3。虽然通气和灌注参数可在安全范围内调整，但仍须坚持肺保护性策略，以防止气压伤或容积伤44。灌注液流速在大鼠中最高可达预估心输出量的20%，而在猪和人类等较大动物模型中可达40%，但必须谨慎滴定调节45。在本方案中，我们采用较低的灌注流速（理论心输出量的7.5%），以防止肺动脉压力骤升及温缺血损伤肺脏早期肺水肿的发生，从而延长准备时间。尽管部分实验室在灌注过程中给予糖皮质激素以减轻炎症反应46,47，但因其已知的抗炎作用可能干扰某些实验结果，因此我们在模型中不使用此类药物，以保留研究肺损伤及炎症过程的能力。
热预处理需要精确的温度控制。由于热量会在从储液器到肺的管路中散失，因此必须在灌注液流入端导管处监测灌注液温度，并将水浴锅的设定温度保持在目标流入温度略高一些，以确保实验装置内部达到目标温度。传感器每年使用多通道 PCE-T 1200 数字温度计进行校准，以保证测量准确性。
我们的研究结果还解决了传统热疗的关键局限性。全身性热疗因温度调控不精确、存在全身性副作用以及缺乏器官特异性而受到限制。EVLP通过提供一个受控的局部环境，克服了这些障碍，能够将热应激精确地递送至肺组织29。该方法可严格调控热应激的强度和持续时间——这两个对于在不引发热损伤的前提下优化保护性细胞反应至关重要的参数。此外，我们的EVLP平台支持多种下游评估，包括分子、组织学和功能分析。重要的是，经过EVLP处理的肺脏还可用于移植，从而能够在体内直接评估EVLP后移植物的功能in vivo29。因此，该模型支持在离体器官和移植后两个层面进行评估。在此背景下，将热预处理（即在EVLP期间短暂暴露于41.5 °C）整合进来，成为一种有前景的干预手段。通过激活热休克反应及其他应激适应通路，该方法可在无药物干扰的情况下增强移植物的耐受性。我们的结果显示，热预处理可改善肺移植物的生理功能，减少水肿形成以及炎症介质和细胞损伤生物标志物的释放（例如，经热处理肺脏的EVLP灌注液中血管性血友病因子水平降低即为一例）。形态学分析进一步支持该干预的保护作用，表现为结构损伤减轻和组织完整性得以维持。大多数实验性大鼠EVLP数据均来自雄性动物，限制了对性别特异性效应的理解；已有两项研究报道了雌性动物中的不同结果——一项显示再灌注损伤减轻，另一项则显示炎症加重48,49。尽管本研究使用了雄性动物，但我们先前在使用雌性猪的EVLP模型中也观察到了TP的益处29，提示该效应在不同性别中均具有相关性。
必须强调本方法的重要限制和缺点。首先，为确保肺脏灌注达到实际所需温度，必须将温度传感器牢固地贴附在流入导管处，以实时监测温度。其次，温度变化必须在极短的时间内完成，这就要求使用快速响应的恒温水浴进行加热，并通过向水浴中添加冰块实现快速降温。第三，热应激的生理反应可能因实验所用物种的不同而存在差异，且高度依赖于应激的强度和持续时间。因此，若将本方案应用于不同动物物种或人肺，必须开展预实验，采用不同加热温度和不同处理时长，并评估与热应激的保护作用及潜在不利影响相关的特定终点指标。第四，由于热响应基因具有动力学表达特征，热预处理的效果取决于热应激后恢复时间的长短。为评估热处理的时间依赖性效应，需开展在热应激后不同时间点（即不同持续时间的离体肺灌注，EVLP）进行的实验，这一点已在我们近期关于该主题的发表研究中得到证实30。
综上所述，本研究建立了一套详细且可重复的大鼠离体肺灌注（EVLP）方案，将热预处理作为一种可行策略，用于改善边缘性供体肺的质量。该方案可扩展并适用于更大动物或人类的EVLP系统，增强了其转化应用价值。通过提供方法学上的严谨性和生理上的保真性，该模型为探索旨在减轻缺血-再灌注损伤、改善肺移植后移植物预后的非药物干预手段开辟了新的途径。

离体肺灌注（EVLP）是肺移植领域的一项重大进展。其最主要的影响在于通过功能评估边缘性肺脏，使原本会被弃用的供体肺得以用于移植，从而扩大了可用供体肺的来源1,2。边缘性（或称扩展标准）供体肺包括以下一项或多项标准：供体年龄超过55岁、PaO2/FiO2低于300、缺血时间超过6小时、痰液微生物培养阳性、影像学检查异常3。除了生理学评估外，EVLP还可作为多种治疗干预措施的平台，用于移植前改善移植物质量（即治疗性再 conditioning 的概念）4。因此，EVLP提供了独特的机会来修复受损（边缘性）肺脏，并降低原发性移植物功能障碍（PGD）的风险；PGD是影响肺移植术后早期及远期预后的主要并发症5,6。PGD是缺血-再灌注损伤（IRI）过程的临床表现，其病理生理机制涉及氧化应激、炎症反应、补体系统和凝血级联反应的激活，以及细胞死亡过程的诱导7,8,9。最终，这些机制导致肺内皮和上皮的正常功能受损，引发非心源性肺水肿和氧合能力下降，这两者是PGD的两个关键特征6,10,11,12。
越来越多的实验研究（包括临床前和临床研究）已证实，在肺移植过程中，多种ex-vivo治疗策略在减轻缺血-再灌注损伤（IRI）方面具有显著疗效。这些策略包括针对氧化剂和自由基、细胞死亡通路、炎症介质的药物干预，以及细胞治疗和基因治疗等13,14,15,16,17,18,19,20。除上述治疗方法外，离体肺灌注（EVLP）还可作为向肺移植物施加生理应激的平台，以激发其内在保护机制，从而对后续的病理生理损伤产生适应性耐受。其中一种策略是在EVLP期间对肺移植物施加短暂且非致死性的热应激。事实上，长期以来人们已知热应激条件可诱导适应性热休克反应，该反应通过表达一系列热休克蛋白（HSPs）实现，这些蛋白作为分子伴侣，赋予细胞抵抗多种后续应激刺激的能力21。除HSP的诱导外，热暴露还可引发其他一些细胞适应性变化，包括：（a）NF-E2相关因子2（NRF2）介导的抗氧化与细胞保护通路，该通路在热应激下被激活，显著上调细胞保护基因血红素加氧酶的表达22,23；（b）未折叠蛋白反应（UPR），用于应对内质网中的蛋白毒性应激（即内质网应激，ER stress），其在热应激下的激活可能具有保护或损伤双重作用，具体取决于热应激的强度24,25,26；（c）自噬，一种促进溶酶体降解受损细胞器和大分子的细胞保护过程，其活性可因热应激的温度和持续时间不同而被激活或抑制27,28。
