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作者感谢普罗维登斯医疗保健公司下属普罗维登斯气道中心的支持，该中心的贡献使得本手稿得以完成。本研究由MITACS（编号IT27789）资助，并与普罗维登斯医疗保健公司（PHC）下属普罗维登斯气道中心（PAC）以及加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）（编号AWD-024378和AWD-024440）合作开展。

所有步骤均需采用无菌技术，使用无菌材料和试剂，并在生物安全柜中进行，以减少人员接触生物危害物质以及培养物被污染的风险。所用试剂和设备详见材料表。
1. 细胞 &#8203;细胞株的培养与建立
<ol>
	<li>在类器官形成之前，使用添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），将A549和MRC-5细胞培养于标准组织培养处理的塑料培养瓶（T75 cm2）中，使其融合度达到约70%–80%，该培养基以下简称&#34;完全DMEM&#34;。</li>
	<li>对于A549和MRC-5细胞，均以2 × 104 个细胞/cm2的密度接种，总体积为10 mL完全DMEM。在37 °C、5% CO2的湿润环境中培养，直至细胞融合度达到约70%–80%。</li>
	<li>每48小时更换一次培养基，以确保最佳生长条件。</li>
	<li>当细胞融合度达到70%–80%时，通过吸除培养瓶中的全部培养液进行传代，用预温的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，然后加入4 mL胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>在37 °C孵育5分钟，并用明场显微镜观察培养瓶，确认细胞完全脱落。加入4 mL完全DMEM中和反应。</li>
	<li>采用合适的方法计数细胞，例如台盼蓝排斥法计数。</li>
	<li>将细胞悬液在200 × g条件下离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，保留锥形管底部的细胞沉淀。通过轻柔吹打，用适量体积的完全DMEM重悬细胞沉淀。</li>
	<li>如需冻存，用含10% DMSO的完全培养基重悬，使细胞浓度为1 × 106 个细胞/mL；如用于类器官形成，则用完全DMEM重悬至1 × 106 个细胞/mL。</li>
</ol>
2. 建立并表征三维肺泡上皮-成纤维细胞类器官模型的成熟过程
注意：基底膜基质应在冰上过夜解冻，并在操作过程中始终保持在冰上。较高的温度可能导致基质凝固。
<ol>
	<li>配制体积比为2:3的基底膜基质与高级DMEM的混合液。将300 µL该溶液加入24孔板的每个孔中，确保每个孔底部均匀覆盖。将培养板置于37 °C、湿润的培养箱中孵育1小时，使基质凝固。</li>
	<li>在完全DMEM中配制5%的基底膜基质溶液，作为类器官的培养基。每孔用1,140 µL完全DMEM稀释60 µL基底膜基质，制备1.2 mL该溶液。</li>
	<li>在基底膜基质混合液凝固期间，将300,000个A549细胞与30,000个MRC-5细胞混合于200 µL上述步骤2.2中制备的5%基底膜基质溶液中。</li>
	<li>待2:3的基底膜基质混合物&#160;凝固后，用移液器将200 µL A549/MRC-5混合液滴加至凝胶化的基质表面，然后将24孔板放回37 °C、5% CO₂培养箱中继续孵育21天，以促进肺泡类器官的生长与分化。</li>
	<li>在接下来的48小时内，使用光学显微镜观察培养物。在此期间，细胞应开始聚集形成类器官结构。</li>
	<li>每48小时更换一次5%基底膜基质/DMEM溶液，加入200 µL新鲜的5%培养基。为避免扰动嵌入水凝胶中的类器官，吸液前可轻轻倾斜培养板，使旧培养基沿孔壁聚集后再进行吸取。</li>
	<li>在成熟过程的第3、9和21天，使用10倍物镜对类器官进行成像，每孔采集四个具有代表性的图像或视野。第3、9和21天早期类器官形态的代表性图像见图1。</li>
	<li>对每个视野，计数直径大于50 µm的所有类器官。根据已知的视野面积，结合每视野平均计数，推算每孔类器官的平均总数（假设24孔板每孔表面积为1.9 cm²）。 
	注：此类分析可使用图像分析软件（如Fiji13）完成。</li>
	<li>还可测量类器官的平均直径和面积，以获得关于类器官在培养中生长特性的定量信息。</li>
</ol>
3. 收获三维肺泡上皮-成纤维细胞类器官
注意：所有类器官收获步骤均需在冰上进行。
<ol>
	<li>经过21天的成熟培养后，吸除上清液，并用约1–2 mL冰冷的PBS轻轻洗涤。</li>
