Name: 个性化蛋白冠状分析的标准化SDS-PAGE工作流程，用于早期癌症检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学习标准化SDS-PAGE蛋白冠状分析方法，用于纳米颗粒与血浆相互作用研究，实现胰腺癌早期诊断。该方法具有可重复、低成本的特点，适用于临床转化研究。

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该研究部分由意大利大学与科研部（MUR）国家补充投资计划资助，该计划由欧盟—下一代欧盟（NextGenerationEU）资助，项目 &#34;D3 4 HEALTH—面向可持续医疗保健的数字驱动型诊断、预后与治疗&#34;PNC0000001，主题线3 第2项，任务4，组成部分2 CUP：B53C22006120001。本研究还得到了AIRC基金会IG 2020-ID. 24521项目（项目负责人：Pozzi Daniela）的资助。

本方案提供了制备纳米颗粒（NP）、与人血浆（HP）孵育、分离以及分析在各类纳米颗粒表面形成的蛋白冠（PC）的详细且标准化的操作流程。图2以图示形式展示了整个实验流程，涵盖了从纳米颗粒合成到蛋白质谱的多变量SDS-PAGE分析的各个连续实验步骤。重要的是，本研究团队已在先前的研究中对该方法进行了标准化18,26，以确保实验结果的可重复性和可靠性。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 纳米颗粒的制备与表征
<ol>
	<li>氧化石墨烯纳米片
	<ol>
		<li>将浓度为 4 mg/mL 的储备液用超纯水稀释至所需浓度。在 28% 振幅下超声处理 2 分钟（脉冲：0.8/0.6 秒），以确保充分分散。</li>
		<li>使用紫外-可见光谱法测定浓度。</li>
		<li>采用 633 nm 氦-氖激光器通过动态光散射（DLS）测量流体动力学粒径和泽塔电位。根据比色皿的检测限，用超纯水稀释样品进行制备（例如，1 mL 比色皿采用 1:100 稀释）。记录三次重复实验的平均值 ± 标准差（SD）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>金纳米颗粒
	<ol>
		<li>直接使用柠檬酸盐稳定的 100 nm 金纳米颗粒（原液浓度：3.8E+9 个颗粒/mL），无需进一步修饰。</li>
		<li>采用 633 nm 氦-氖激光器通过动态光散射（DLS）测量流体动力学粒径和泽塔电位。根据比色皿的检测限，用超纯水稀释样品进行制备（例如，1 mL 比色皿采用 1:100 稀释）。记录三次重复实验的平均值 ± 标准差（SD）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DOTAP 脂质体
	<ol>
		<li>在穿戴适当个人防护装备（实验服、手套、护目镜）的情况下，在经认证的化学通风橱内将 1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）粉末溶于氯仿中。在真空条件下蒸发 2 小时，用超纯水重悬脂质膜至终浓度为 1 mg/mL，并在 4 °C 下水合过夜。最后，将脂质体溶液通过 0.1 µm 聚碳酸酯滤膜挤出 20 次。</li>
		<li>采用 633 nm 氦-氖激光器通过动态光散射（DLS）测量流体动力学粒径和泽塔电位。根据比色皿的检测限，用超纯水稀释样品进行制备（例如，1 mL 比色皿采用 1:100 稀释）。记录三次重复实验的平均值 ± 标准差（SD）。 
		警告：操作氯仿时必须在通风橱内并穿戴全套个人防护装备。有机溶剂废液应按照机构化学品安全规程进行处置。 
		注：对于粒径分布中心约为 300 nm 的氧化石墨烯，需在 125 W 条件下超声处理 10 分钟，随后在 4 °C 下以 7,700 × g 离心 30 分钟，收集上清液，再以 18,620 × g 离心 30 分钟，重悬沉淀。对于粒径分布中心约为 100 nm 的氧化石墨烯，需在 4 °C 下分三次各超声处理 180 分钟，每次超声后在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 30 分钟，并收集最终上清液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人血浆的制备
<ol>
	<li>商用人血浆（HP）
	<ol>
		<li>根据需要，用超纯水稀释商用冻干血浆。</li>