我们已证明，这种&#34;热预处理&#34;在减轻氧化应激、炎症反应、细胞死亡和内皮功能障碍方面具有显著益处，从而对肺缺血-再灌注损伤（IRI）提供有效保护。因此，我们提出，热预处理可能代表一种新型的非药物性策略，用于移植前对受损肺移植物进行ex-vivo治疗性修复29,30,31。相较于现有的药物性和非药物性干预策略，热预处理可能具备多项优势。它通过激发细胞内在的综合性内源性反应，可同时针对IRI相关的多种病理生理通路提供保护作用，而其他策略通常仅作用于单一通路。此外，该方法避免了使用药物化合物可能带来的潜在副作用风险。本文旨在详细介绍在受损大鼠肺器官的ex-vivo肺灌注过程中实施热预处理的逐步操作方案，该方案可广泛应用于不同实验场景，特别是可用于大型动物模型或人类肺脏的相关研究。
我们采用大鼠离体灌注肺系统IPL-2进行体外肺灌注（EVLP）。该装置如图1所示，包括以下组成部分：灌注液储液罐（图1-1）；两个滚压泵，分别用于灌注液循环（图1-2A）和灌注液取样（图1-2B）；恒温水浴槽（图1-3），用于维持灌注液温度；膜式气体交换器（图1-4），连接至一个气体钢瓶（图中未显示），钢瓶内气体混合物组成为6% O2、10% CO2和84% N2，用于使流入的灌注液脱氧并碳酸化；两个压力传感器（图1-5），用于监测左心房（LA）和肺动脉（PA）压力（图中未显示肺动脉压力传感器）；一个加热且密封的腔室（图1-6），用于放置心肺组织块，并配有肺动脉、左心房和气管插管的专用接口；一台呼吸机（图1-7），连接至气管插管，用于肺通气以及气道压力和静态肺顺应性的测量；一个电子温度计（图1-8），用于显示肺动脉流入端灌注液的温度。另有一个连接平台（图1-9），其各组件在图2中详细展示：肺动脉（图2-1）、左心房（图2-2）和气管（图2-3）插管接口；连接至称重模块（图2-4），用于连续监测心肺组织块的重量；一个温度传感器（图2-5），用于监测肺动脉流入端的灌注液温度。该循环系统的详细示意图可参见其他文献18。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;通用设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>动脉瘤夹&amp;nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>FE762K</td><td></td></tr><tr><td>气/表面微珠热传感器</td><td>TES Electrical Electronic Corp/Distrelec AG</td><td>TP01/176-67-162</td><td></td></tr><tr><td>钝性拉钩</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>Bulldog Serafines</td><td>精细科学工具</td><td>18051-50</td><td></td></tr><tr><td>注视压缩&amp;nbsp;</td><td>普罗医学</td><td>25404</td><td></td></tr><tr><td>麻醉连接套件</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3076</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>Applimed SA</td><td>6001109</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>B. Braun&amp;nbsp;</td><td>BC165R</td><td></td></tr><tr><td>大鼠面部口罩</td><td>Tem Sega</td><td>PFM0006</td><td></td></tr><tr><td>肝素 5000 U/mL</td><td>B. Braun</td><td>3522430</td><td></td></tr><tr><td>麻醉诱导室</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>50-0116</td><td></td></tr><tr><td>虹膜解剖镊，全弯</td><td>Aesculap</td><td>&amp;nbsp;OC022R</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Provet AG</td><td>2222</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸气 19.3</td><td>罗塔彻医疗</td><td>CV30-310 O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/空气</td><td></td></tr><tr><td>iSTAT4 试剂盒</td><td>Axon lab AG</td><td>03P85-25</td><td></td></tr><tr><td>Ketasol 100 (100 mg/mL)</td><td>Dr. E. Graeub AG</td><td>QN01AX03</td><td></td></tr><tr><td>利斯特剪刀&amp;nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>BC876R</td><td></td></tr><tr><td>微型剪刀，弯型钝头/钝头</td><td>Aesculap&amp;nbsp;</td><td>FM011R</td><td></td></tr><tr><td>显微Adson镊</td><td>精细科学工具</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>微型蚊式止血钳</td><td>精细科学工具</td><td>13011-12</td><td></td></tr><tr><td>Microscop