	<li>加入1–2 mL冷的类器官收获溶液，将培养板置于2–8 °C孵育30–90分钟，并进行适度振荡。 
	注意：&#160;当观察到类器官在孔底部漂浮时，停止孵育。</li>
	<li>使用明场显微镜监测解离过程。当孔底部的基底膜基质不再可见且类器官处于悬浮状态时，视为解离完成。可使用细胞刮棒轻轻刮除附着的类器官-基底膜基质凝胶，以加速该过程。</li>
	<li>将所有孔中的内容物收集至一个预冷的50 mL锥形管中。</li>
	<li>在2–8 °C下以500 × g 离心5分钟。吸除上清液，用1–2 mL冰冷的PBS洗涤类器官沉淀，再次离心以获得沉淀，然后吸除PBS。</li>
</ol>
4. 建立三维胶原包埋的肺泡-成纤维细胞类器官及施加机械应变
注意：使用带有与细胞拉伸生物反应器兼容的泡沫锚的圆形泡沫培养板。本方案中使用的培养板的生长面积约为 6.6 cm2。
<ol>
	<li>制备浓度为 2 mg/mL 的 I 型胶原工作液。该溶液应包含 1× PBS、11.4 mM NaOH 和 2 mg/mL I 型胶原，终体积用无菌水调节。每孔圆形泡沫 6 孔板需准备 2 mL 上述 I 型胶原溶液。</li>
	<li>向培养板边缘的泡沫锚点加入1 mL 2 mg/mL I型胶原蛋白溶液，确保完全浸润。 
	注意：泡沫锚必须充分浸透I型胶原溶液，以确保适当的黏附。浸透不完全可能导致在施加机械应变时胶原凝胶脱落，从而导致有效应变低于预期目标。</li>
	<li>将类器官沉淀重悬于6 mL浓度为2 mg/mL的大鼠尾尾胶原中，用移液器吸取1 mL悬液加入6孔圆形泡沫板中央，确保含类器官的胶原混合物与先前添加至圆形泡沫锚点的无类器官胶原充分混合。 
	注意：将类器官悬液加入各孔时，应避免产生气泡。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 1 小时，使 I 型胶原聚合。2). 凝胶聚合后应呈现浑浊状态。</li>
	<li>在3D胶原蛋白包埋的A549/MRC5类器官上加入2 mL完全DMEM，将培养板放回培养箱中孵育24 h。</li>
	<li>更换培养基为DMEM + 1% FBS，于机械应变处理前孵育过夜。</li>
</ol>
5. 细胞拉伸生物反应器的设置及机械应变的施加
<ol>
	<li>将加载站插入底板的每个孔中。这些加载站包含六个直径为25 mm的加载柱，可使Tissue Train培养板的柔性膜围绕其变形，从而使三维培养物受到等双轴应变。</li>
	<li>在加载柱顶部涂抹一层薄薄的硅脂。</li>
	<li>将红色垫圈安装到每个6孔板的底部。</li>
	<li>将准备好的培养板插入底板上，使其位于加载柱上方。</li>
	<li>将该装置移入37 °C、含5% CO2的加湿培养箱中，并将快速接头连接到底板。重复步骤5.1&#160;至5.6，但省略连接步骤，以建立无应变对照组。 
	注：可选地，可使用管路密封塞，阻止真空压力作用于单个BioFlex孔的底部，从而在同一块板上生成无应变的对照培养。</li>
	<li>用Plexiglas板覆盖，并施加约5-10磅的重量，以确保密封紧密。</li>
	<li>打开空气压缩机，并开启空气压缩机的出气阀。</li>
	<li>启动真空压力泵，并打开与真空罐出气口相连的压力储罐阀门。确保真空压力约为90 kPa。</li>
	<li>打开位于生物反应器控制器附近的空气压缩机进气阀。调节压力，使排气口压力不超过15 PSI。</li>
	<li>启动设备内置软件，设置所需的周期性机械应变参数。本研究中采用的方案为18%应变幅度、0.4 Hz频率，持续24小时。配置时，新建一个方案，将最小伸长率设为0%，最大伸长率设为18%，然后启动程序。</li>
	<li>观察培养板和膜片，确保在整个应变过程中可见运动。膜片应围绕加载柱发生形变。</li>
	<li>定期检查水分收集阱中的湿气，并观察计算机屏幕上的运行时间、进度以及应变方案的形态是否正常。</li>
	<li>应变程序完成后，断开底板组件，并将施加了应变的培养物放回培养箱继续孵育&#160;24小时，之后进行下游表征分析。</li>
	<li>按启动顺序的逆序关闭并拆卸系统：依次关闭或关闭空气压缩机进气阀、压力储罐阀门、真空压力泵、空气压缩机出气阀，最后关闭空气压缩机。</li>
	<li>在机械应变刺激后孵育24小时，收集上清液。储存于-80 °C，待用时取出。</li>
</ol>
6. 类器官的形态学表征 通过 免疫荧光
<ol>
	<li>用 PBS 轻轻加入 1 mL，室温孵育 5 分钟，将类器官-胶原凝胶模型洗涤三次。</li>
	<li>小心吸除 PBS，并重复洗涤过程，共三次。</li>
	<li>加入 2 mL 4% 多聚甲醛，在 4 °C 下孵育 1 小时，固定模型。</li>
	<li>按照上述方法，用 PBS 将模型洗涤三次。</li>