		<li>将重悬后的血浆在 4 °C 条件下以 18620 × g 离心 15 分钟，收集上清液并储存在 -80 °C，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>患者来源的人血浆（HP）
	<ol>
		<li>将血液样本在 4 °C 条件下以 1216 × g 离心 10 分钟，收集上清液用于血浆分离。</li>
		<li>将 450 µL 血浆分装至 0.5 mL 低蛋白结合管中，并在 -80 °C 保存，直至使用。 
		注意：所有人血浆样本的采集均遵循机构伦理指南，并已从所有参与者处获得知情同意。 
		警告：人血浆具有生物危害性。操作时应在生物安全柜（BSC）内佩戴手套、实验服和护目镜进行。所有含血浆的材料应按照机构的生物安全和废弃物处理规定进行处置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. PC 的形成
<ol>
	<li>手动液体处理
	<ol>
		<li>通过定量蛋白质浓度确定最佳纳米颗粒：血浆比例 通过 使用二辛可宁酸（BCA）法测定以调整血浆稀释度。</li>
		<li>将100 µL NP悬液加入100 µL血浆中，以达到所需的血浆浓度。</li>
		<li>37 °C 下孵育 1 小时。 
		注意：进行BCA测定前，将试剂A与试剂B按50:1比例混合，配制BSA标准品稀释液。每孔加入10–25 µL样品或标准品，再加入200 µL工作液，37 °C孵育30分钟，于562 nm波长处测定吸光度。血浆浓度通常根据纳米颗粒（NP）类型调整为相对于NP体积的0.5%至50%（v/v）。对于氧化石墨烯（GO）纳米颗粒，建议使用较低浓度（0.5%至5%）；对于DOTAP/金纳米颗粒，可使用较高浓度（最高达50%）。实验过程中请使用1.5 mL低吸附蛋白管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>自动孵育方案
	<ol>
		<li>将液体处理软件程序加载到自动移液平台（20 µL + 200 µL 头）上</li>
		<li>将每种纳米颗粒各100 µL分装至低吸附1.5 mL离心管中。</li>
		<li>根据以下公式加入按 2.1 和 2.2 步骤制备的重建血浆： 
		其中 VNP 为纳米颗粒悬液的体积。对于 100 µL 的纳米颗粒悬液： 
		<img alt="Hydroponics nutrient calculation formula, HP(volume) equation for solution concentration." src="/files/ftp_upload/69090/69090eq1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Equation 1"> 
		5%：5.3 µL HP 
		20%：25 µL HP 
		50%：100 µL HP</li>
		<li>加入超纯水至终体积为 200 µL： 
		5%：94.7 µL 
		20%：75 µL 
		50%：无</li>
		<li>混合样品： 
		5%：15 µL 扩增循环 
		20%：50 µL 循环 
		50%：100 µL 循环 3.2.6。在 37 °C 下孵育 1 小时 
		注意： 补充图1 展示了用于制备三种终浓度血浆混合物（5%、20% 和 50% v/v，每种浓度设三个重复）的自动化系统的图形化界面。甲板布局包括移液 tip 盒、废液槽以及一个 3 × 4 的低吸附管架，管架中包含纳米颗粒悬浮液（GO、金纳米球和 DOTAP 脂质体）（NP）、人血浆（HP）和超纯水（H2O）。使用低吸附蛋白管。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过SDS-PAGE进行PC分析
<ol>
	<li>PC 分离
	<ol>
		<li>将 NP-HP 样品在 18,620 × g、4 °C 条件下离心 15 分钟。离心管底部应可见明显沉淀。小心弃去上清液，上清液应澄清透明后再进行后续操作（参见补充图 2）。</li>
		<li>用 200 µL 超纯水洗涤沉淀，重悬后再次离心。重复此步骤两次。最后一次洗涤后，仍应可见致密沉淀，以确认成功分离出 NP-蛋白复合物（参见补充图 2）。</li>
		<li>制备上样缓冲液（LB）：</li>
		<li>根据血浆条件计算总 LB 体积，并混合还原剂（1:10）、SDS 样品缓冲液（1:2）以变性蛋白质，以及水。</li>
		<li>用适当体积的 1× LB 重悬沉淀，并在 100 °C 下煮沸 10 分钟。</li>