OPMI MDU</td><td>Zeiss</td><td>267067</td><td></td></tr><tr><td>0.9% NaCl&amp;nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>534534</td><td></td></tr><tr><td>23 G × 25 mm 针头</td><td>BD Microlance 4</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>25 G × 25 mm 针头</td><td>BD Microlance 3</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>Perfadex（保存液）</td><td>Xvivo 灌注 AB</td><td>19811</td><td></td></tr><tr><td>60 ml鲁尔锁式灌注注射器</td><td>BD 塑料</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>Rasor</td><td>Aesculap&amp;nbsp;</td><td>GT-421</td><td></td></tr><tr><td>量程</td><td>梅特勒-托利多</td><td>PB602-L</td><td></td></tr><tr><td>4-0 丝线缝合线</td><td>B. Braun</td><td>F1134035</td><td></td></tr><tr><td>5-0 丝线缝合线</td><td>B. Braun</td><td>F1134027</td><td></td></tr><tr><td>Steen（灌注液）</td><td>Xvivo perfusion AB</td><td>19004</td><td></td></tr><tr><td>外科手套</td><td>安塞尔</td><td>93-843</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器，Omnifix-F</td><td>B. Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>Leukofix</td><td>02136-00</td><td></td></tr><tr><td>温度计</td><td>TES Electrical Electronic Corp</td><td>1303</td><td></td></tr><tr><td>含福尔马林的试管&amp;nbsp;</td><td>Biosystems Switzerland AG</td><td>87-0960-00-10113</td><td></td></tr><tr><td>呼吸机（体外肺灌注，EVLP）（根据EVLP方案设定潮气量）</td><td>Flexivent</td><td>FX3</td><td></td></tr><tr><td>呼吸机（肺器官获取）&amp;nbsp; （设定潮气量为：7.69×（体重（kg））^1.04）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>683</td><td></td></tr><tr><td>韦特兰纳拉钩</td><td>B. Braun</td><td>BV073R</td><td></td></tr><tr><td>Xylasol（1 mg/mL）</td><td>Dr. E. Graeub AG</td><td>QN05CM92</td><td></td></tr><tr><td>Yasargil 施加器</td><td>B. Braun</td><td>FE502T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;IPL-2 EVLP 系统&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>正压适配器</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3635</td><td></td></tr><tr><td>AME 14-SC0062 泵管（Tygon），带凸缘三通，每包12根</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-0126</td><td></td></tr><tr><td>AME 24-SC0072 泵管（Tygon），带凸缘三通，每包12根</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-0155</td><td></td></tr><tr><td>用于离体灌注肺（IPL-2）型号829/2的基座单元</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-2266</td><td></td></tr><tr><td>D150 型光纤氧合器连接套件</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3765</td><td></td></tr><tr><td>EBM 