Rup（RNA-seq 可用性评估流程）— 真核生物批量 RNA-seq 实验的质量控制

我们开发了创新的生物信息学工具，以简化、自动化并整合高通量实验的数据分析。我们利用高通量测序、先进的生物信息学软件以及强大的计算基础设施，实现系统的生物学分析。首先，使用 Bioconductor 包管理器安装所有必需的 R 软件包。

创建一个源文件夹，用于整理分析所需的输入文件。将参考基因组序列以FASTA格式添加为ReferenceGenome.fa，并存入该文件夹中。

将名为 ReferenceAnnotation.gtf 的基因模型注释文件添加到同一文件夹中。可选地，将 rRNA 基因注释作为名为 ReferenceRRNA.gtf 的 GTF 文件一并包含。

将所有测序读段以压缩的 FASTQ 文件格式放入名为 Reads 的文件夹中。确保每个文件遵循命名格式。然后根据所使用的测序方法设置分析参数。

为了评估序列质量，使用 Rsubread 软件包根据基因组 FASTA 文件构建参考基因组的索引。针对每个样本，使用 align 函数迭代并将测序读段比对至参考基因组。将生成的比对文件以 bam 格式存储在输出文件夹中。

现在使用特征计数功能来统计比对到每个基因的读段。注释文件应为 GTF 格式。确保仅统计在基因组上具有唯一比对位置的读段。

使用 RRNA 基因 GTF 文件，通过 feature counts 功能统计比对到 RRNA 基因的读段数量。允许将多重比对的读段包含在该统计中。获取 feature counts 功能为每个样本生成的读段分配统计结果。

这些统计数据包括被分类为已分配、未比对、多重比对及其他类别的读段数量。单独收集核糖体 RNA 基因分配的统计数据。然后生成柱状图，以可视化展示前述步骤中的读段比对统计结果。

根据分配给基因的读段数量对基因进行分组。将分类结果以柱状图形式展示。样本 S2R1 在修剪前后读段数量均较低。

与样本 S2R2 的原始读段数量相比，其修剪后的读段数量明显减少，表明在修剪过程中去除了低质量的读段。比对分析发现了读段分配中的问题。样本 S2R3 出现了大量多重比对的读段以及较高比例的核糖体 RNA 读段。

在样本 S2R4 中，有大量比例的测序读段未能比对到参考基因组，提示可能存在非目标生物序列的污染。样本 S2R1 至 S2R4 中，被分配到超过 100 条读段的基因数量较少。在相关性热图中，样本 S2R5 与样本 S1 的重复样本聚类在一起，而样本 S1R5 与样本 S2 的重复样本聚类在一起，表明可能存在重复样本标签混淆的错误。

我们解决了RNA-Seq中缺失的质量控制问题，确保在下游基因表达分析之前进行可靠的数据评估。我们的工具整合了多种质量指标，为生物学家提供便捷、自动化且可重复的RNA-Seq评估。该工具能够探索RNA-Seq质量如何影响生物学解释，为透明且可重复的转录组学研究铺平道路。