		<li>在 18,620 × g、4 °C 条件下离心 15 分钟，收集上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SDS-PAGE 上样
	<ol>
		<li>通过将分子量（MW）标准品与上样缓冲液稀释来制备蛋白 Marker。</li>
		<li>将 10× Tris/Glycine/SDS 电泳缓冲液稀释至 1×。</li>
		<li>组装电泳槽，装入 4%–20% 无染料梯度凝胶，并加入电泳缓冲液至制造商推荐的液面高度。</li>
		<li>每孔上样 10 µL 样品和 7 µL Marker。在室温下以 150 V 电泳约 90 分钟。 
		注意：LB 体积应根据步骤 3.1.1 中选择的血浆浓度进行计算，以确保凝胶图像中蛋白条带的最佳可视化效果（通常为 20 µL LB 中含 10 µg 蛋白）。 
		注意：为获得最佳重复性，应使用新鲜制备的 NP-血浆样品进行 SDS-PAGE 分析。洗涤后的沉淀在 -80 °C 保存 24 小时会导致理化性质（重悬后经 DLS/ζ 电位测量）和蛋白冠指纹图谱（当沉淀从本方案第 4.3.1 步开始处理时）出现可检测的变化（参见补充图 3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 蛋白质谱型分析
<ol>
	<li>图像处理
	<ol>
		<li>使用化学发光成像仪对凝胶进行成像。</li>
		<li>按以下步骤处理凝胶图像：
		<ol>
			<li>导入凝胶图像并将其保存为TIFF文件，校正不良效应（例如特别影响边缘泳道的倾斜条带畸变）。检测所有凝胶泳道，并从图像中扣除背景信号。</li>
			<li>基于标记物泳道的双项指数拟合，将垂直位移的像素单位校准为分子量单位。生成图形化输出，以可视化强度分布曲线及各泳道特异性的信号分布。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>导出处理后的数据，即计算得到的一维分布曲线。</li>
		<li>通过归一化分布曲线计算分子量分布，并针对每个泳道在指定的分子量范围内计算积分面积。</li>
		<li>导出输出数据，即在指定分子量范围内的积分面积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于诊断的多变量分析
	<ol>
		<li>应用线性判别分析（LDA）或其他多变量方法进行分类分析。</li>
		<li>计算准确率、灵敏度、特异性，并进行ROC分析。 
		注意：用于图像处理、曲线归一化、拟合和分类的脚本可从27获取，相应的用户手册也在该处提供。 
		警告：处理人源血浆时须遵守生物安全操作规程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Quagliarini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+the+liposome-protein+corona%3A+Lessons+learned+and+future+breakthroughs+in+theranostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">A decade of the liposome-protein corona: Lessons learned and future breakthroughs in theranostics.</a> Nano Today. 47, 101657(2022).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

不同纳米颗粒类型的实验方法通用性与可重复性
本文所述方案为在纳米颗粒（NP）与人血浆（HP）孵育后形成的蛋白冠（PC）的分离与表征提供了标准化且可重复的操作流程。如先前及当前研究33所示，该方法能够生成基于SDS-PAGE的分子指纹图谱，捕捉个性化蛋白冠中具有生物学和诊断学意义的特征。手动与自动化操作流程之间观察到的一致性，解决了蛋白冠研究中的一个核心难题：最大限度减少技术性及操作者依赖性带来的变异性。正如Giulimondi等26所强调，操作者偏倚和操作流程的异质性长期以来阻碍了该领域的标准化进程。研究结果表明，在受控条件下，这些变量可被有效降低，同时不损害数据质量。
该方案与自动化移液平台的兼容性对于未来的临床转化和高通量应用尤为重要。该方案能够在具有不同表面电荷和相互作用倾向的多种纳米颗粒类型之间产生可重复的图谱，进一步证明了其广泛的适用性。综上所述，这些结果提供了有力证据表明：（1）该方案在...