水肿平衡模块（EBM）配传感器</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-4626</td><td></td></tr><tr><td>D150型纤维氧合器，5个装</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3762</td><td></td></tr><tr><td>用于5号手术台的主动脉或气管插管夹持器</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3855</td><td></td></tr><tr><td>氧合器支架</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3061</td><td></td></tr><tr><td>HSE体重测量系统</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-4604</td><td></td></tr><tr><td>HSE-BDAS 适用于 Windows 2000、XP 和 Windows 7 的基础数据采集软件</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-1712</td><td></td></tr><tr><td>HSE-USB 数据采集硬件，适用于 Windows 10 或 11 的独立 USB 盒</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3330</td><td></td></tr><tr><td>ISM 827/230 V 滚柱泵 reglo 模拟型，4 通道，0.003–35 ml/min（2 个）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-0114</td><td></td></tr><tr><td>左心房插管（DD 4.0 mm）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-0712</td><td></td></tr><tr><td>微型流通式氧电极，带1/16&quot; 配件（可选）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-4189</td><td></td></tr><tr><td>D150型光纤氧合器支架安装套件</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3759</td><td></td></tr><tr><td>单向止流阀型号9500（肺动脉用一个，左心房用一个）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-0097</td><td></td></tr><tr><td>OPPM plugsys 氧分压模块 型号 697&amp;nbsp; （可选）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-0210</td><td></td></tr><tr><td>Plugsys 基本系统机箱类型 603</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-0045</td><td></td></tr><tr><td>pO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 零溶液 20 包，每包 20 ml&amp;nbsp; （可选）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3812</td><td></td></tr><tr><td>压力传感器P75型379/HSE，量程-75至+75 mm Hg（PA，LA）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-0020</td><td></td></tr><tr><td>肺动脉插管（外径 2.0 mm，头端直径 2.5 mm）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-0711</td><td></td></tr><tr><td>缓冲液储液罐（带夹套）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3496</td><td></td></tr><tr><td>SCP plugsys 灌注型 704 伺服控制器</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-2806</td><td></td></tr><tr><td>用于单个 pO 的屏蔽外壳&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 或 pCO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 微型传感器&amp;nbsp; （可选）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-4196</td><td></td></tr><tr><td>用于单个O型的小型安装板&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 或 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 传感器&amp;nbsp; （可选）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3000</td><td></td></tr><tr><td>TAM-A