	<li>使用手术刀小心切割柔性孔中附着胶原凝胶的圆形泡沫锚，并将其转移至培养皿中。</li>
	<li>加入含 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液共 2 mL，室温孵育 5 分钟，对类器官进行通透处理。</li>
	<li>用 PBS 将模型洗涤三次。</li>
	<li>加入含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 溶液共 3 mL，室温孵育 1 小时，以阻断非特异性结合。移除封闭液后，进行下一步操作。</li>
	<li>加入染色混合液，在 4 °C 下过夜孵育。染色混合液包含：抗人闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1, ZO-1）与 Alexa Fluor 594 偶联抗体（1:100 稀释）、用于检测 F-肌动蛋白的与 Alexa Fluor 488 偶联的鬼笔环肽（1:1000 稀释），以及细胞核染料 DAPI（1:4000 稀释）。稀释液为 1 mL 含 1% BSA 的 PBS。在 4 °C 孵育前，用胶带封住培养板边缘。</li>
	<li>次日吸除染色混合液，并用 PBS 将模型洗涤三次。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜成像，以 40 倍物镜对代表性类器官进行 5 µm 层厚的 Z 轴扫描成像。</li>
	<li>使用 Fiji 图像分析软件分析荧光强度。将平均荧光强度与类器官面积进行归一化处理，以确保在不同环境条件下结果的准确比较。</li>
</ol>
通过ELISA和乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测对类器官进行功能表征
<ol>
	<li>将上清液在冰上解冻，并使用市售的ELISA试剂盒，按照生产商的说明书检测白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）的分泌水平。</li>
	<li>使用市售的LDH吸光度检测试剂盒，检测乳酸脱氢酶（LDH）的释放情况，作为细胞毒性的标志。</li>
	<li>使用重组LDH蛋白，以0.5 µg至0.5 ng的半对数浓度梯度绘制标准曲线，并根据该标准曲线插值计算各样品中的LDH浓度。</li>
</ol>
8. 可选步骤：用于 RNA 或蛋白质分析的样品分离
<ol>
	<li>进行免疫荧光染色时，不使用4%多聚甲醛，而应加入含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液，每1 mL RLT缓冲液中加入10 µL β-巯基乙醇。</li>
	<li>每个模型使用300 µL，反复吹打混匀，以彻底脱离并裂解细胞。</li>
	<li>将裂解液转移至无RNase的微量离心管中，置于干冰上快速冷冻，随后转移至-80 °C长期保存。 
	注意：也可使用RIPA缓冲液进行蛋白提取，其配制方法如下：50 mM Tris-HCl（pH 7.4–7.5）、150 mM NaCl、1% NP-40 或 Triton X-100、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS，溶于去离子水中。预配制的RIPA缓冲液也可商业购买。</li>
	<li>每个模型加入200 µL，冰上摇动5分钟，然后收集裂解液。</li>
	<li>在4 °C下以15,000 × g 离心10分钟，沉淀细胞碎片，上清液转移至-80 °C长期保存。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

三维（3D）肺泡上皮-成纤维细胞类器官是一种在机械应变条件下模拟肺部结构与功能的高度生理相关性平台。与二维或甚至三维共培养系统相比，类器官能够保留肺组织的关键特征 体内 肺微环境，包括空间结构、上皮-间质串扰以及细胞外基质（ECM）相互作用14机械应变在哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和呼吸机相关性肺损伤等疾病的气道重塑过程中起着核心作用，其中反复的支气管收缩或周期性过度扩张使上皮细胞和间质细胞暴露于异常的张应力之下15在我们之前的研究中10对肺泡上皮-成纤维细胞类器官施加 18% 的等双轴应变（0.4 Hz，持续 24 小时），可诱导产生力学依赖性损伤特征，包括上皮紧密连接完整性丧失（ZO-1 表达减少）、细胞骨架重塑（F-actin 重排）、炎症细胞因子（IL-6、IL-8）上调，以及乳酸脱氢酶（LDH）释放增加，提示细胞死亡。这些由应变诱导的反应模拟了哮喘早期的致病过程，在该过程中，即使不存在外源性过敏原或免疫细胞，机械应力也足以引发上皮损伤、炎症介质释放及成纤维细胞活...