纳米颗粒蛋白冠（NP-PC）
在纳米颗粒（NPs）暴露于生物流体后，其表面形成的蛋白冠（PC）的表征已成为疾病诊断和个性化医疗的一种强大策略1。这一吸附蛋白层在组成上具有动态性和疾病特异性，能够改变纳米颗粒的合成特性，并主导其生物学相互作用2。蛋白冠的组成并非随机形成，而是高度依赖于纳米颗粒的理化性质及其所处的生物环境3。纳米颗粒的尺寸、形状、表面电荷和组成等因素可显著影响吸附蛋白的亲和力、动力学行为及其结构排列。同样，生物流体的来源、复杂程度及其所处的疾病状态，也在决定蛋白冠最终组成方面发挥着关键作用4,5,6。
冠状结构的动态特性进一步增加了其分析的复杂性，因为其构型会随时间从松散结合的柔软外层逐渐演变为更稳定且紧密结合的内核7,8。这种由竞争性蛋白质吸附事件所导致的动态结构演变，需要采用时间分辨且标准化的方法才能进行有意义的表征9。尽管存在这些复杂性，目前普遍认为，蛋白冠（PC）并非单纯的实验假象，而是一种具有生物学信息价值的界面层，能够以非侵入性方式捕获系统性疾病的改变。本文所述方法的目标是标准化SDS-PAGE在个性化蛋白冠稳健、可重复且可及的图谱分析中的应用，尤其旨在通过液体活检策略实现癌症的早期检测10。
个性化PC及其在癌症检测中的相关性
该方法的科学依据在于个性化蛋白冠（personalized PC）的概念。当纳米颗粒（NPs）与患者血浆共孵育时，会吸附一层独特的蛋白质指纹，反映个体的生理或病理状态11,12。这一概念已得到多项研究的支持，这些研究表明，在疾病存在的情况下，蛋白冠的组成发生显著改变，包括胰腺导管腺癌（PDAC）、肺癌13、脑膜瘤14和多形性胶质母细胞瘤15。具体而言，在PDAC中，来源于患者血浆的蛋白冠与健康供体的蛋白冠存在显著差异。这些差异已被用于构建分类模型，诊断准确率最高可达90%。因此，蛋白冠可作为疾病特异性信号的纳米级富集器16。
近期研究发现，癌症患者的血小板（PCs）中富含参与炎症、凝血、补体激活及细胞外囊泡运输的蛋白质，这些生物学通路已知在恶性肿瘤中存在失调。17这些蛋白质模式在相同患者类别中具有高度可重复性，而在不同疾病状态下则明显不同，表明蛋白冠不仅可作为通用的疾病传感器，还能作为特定疾病的分类工具。在胰腺导管腺癌（PDAC）这一最致命且最具隐匿性的恶性肿瘤之一的背景下，本研究团队率先开发了基于蛋白冠特征分析的纳米颗粒增强血液（NEB）检测方法。18,19,20这种微创方法利用纳米颗粒富集低丰度及疾病相关血浆蛋白的能力，使其可被检测到 通过 简单、台式电泳分离
相较于传统蛋白质组学技术的优势
开发该方法的依据源于传统蛋白质组学技术（如质谱法（MS））的局限性。尽管质谱法能够实现深度的蛋白质组覆盖，但其成本高昂、耗时较长，且不适用于高通量筛选或现场即时诊断21。另一个关键挑战在于质谱技术本身固有的复杂性，样品制备、仪器校准、采集参数以及数据分析流程的差异，均会导致不同实验室间所报告的蛋白质组（PC）组成存在显著差异22。相比之下，对蛋白质组进行SDS-PAGE分析可快速且经济地捕捉与疾病相关的蛋白质组模式。尤为重要的是，SDS-PAGE的读数并不依赖于对单个生物标志物的绝对鉴定，而是基于对整体蛋白质谱系统性变化的检测，这些变化可通过密度测定和多元统计方法进行分析。
与基于抗体的检测方法不同，后者局限于已知靶标且易发生交叉反应，而SDS-PAGE能够无偏倚地呈现蛋白质的整体图谱，保持原始样本的完整性，并可与LC-MS/MS等互补技术平台联用，实现蛋白质鉴定。此外，由于SDS-PAGE无需样本分级或去高丰度蛋白等预处理步骤，因此特别适用于分析微量生物样本，这一特性在早期诊断或脆弱人群筛查等应用中至关重要23。基于上述诸多优势，本实验方案符合世界卫生组织（WHO）提出的REASSURED标准（实时 connectivity、样本采集简便、成本低廉、高灵敏度、高特异性、操作友好、结果稳健、无需专用设备、易于推广），使其成为可扩展诊断应用中的实用工具24。基于以上证据，我们提出假设：将纳米颗粒（NPs）与患者血浆共同孵育后，其表面会吸附形成一种可重复且具有疾病特异性的蛋白冠（PC），该蛋白冠可通过SDS-PAGE进行系统性分析。我们进一步提出，对这些个体化蛋白冠进行标准化电泳分析，能够区分癌症患者与健康个体，从而提供一种稳健且具有临床转化潜力的诊断工具。
工作流程与临床适用性
基于SDS-PAGE的蛋白冠分析流程系统化地规范了每一步操作：从纳米颗粒（NPs）的制备及其与稀释血浆的孵育，到蛋白冠的分离、凝胶电泳以及定量的密度分析（图1）。关键参数如孵育时间、血浆稀释度和纳米颗粒类型25均经过精细优化，以确保实现最佳的蛋白质捕获效果和凝胶图像分辨率。该方案还考虑了实际应用中的多个因素，如样本通量、储存稳定性以及批次间的一致性26。此外，由于SDS-PAGE是一种非破坏性技术，可无缝结合质谱（MS）等互补性蛋白质组学方法，用于鉴定单个蛋白条带的分子组成15。该工作流程已优化为具有高操作者间重复性，适用于手动和自动化移液平台，并在不同纳米颗粒化学性质和血浆浓度条件下均表现出良好的稳健性。这些特性确保该方法可广泛应用于多种实验室环境，既适用于集中式诊断中心，也适用于分散式研究实验室。