plugsys 换能器放大模块 705/1 型（一个用于 PA，一个用于 LA）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-0065</td><td></td></tr><tr><td>恒温循环器 E 103（3 L）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-0125</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀型号9560 R（一个用于肺动脉，一个用于左心房）</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-0096</td><td></td></tr><tr><td>带流体管路截止阀的缓冲液储液罐套管组件</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3456</td><td></td></tr><tr><td>通气导管（气管）外径 2.0 mm，长 14 mm</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>73-3384</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;计算机软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>适用于 Windows 2000、XP 和 Windows 7 的 HSE-BDAS 基本数据采集软件</td><td>Hugo Sachs Elektronik- Harvard Apparatus</td><td>V2.0</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>微软</td><td>2502，Microsoft 365</td><td></td></tr><tr><td>Flexiware</td><td>Scireq</td><td>8</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software inc.</td><td>10.0.1</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley 大鼠&amp;nbsp;</td><td>查尔斯河实验室（法国圣日耳曼-努耶勒）&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

热预处理期间 离体 移植前修复受损肺移植物的肺灌注技术

Thermal Preconditioning During Ex-vivo Lung Perfusion for the Rehabilitation of Damaged Lung Grafts before Transplantation

离体肺灌注（ex-vivo lung perfusion, EVLP）在肺移植领域取得了突破性进展，不仅可用于评估供体肺的功能，还可通过治疗性干预修复边缘性肺移植物。再条件化策略包括药物性和非药物性方法。在后者中，我们已证明短暂且可控的热应激（“热预处理”，Thermal Preconditioning, TP）可通过诱导内源性保护性的热休克反应有效恢复受损肺脏功能。本文介绍了一种整合了热预处理的 rats EVLP 模型的逐步操作方案，用于再条件化经历热缺血的肺脏，模拟循环死亡后捐献（donation after circulatory death, DCD）的情况。该方案详细描述了肺脏准备、插管、灌注以及热休克反应的诱导过程。热预处理包括在 EVLP 早期将灌注液温度升高至 41.5 °C 并维持 30 分钟，随后迅速恢复至 37 °C 并持续完成后续灌注。在为期 6 小时的 EVLP 模型中，接受 TP 处理的肺脏（n = 30）相较于对照组（n = 30）表现出更高的热休克蛋白 70 表达水平、改善的静态肺顺应性、减轻的肺水肿、更低的血管性血友病因子（内皮损伤生物标志物）释放以及减轻的组织学损伤。该方案支持对血管阻力、气道压力、肺顺应性和氧合状态进行实时监测，并可用于灌注液及组织样本的分子与形态学分析。此方法具有良好的可重复性和可扩展性，可适用于更大动物或人类的 EVLP 系统，为研究旨在改善移植预后的非药物性干预措施提供了一个实用的转化研究平台。

在整个过程中持续监测肺部生理参数，包括肺动脉压力（PAP）、计算的肺血管阻力以及通气参数，如静态肺顺应性（SPC）和气道峰压（Pmax）。此外，重量模块可通过提供肺内液体积聚的间接指标，用于评估水肿的形成。与对照肺（Ctrl）相比，热预处理（TP）的优势包括在体外肺灌注（EVLP）期间改善SPC（图9A，以各时间点SPC与初始SPC值的比值表示，n = 5/组）以及减少肺重量增加（图9B，n = 5/组）。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。
灌注液可检测多种生物标志物。例如，热预处理与EVLP结束时血管性血友病因子（vWF）——一种内皮细胞生物标志物——的释放量显著降低相关（图9C，n = 5/组，均值 ± 标准误）。
肺组织在体外肺灌注（EVLP）结束时的形态学分析包括组织学和免疫组织化学。苏木精和伊红（H&E）染色示例 &amp; E）染色切片如图所示 图9D，显示经热预处理后肺部组织学损伤减轻，以肺损伤评分表示（图9E，n = 5/组）。评分通过量化每张切片10个视野中的血管周围水肿程度确定（参见实验步骤4.6.1和4.6.2）。对所检测的10张切片中A + B的总和进行加总，用于计算评分31.
