用于早期癌症检测中个性化蛋白冠分析的标准化SDS-PAGE工作流程

我们研究纳米颗粒与血液的相互作用，以揭示癌症早期迹象，目标是开发一种简单、可重复且主要为非侵入性的诊断检测方法。首先，将浓度为四毫克每毫升的氧化石墨烯纳米片储备液用超纯水稀释至所需浓度。将稀释后的溶液在28%的振幅下超声处理两分钟，脉冲设置为开启八秒、关闭六秒，以确保均匀分散。

使用紫外-可见光谱法测定分散溶液的浓度。然后利用动态光散射技术，采用633纳米氦氖激光器测量溶液的流体动力学粒径和泽塔电位。根据QVet检测限，用超纯水稀释样品。

接下来，根据需要将市售的冻干人血浆用超纯水稀释。在4摄氏度条件下，以18,620 G离心15分钟，使复溶后的血浆沉淀。收集上清液，并于-80摄氏度保存，以备后续使用。

现在，使用二辛可宁酸法测定蛋白质浓度，以调整血浆稀释度并确定纳米颗粒与血浆的最佳比例。将选定体积的纳米颗粒与血浆混合，以达到两者之间的目标比例。在37摄氏度下孵育混合物1小时。

为分离蛋白冠，将纳米颗粒血浆样品在4摄氏度条件下以18,620 G离心15分钟。用200微升超纯水洗涤所得沉淀。然后重新悬浮并再次离心。

最后一次洗涤后，确认存在致密沉淀，以证明已成功分离纳米颗粒-蛋白质复合物。接着，混合还原剂、上样缓冲液和水，以达到计算好的上样缓冲液体积。用配制好的上样缓冲液重悬沉淀。

然后将悬浮液在100摄氏度下煮沸10分钟。将煮沸后的样品在4摄氏度、18,620 ×g 条件下离心15分钟。收集上清液至新离心管中。

现在，通过将分子量标准品与未染色缓冲液和染色缓冲液混合来制备蛋白ladder。将10× Tris-Glycine-SDS电泳缓冲液稀释至1×浓度。使用4%至20%的无染色梯度凝胶组装电泳槽。

然后加入电泳缓冲液，直至达到制造商推荐的液面高度。每个加样孔中加入10微升样品。随后用移液器向每个加样孔中加入7微升蛋白或核酸分子量标准品（ladder）。

在室温下以150伏电压电泳约90分钟。将凝胶图像以tiff文件格式保存至与脚本相同的文件夹中。然后打开凝胶处理程序。

在 MATLAB 中输入凝胶图像的名称作为图像名称，然后输入一个加样槽道（ladder lane）的索引作为标记索引。

运行脚本。命令窗口中将显示步骤完成情况，并在屏幕上弹出四个窗口。现在，打开图一，其顶部为原始凝胶图像，底部为校正倾斜条带效应后的图像。

调整左侧校正和右侧校正的数值，以优化校正参数。打开图二，其上方为已校正倾斜车道效应的图像，下方为去除背景后的图像。

调整脚本中 BKG par X 的值以优化背景去除效果。注意观察，所有已识别的条带在图二中均以垂直的白色线条标示。现在，打开图三，该图包含标记条带的强度分布曲线，左侧显示已检测到的峰，右侧显示非线性拟合结果及 R 平方值。

仔细检查 ladder 泳道中预期条带的数量是否与用于拟合过程的检测峰数量一致。然后打开图四，其中包含凝胶中所有检测泳道的归一化强度分布图。将导出参数设置为 1，以将强度分布图作为分子量函数导出至 Excel 文件中。

运行脚本。完成后，工作文件夹中将生成一个 Excel 表格，其中第一列为分子量，后续列包含相应的绝对强度和归一化后的谱图数据。然后打开 gel profiles pro.m 文件并运行该脚本。

屏幕上将弹出四个窗口。打开图五，其上方显示各泳道的绝对强度分布，下方显示相应的总强度。图六显示各泳道归一化后的强度分布。

根据脚本中指定的 reg 范围对分子量轴进行细分。将导出数据设置为 1，以导出绝对积分面积和归一化积分面积。运行脚本。

完成后，工作文件夹中将生成一个电子表格，其中包含指定分子量范围内导出的绝对面积和归一化面积。最后，打开图七和图八，它们分别按泳道和按面积分组显示了每条泳道的绝对面积和归一化面积的直方图。

本文所介绍的实验方案建立了一种标准化且可重复的工作流程，用于分离和表征纳米颗粒在血浆中孵育后形成的蛋白冠。该方法能够获得高度一致的SDS-PAGE谱图，可有效捕捉每种个性化蛋白冠中具有生物学意义和诊断价值的特征。在所有实验条件下获得的SDS-PAGE谱图均表现出高度可重复性。

血浆浓度从5%增加到50%时，SDS-PAGE图谱中30至80千道尔顿区域的信号强度增强。自动移液工作流程产生了几乎相同的电泳图谱。氧化石墨烯由于其高比表面积和带电特性， consistently 产生分辨率良好且稳定的蛋白冠图谱。

小、中、大三种氧化石墨烯样品的粒径分布均较窄，互不重叠，峰值分别集中在约100、300和750纳米。在不同尺寸的氧化石墨烯上形成的蛋白冠的SDS-PAGE谱图相似。尽管在不同稀释度之间观察到明显差异，但较低的血浆浓度在特定分子量范围内产生更强的条带，表明存在选择性蛋白质富集。

在中等血浆稀释度下，密度度量曲线显示出疾病特异性的差异，尤其是在20至30千道尔顿区域，胰腺导管腺癌（PDAC）样本表现出信号强度降低。仅基于SDS-PAGE的分析模型对PDAC样本和对照样本的识别准确率达到83%，且灵敏度与特异性均衡。结合SDS-PAGE冠状图谱与CA 19-9水平的联合诊断模型，在区分PDAC患者方面达到了最高的准确率、灵敏度和特异性。

我们采用自动化工作流程、非技术依赖性方法以及人工智能驱动的工具，以推动癌症诊断研究。本方案快速、操作简便，符合世界卫生组织（WHO）标准，可确保获得具有显著诊断意义的标准化、可重复的蛋白冠特征图谱。