因此，该技术特别适合从事早期诊断、生物标志物发现和转化纳米医学研究的科研人员与临床医生。该方法可应用于多种疾病类型，并可扩展至除血浆外的其他生物流体，如唾液或尿液。本方案的灵活性与稳健性使其成为临床验证流程、大规模筛查研究以及即时检测平台的理想候选技术。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 蛋白质低吸附 LoBind 管</td><td>eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/甘氨酸/SDS</td><td>Biorad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Labortechnik</td><td>Z 216 MK Hermle</td><td>在 4 &amp;deg;C 条件下以 18,620 RCF 离心 20 分钟</td></tr><tr><td>ChemiDoc 成像系统</td><td>Bio-Rad</td><td>12003153</td><td>用于凝胶图像采集</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432-1L</td><td>DOTAP 的溶剂</td></tr><tr><td>Corning 1-200 &amp;micro;L 通用适配散装包装移液器吸头</td><td>corning</td><td>4845</td><td></td></tr><tr><td>Criterion TGX 免染预制聚丙烯酰胺凝胶</td><td>Biorad</td><td>5678095</td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水 6 × 1 L</td><td>thermo fisher</td><td>15230001</td><td></td></tr><tr><td>DOTAP (1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>890890P-200mg</td><td>用于制备阳离子脂质体；溶于氯仿，蒸发，水合并挤出</td></tr><tr><td>Enduro 300V 电源&amp;nbsp;</td><td>Labnet&amp;nbsp;</td><td>E0303-230V</td><td></td></tr><tr><td>GloMax Discover 微孔板读板仪</td><td>Promega</td><td>GM3000</td><td></td></tr><tr><td>金纳米颗粒（柠檬酸盐稳定）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>742031-25ML</td><td>作为纳米材料使用；未经进一步纯化直接使用</td></tr><tr><td>梯度聚丙烯酰胺凝胶 (4&amp;ndash;20% TGX)</td><td>Bio-Rad</td><td>5678095</td><td>用于 SDS&amp;ndash;PAGE</td></tr><tr><td>Grant Instrument&amp;nbsp;Thermoshaker HC24N（24 × 1.5 mL 微量离心管）</td><td>Fisher scientific</td><td>PHMT-PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>氧化石墨烯 (GO) 溶液</td><td>Graphenea</td><td>GO-4-1000</td><td>作为纳米材料使用；稀释至 0.25 mg/mL 并进行超声处理</td></tr><tr><td>人血浆 (HP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9523-5ML</td><td>用于纳米颗粒孵育</td></tr><tr><td>ImageLab 软件</td><td>Bio-Rad. 版本 6.1.0.07</td><td>/</td><td>用于将凝胶图像导出为 tiff 文件</td></tr><tr><td>Laemmli 上样缓冲液 2x</td><td>Biorad</td><td>1610737</td><td>用于重悬沉淀物</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks. 