EVLP 结束时对肺组织进行的分子分析包括 RNA 或蛋白质表达谱分析。例如，可通过 ELISA 检测可诱导型热休克蛋白 HSP70 的蛋白质表达水平，以显示经热预处理的肺组织中热休克反应的产生（图 9F，显示了不同 EVLP 持续时间的时间过程实验，每个时间点每组 n = 5）。TP 组中 HSP70 的表达在 EVLP 3 小时后达到峰值，即 TP 结束后 90 分钟，并在此后保持稳定直至 EVLP 结束。数据以均值 ± 标准误表示。
<img alt="生物反应器过程示意图，包含发酵罐、层析柱和蠕动泵的生物工艺装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69084/69084fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图1"> 
图1：EVLP平台示意图。（1）用于灌注液的双层壁储液器。（2A）用于灌注液循环的滚压泵。（2B）用于灌注液取样的滚压泵（用于生化检测和气体分析）。（3）恒温水浴。（4）与气瓶（图中未显示）相连的膜式气体交换器。（5）左心房压力传感器。（6）加热并密封的腔室。（7）EVLP呼吸机。（8）温度探头和温度计。（9）心脏-肺组织块的连接平台，其具体组件详见图2。（注：肺动脉压力传感器不可见）<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/69084fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="灌注系统中的静态平衡；流入/流出系统；示意图；器官研究中的流体动力学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69084/69084fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 2"> 
图 2：心肺组织块的连接平台。（1）连接至肺动脉的流入导管。（2）来自左心房的流出导管。（3）气管导管的连接口。（4）重量模块。（5）自行设计的温度探针，牢固地贴附在流入导管上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/69084fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Spectroscopy analysis setup; optical excitation measurement using connected spectroscopy system and laptop." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69084/69084fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 3"> 
图3信号转导/放大器和模拟/数字转换盒。（A）。 肺动脉压换能器/放大器 （B）泵速流量控制器 (C)左心房压力传感器/放大器 (D)肺重量模块 (E)模拟/数字转换器 (F)用于数据显示和记录的个人电脑。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/69084fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="器官灌注系统示意图；器官保存研究中的温度控制装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69084/69084fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 4"> 
图 4：EVLP 期间灌注液的温度维持。(1) 恒温水浴槽。 (2) 带有双层玻璃容器的灌注液储液罐，恒温水浴槽中的水在此循环。 (3) 加热线圈管，位于连接至恒温水浴槽的加热水容器内。 (4) 器官腔室，带有双层玻璃容器，用于从水浴槽引入温水循环。 (5) 电子温度计及自行设计的温度探针，牢固固定于流入导管处。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/69084fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="热应激对蛋白质的影响；图表和表格；温度对细胞过程的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69084/69084fig5.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 5"> 
图 5：确定热预处理的最佳温度。（A）用于评估不同加热温度的离体肺灌注（EVLP）方案。在离体肺灌注（EVLP）60分钟至90分钟期间，灌注液温度升高至所示温度。在EVLP第90分钟时，温度恢复至37 °C，并维持90分钟直至EVLP结束，在此期间进行多种生理和分子指标的检测。（B）不同加热温度对生理和分子参数影响的结果汇总（绿色表示有利影响；红色表示不利影响；橙色表示混合影响）。41.5 °C的加热温度提供了最显著的保护作用。缩写：EVLP = ex-vivo lung perfusion（离体肺灌注）；TP = thermal preconditioning（热预处理）。本图改编自Ojanguren等人的研究21。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/69084fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于心血管手术的器械设置，包括插管、剪刀、镊子；用于输注测量的设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69084/69084fig6.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图6"> 
