淀粉样蛋白与交叉β结构

本研究采用X射线纤维衍射技术来探究交叉β淀粉样纤维的结构及其分子排列方式。该方案利用X射线纤维衍射来确认交叉β特征图谱，并阐明纤维的结构架构。该方案可实现对淀粉样纤维的结构分析，从验证交叉β排列到进一步揭示其分子细节。

首先，将蛋白质或肽类原纤维进行排列，以形成纤维轴理想情况下完全平行的束状结构。使用加热板将石蜡加热至完全熔化。用玻璃切割器将1毫米直径的硼硅酸盐玻璃毛细管切割成约2-3厘米长。

将切割好的毛细管短暂浸入液态石蜡中，然后利用毛细作用使石蜡上升至毛细管内部约1-2毫米处。接着使用橡皮泥将密封的毛细管水平固定在培养皿内。

保持毛细管填充石蜡的两端之间有0.5-2毫米的间隙。用移液器小心地在两根毛细管填充石蜡的末端之间悬挂一滴10微升的纤维溶液。盖上培养皿，以保护样品免受灰尘污染，并静置过夜使其蒸发。

然后密封平板，以帮助维持受控的干燥环境。为了在玻璃毛细管中排列淀粉样纤维，将一个1毫升注射器通过橡胶管连接到直径为0.7毫米的硅化玻璃毛细管的宽端。将2-3厘米的纤维悬浮液吸入毛细管中。

使用熔化的石蜡将毛细管的一端密封，另一端保持开放以允许蒸发。将毛细管垂直放置，使其干燥直至形成干燥的圆盘状结构。为了将原纤维排列成膜状或薄膜，将高浓度的原纤维样品置于载玻片上，并在空气中干燥24小时之前覆盖盖玻片。

小心地将原纤维束样品安装在测角头上，并调整其方向，使X射线束穿过该纤维束。若使用原纤维膜样品，则应调整其方向，使X射线束穿过膜的边缘。在配备交叉偏振器的光学显微镜下观察样品，以检测双折射现象。

根据样品是纤维束、薄片还是圆盘，将其置于X射线束中。使用实验室X射线设备或同步辐射光源采集衍射图谱。进行数据分析时，将文件上传至CLEARER衍射图谱分析软件。

转到“衍射图样”和“衍射设置”以输入衍射参数，包括像素尺寸、X射线源和样品到探测器的距离。点击“图像处理”和“旋转”，将衍射图像旋转至子午线呈垂直方向。通过转到“衍射图样”并点击“图像居中”使用居中模块，使图像居中。

定义子午线和赤道轴。保存居中的图像以供后续分析。接下来，沿子午线和赤道指定适当的角度。

单击“衍射图样”，然后选择“径向平均”模块，以生成衍射信号位置与强度关系的图谱。从“衍射图样”菜单中进入“峰位查找”模块，以测量并自动输出衍射信号。

调整峰搜索宽度以检测真实信号并排除噪声。使用缩放和测量功能，通过峰查找验证衍射信号位置的输出结果。利用晶胞优化模块探索可能的晶胞参数尺寸。

根据强烈的赤道信号输入初始估计值，并定义晶胞搜索的最小和最大索引。计算潜在的晶胞尺寸，并将预测的衍射信号位置与观测到的衍射点进行比较。选择最符合数据和样品的晶胞。

构建分子模型时，需在符合已确定晶胞的β-折叠构型中建立肽链的三维排列，并确保包含所有与对称性相关的组分。接下来，依次点击“衍射模拟”、“结构”和“结构链生成器”，然后加载PDB模型。

指定纤维轴和入射束轴，输入晶胞尺寸，然后检查是否存在空间位阻冲突。进入衍射模拟界面，点击纤维衍射模拟，将PDB坐标文件上传至纤维衍射模拟模块。输入纤维轴方向、入射束取向、晶胞尺寸、X射线源和探测器设置，然后点击“模拟”以运行模拟。

确保光束轴与光纤轴垂直。然后进入“文件”菜单，点击“另存为”，将仿真设置保存为 html 文件以便后续编辑。将模拟得到的衍射图样保存为 RAW 格式或 TIFF 文件。

将模拟图样与实验衍射图样进行比较。使用相同的分析流程测量模拟衍射信号，并将这些数值记录下来与实验数据进行比较。

电镜照片显示载网上存在高密度的淀粉样纤维，适用于制备X射线纤维样品。拉伸框架排列的纤维产生典型的交叉β衍射图样，其在4.76埃处有子午线反射，以及来自链长、片层间距和原纤维尺寸的赤道反射。理想化的交叉β衍射图样表明，子午线和赤道反射对应于纤维轴向上重复的间距。

居中良好的衍射图样呈对称分布，赤道和子午线方向的衍射峰位置重叠。通过峰位识别分析自动检测并列出衍射峰。所检测到的衍射峰用于确定可能的晶胞参数。

使用确定的晶胞构建了结构模型，并在进行衍射模拟之前进行了可视化。由所提出的结构模型生成的模拟衍射数据，在衍射峰位置和相对强度方面，均与实验测得的衍射图谱表现出合理的吻合。将模拟图谱与实验图谱叠加后，进一步证实了对应衍射峰的良好对齐。

正确的样品取向至关重要，因为它决定了衍射数据的质量以及从中可获得的信息。本研究实现了原子分辨率的结构建模，并可与其他结构技术（如原子力显微镜，AFM）相结合，从而获得详细的分子结构。