版本 R2022a</td><td>/</td><td>用于图像处理、数据分析和轮廓计算</td></tr><tr><td>Mini-Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610020</td><td>用于脂质体制备</td></tr><tr><td>NuPAGE 样品还原剂 (10X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP004</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Corning&amp;nbsp;</td><td>21-031-cm</td><td>用于 DOTAP-HP 样品</td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒，1 套（1 L）</td><td>ThermoFisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>透明移液器吸头 0.5–10 µL</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN L P10L，0.5–10 &amp;micro;L，金属弹射器</td><td>Gilson</td><td>FA10002M</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN P20，2–20 &amp;micro;L，金属弹射器</td><td>Gilson</td><td>F144056M</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN P200，20–200 &amp;micro;L，金属弹射器</td><td>Gilson</td><td>F144058M</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAX 自动移液系统</td><td>Gilson</td><td>GSYS0021</td><td>用于自动化样品处理</td></tr><tr><td>聚碳酸酯滤膜 (0.1 &amp;micro;m)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610005-1EA</td><td>用于脂质体挤出</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein 全蓝预染蛋白标准品</td><td>Biorad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein 未染色标准品&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>1610363EDU</td><td></td></tr><tr><td>Vibra cell 超声破碎仪 VC505</td><td>Sonics and Materials inc.</td><td>VC505</td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer</td><td>Malvern</td><td>ZS90</td><td>用于动态光散射 (DLS) 和微电泳 (ME) 测量</td></tr></tbody></table>

用于早期癌症检测中个性化蛋白冠分析的标准化sds-page工作流程

Standardized SDS-PAGE Workflow for Personalized Protein Corona Profiling in Early Cancer Detection

纳米颗粒（NPs）在接触生物流体后形成个性化的蛋白质冠（PC），这一现象已成为一种极具前景的、用于早期癌症检测的微创策略。本研究介绍了一种利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对蛋白质冠进行分析的标准操作流程，该流程经过优化，以确保其稳健性、可重复性和自动化潜力。该方法在多种纳米颗粒（NP）平台、血浆来源和实验条件下均经过严格验证，展现出高度一致的可重复性，且操作者依赖性变异极小。与传统的蛋白质组学技术相比，该方法更快速、成本更低，符合世界卫生组织（WHO）对诊断工具提出的REASSURED标准。在应用于胰腺导管腺癌（PDAC）——一种早期生物标志物极为有限的高度侵袭性恶性肿瘤时，该工作流程在早期患者中仍实现了高达90%的分类准确率。这一标准化平台标志着向可规模化、临床可转化且经济可行的癌症筛查诊断工具迈出了重要一步。

标准化PC实验面临的主要挑战之一在于尽量减少技术性因素和操作者依赖性带来的变异性，这一点此前已有研究指出26。关于实验变量（如操作者偏差以及自动化工具对可重复性的影响）的作用，目前仍存在尚未解决的问题18,28。
首先，本研究对所提出方案的稳健性和可重复性进行了系统性评估。研究目的有两个方面：（i）评估不同操作人员使用手动或自动化移液系统所获得SDS-PAGE图谱的一致性；（ii）评估该方案在不同纳米颗粒化学性质和生物流体条件下的适用性。
为了评估所提出方案的可重复性和通用性，该方案在三种具有不同理化性质的纳米颗粒（NP）体系中进行了测试：氧化石墨烯（GO）、金纳米颗粒...