图6：手术器械。（A）用于摘取心肺组织块的器械：动脉瘤夹持器和动脉瘤微型夹（Yasargil系统）、血管阻断钳、剪刀、显微剪刀、连接在弹性带上的牵开器。（B）体外肺灌注（EVLP）用肺动脉（PA）、左心房（LA）和气管插管。（C）自制的冷灌注液肺冲洗灌注系统。动物肺动脉（PA）水平面与注射器底部之间的距离设定为20 cm。（C）自制支架。（未显示：手术显微镜、呼吸机和麻醉装置）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/69084fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胸外科实验中心脏插管手术步骤的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69084/69084fig7.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图7"> 
图7：手术准备的代表性图像（A）肺动脉周围的预打结线。（B）心脏尖端的预打结线。（C）肺动脉插管上的血管夹（蓝色圆圈）和气管上的动脉瘤夹（红色圆圈）。缩写：PA = pulmonary artery。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/69084fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肺缺血-再灌注时间线、离体肺灌注（EVLP）过程；肺复张、组织保存、取样" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69084/69084fig8.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图8"> 
图8：流程图。 指导本实验方案各阶段操作的主要步骤。图中将离体肺灌注（EVLP）1小时至1.5小时的时间段放大，以显示根据分组（对照组 vs 热预处理组）实施的处理方案。缩写：CI = 冷缺血；EVLP = ex-vivo 肺灌注；PA = 肺动脉；SPC = 静态肺顺应性；TP = 热预处理；WI = 温缺血。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/69084fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静息平衡研究；多组图表与显微图像；SPC比值、重量、vWF数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69084/69084fig9.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图9"> 
图9：热预处理对损伤大鼠肺脏作用的代表性结果。 经1小时温缺血损伤的肺脏在EVLP系统中灌注6小时。在EVLP第60至90分钟期间，一组肺脏接受41.5 °C的热预处理（TP组）。对照组肺脏在整个EVLP过程中维持在37 °C。（A） 静态肺顺应性（SPC），以初始值的比值表示，在对照组（Ctrl，n = 5）和TP组肺脏（n = 5）中的变化。TP组肺脏的SPC保持更佳。（B） EVLP期间对照组（n = 5）和TP组肺脏（n = 5）的重量增加。TP组肺水肿形成显著减少。（C） 与对照组（n = 5）相比，TP组（n = 5）灌注液中内皮细胞生物标志物血管性血友病因子（von Willebrand Factor）的释放受到抑制。（D） EVLP结束时对照组（n = 5）和TP组肺脏（n = 5）的大体及显微（苏木精-伊红染色）形态。（E） 肺损伤评分（用于量化组织学损伤）在TP组（n = 5）中低于对照组（n = 5）。（F） 在对照组和TP组中，于EVLP 1、2、3、4.5和6小时后测定肺组织提取物中诱导型热休克蛋白HSP70的蛋白水平（每组每个时间点n = 5），显示TP组出现显著的热休克反应。TP组HSP70的表达在EVLP 3小时后达到峰值（即热预处理结束后90分钟），此后保持稳定直至EVLP结束。 
所有图表均显示均值 ± 标准误（SEM）。对于时间过程实验（A–C、F），采用双因素方差分析进行统计比较，随后使用Sidak检验分析组间效应，并采用Bonferroni校正分析时间效应（以1小时为参考时间点）。对于肺损伤评分（E），采用Mann-Whitney检验进行统计比较。* p &lt; 0.05（组间差异），† p &lt; 0.05 vs 1小时EVLP。缩写：Ctrl = 对照组；EVLP = ex-vivo 肺灌注；HSP70 = 热休克蛋白70；SPC = 静态肺顺应性；TP = 热预处理。改编自Parapanov等23。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/69084fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
表1：本实验方案中所用溶液的组成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/Table-1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：灌注流量、流入温度（肺动脉插管水平）和通气随时间变化的EVLP设置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/Table-2.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：故障排除。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/Table%203.docx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充文件1：详细说明离体肺灌注系统中信号校准主要步骤的方案，包括肺动脉压力、重量和流量信号的校准。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件2：体外肺灌注期间肺动脉压力、重量和流量信号校准程序的演示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69084/Supplementary%20File%202.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案介绍了一种大鼠 离体 结合短暂暴露于校准热应激的肺灌注模型，可促进内源性保护机制，用于治疗性修复受损肺移植物。该方法具有可扩展性和可重复性，有助于开发非药物疗法以提高肺移植成功率。

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