本方案对纳米颗粒上个性化蛋白冠的SDS-PAGE分析进行了标准化，可实现对癌症特异性标志物的可重复、可扩展且低成本的检测。该方法专为胰腺导管腺癌的早期诊断而设计，为科研和临床环境中的复杂蛋白质组学方法提供了一种切实可行且符合REASSURED标准的替代方案。

用于早期癌症检测中个性化蛋白冠分析的标准化SDS-PAGE工作流程

纳米颗粒（NPs）在接触生物流体后表面形成个性化蛋白冠（PC），已成为一种极具前景的、微创的……

我们研究纳米颗粒与血液的相互作用，以揭示癌症早期迹象，目标是开发一种简单、可重复且主要为非侵入性的诊断检测方法。首先，将浓度为四毫克每毫升的氧化石墨烯纳米片储备液用超纯水稀释至所需浓度。将稀释后的溶液在28%的振幅下超声处理两分钟，脉冲设置为开启八秒、关闭六秒，以确保均匀分散。使用紫外-可见光谱法测定分散溶液的浓度。然后利用动态光散射技术，采用633纳米氦氖激光器测量溶液的流体动力学粒径和泽塔电位。根据QVet检测限，用超纯水稀释样品。接下来，根据需要将市售的冻干人血浆用超纯水稀释。在4摄氏度条件下，以18,620 G离心15分钟，使复溶后的血浆沉淀。收集上清液，并于-80摄氏度保存，以备后续使用。现在，使用二辛可宁酸法测定蛋白质浓度，以调整血浆稀释度并确定纳米颗粒与血浆的最佳比例。将选定体积的纳米颗粒与血浆混合，以达到两者之间的目标比例。在37摄氏度下孵育混合物1小时。为分离蛋白冠，将纳米颗粒血浆样品在4摄氏度条件下以18,620 G离心15分钟。用200微升超纯水洗涤所得沉淀。然后重新悬浮并再次离心。最后一次洗涤后，确认存在致密沉淀，以证明已成功分离纳米颗粒-蛋白质复合物。接着，混合还原剂、上样缓冲液和水，以达到计算好的上样缓冲液体积。用配制好的上样缓冲液重悬沉淀。然后将悬浮液在100摄氏度下煮沸10分钟。将煮沸后的样品在4摄氏度、18,620 ×g 条件下离心15分钟。收集上清液至新离心管中。现在，通过将分子量标准品与未染色缓冲液和染色缓冲液混合来制备蛋白ladder。将10× Tris-Glycine-SDS电泳缓冲液稀释至1×浓度。使用4%至20%的无染色梯度凝胶组装电泳槽。然后加入电泳缓冲液，直至达到制造商推荐的液面高度。每个加样孔中加入10微升样品。随后用移液器向每个加样孔中加入7微升蛋白或核酸分子量标准品（ladder）。在室温下以150伏电压电泳约90分钟。将凝胶图像以tiff文件格式保存至与脚本相同的文件夹中。然后打开凝胶处理程序。在 MATLAB 中输入凝胶图像的名称作为图像名称，然后输入一个加样槽道（ladder lane）的索引作为标记索引。运行脚本。命令窗口中将显示步骤完成情况，并在屏幕上弹出四个窗口。现在，打开图一，其顶部为原始凝胶图像，底部为校正倾斜条带效应后的图像。调整左侧校正和右侧校正的数值，以优化校正参数。打开图二，其上方为已校正倾斜车道效应的图像，下方为去除背景后的图像。调整脚本中 BKG par X 的值以优化背景去除效果。注意观察，所有已识别的条带在图二中均以垂直的白色线条标示。现在，打开图三，该图包含标记条带的强度分布曲线，左侧显示已检测到的峰，右侧显示非线性拟合结果及 R 平方值。仔细检查 ladder 泳道中预期条带的数量是否与用于拟合过程的检测峰数量一致。然后打开图四，其中包含凝胶中所有检测泳道的归一化强度分布图。将导出参数设置为 1，以将强度分布图作为分子量函数导出至 Excel 文件中。运行脚本。完成后，工作文件夹中将生成一个 Excel 表格，其中第一列为分子量，后续列包含相应的绝对强度和归一化后的谱图数据。然后打开 gel profiles pro.m 文件并运行该脚本。屏幕上将弹出四个窗口。打开图五，其上方显示各泳道的绝对强度分布，下方显示相应的总强度。图六显示各泳道归一化后的强度分布。根据脚本中指定的 reg 范围对分子量轴进行细分。将导出数据设置为 1，以导出绝对积分面积和归一化积分面积。运行脚本。完成后，工作文件夹中将生成一个电子表格，其中包含指定分子量范围内导出的绝对面积和归一化面积。最后，打开图七和图八，它们分别按泳道和按面积分组显示了每条泳道的绝对面积和归一化面积的直方图。本文所介绍的实验方案建立了一种标准化且可重复的工作流程，用于分离和表征纳米颗粒在血浆中孵育后形成的蛋白冠。该方法能够获得高度一致的SDS-PAGE谱图，可有效捕捉每种个性化蛋白冠中具有生物学意义和诊断价值的特征。在所有实验条件下获得的SDS-PAGE谱图均表现出高度可重复性。血浆浓度从5%增加到50%时，SDS-PAGE图谱中30至80千道尔顿区域的信号强度增强。自动移液工作流程产生了几乎相同的电泳图谱。氧化石墨烯由于其高比表面积和带电特性， consistently 产生分辨率良好且稳定的蛋白冠图谱。小、中、大三种氧化石墨烯样品的粒径分布均较窄，互不重叠，峰值分别集中在约100、300和750纳米。在不同尺寸的氧化石墨烯上形成的蛋白冠的SDS-PAGE谱图相似。尽管在不同稀释度之间观察到明显差异，但较低的血浆浓度在特定分子量范围内产生更强的条带，表明存在选择性蛋白质富集。在中等血浆稀释度下，密度度量曲线显示出疾病特异性的差异，尤其是在20至30千道尔顿区域，胰腺导管腺癌（PDAC）样本表现出信号强度降低。仅基于SDS-PAGE的分析模型对PDAC样本和对照样本的识别准确率达到83%，且灵敏度与特异性均衡。结合SDS-PAGE冠状图谱与CA 19-9水平的联合诊断模型，在区分PDAC患者方面达到了最高的准确率、灵敏度和特异性。我们采用自动化工作流程、非技术依赖性方法以及人工智能驱动的工具，以推动癌症诊断研究。本方案快速、操作简便，符合世界卫生组织（WHO）标准，可确保获得具有显著诊断意义的标准化、可重复的蛋白冠特征图谱。

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

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