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Erratum: Generation of 3D Collagen-Embedded A549/MRC-5 Alveolar Organoids using a Mechanical Cell-Stretching Bioreactor

肺泡是呼吸系统的终末囊状结构，是气体交换的主要部位。肺泡主要由Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮细胞组成，这些细胞负责气体交换、免疫功能以及结构完整性的维持；此外，肺泡壁内还含有成纤维细胞，负责维持细胞外基质的稳态1。在呼吸过程中，这些及其他常驻细胞持续受到周期性牵张和剪切应力的作用2。此类机械刺激可被转化为生化信号，进而影响细胞的结构、分化和细胞间通讯3。
在慢性阻塞性肺疾病（COPD）等肺部疾病中可观察到病理性机械应变。COPD 是一种进行性疾病，其特征是肺实质破坏、慢性炎症以及小气道狭窄4。在此疾病中，肺泡壁的破坏、弹性蛋白的丧失、导致纤维化的细胞外基质（ECM）重塑以及慢性炎症共同损害了肺组织抵抗结构损伤的能力5,6。这导致呼吸过程中肺泡发生异质性和异常变形，且在疾病急性加重期进一步加剧7,8。
尽管已有多种体外（in vitro）方法被用于研究肺泡生物学，但每种方法均存在显著局限性。二维共培养系统有助于研究细胞间相互作用，但无法模拟组织结构或细胞外基质的动态变化，从而降低了其生理相关性。静态三维培养能较好地维持结构组织和基质相互作用，但未引入体内（in vivo）存在的动态力学刺激。微流控和器官芯片平台可模拟液体流动和机械应变，具有较高的生理保真度，但通常技术复杂、通量低且成本高昂9。相比之下，本文所介绍的三维机械拉伸类器官模型，在一个可重复、可扩展的平台上，结合了结构复杂性、细胞异质性以及可控的机械刺激——这一特性在现有模型中常被忽视，实现了生理相关性与实验可及性之间的良好平衡10,11。
为了理解导致慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病的复杂机制并发现治疗靶点，研究人员已建立了疾病模型。尽管机械应变具有重要意义，但在研究中常常被忽视 体外 用于研究慢性阻塞性肺疾病（COPD）等肺部疾病机制与发病过程的肺泡模型。为弥补现有模型的不足，本文介绍一种在基底膜基质中培养肺泡上皮-成纤维细胞类器官，并将其回收后嵌入三维胶原凝胶中，利用细胞拉伸生物反应器施加周期性机械应变，进而评估关键结构与功能指标的方法。此类三维机械性类器官模型能更真实地模拟人类肺泡微环境中的细胞间相互作用，从而实现对上皮-间质串扰的深入研究12.
该生物反应器可施加具有可配置参数的等双轴应变，实现最高达30%的拉伸程度和最高5 Hz的频率，以模拟生理和病理条件。在本研究中，我们构建了嵌入于I型胶原水凝胶中的类器官模型，并施加18%应变、0.4 Hz频率持续24小时，以模拟病理状态下的呼吸过程。我们建立了一套标准化的表征工作流程，包括针对细胞特异性标志物的免疫染色以及定量检测机械应变后免疫介质释放的免疫分析方法。本研究的目标是提供一个生理相关性强、操作简便且可灵活调整的平台，用于研究肺泡生物学在机械应力作用下的变化。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.215</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 一次性离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Millipore Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 一次性离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>6孔（柔性膜）Tissue Train 圆形泡沫板</td><td>Flexcell International</td><td>TTCF-5001</td><td></td></tr><tr><td>A549 细胞</td><td>美国典型培养物保藏中心（ATCC）</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>空气压缩机</td><td>California Air Tools</td><td>10020DSPCAD</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>一氧化碳&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVL-PA</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 类器官收获溶液</td><td>Bio-Techne</td><td>3700-100-01</td><td></td></tr><tr><td>CyQUANT LDH 细胞毒性检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C20300</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4&amp;prime;,6-二脒基-2-苯基吲哚)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;DMEM培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL Core 显微镜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AMEX1200</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A5209501</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 图像分析软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flexcell FX-6000 张力与组织训练系统（包含 Flexlink FX-6000 张力控制器、压力储液罐、底板、丙烯酸观察窗、直径 25 mm 的圆柱形加载站、水阱、FlexSoft FX-6000 V1.0 软件及各种管路）</td><td>Flexcell International</td><td>FX6000T</td><td></td></tr><tr><td>人白细胞介素-6 DuoSet ELISA</td><td>Bio-Techne</td><td>DY206</td><td></td></tr><tr><td>人白细胞介素-8 DuoSet ELISA</td><td>Bio-Techne</td><td>DY208</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 共聚焦显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>11889122</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 基底膜基质</td><td>康宁</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Millipore Sigma</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（Pen/Strep）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>鬼笔环肽标记探针，Alexa Fluor 488</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>大鼠尾胶原 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>重组人乳酸脱氢酶蛋白（有活性）</td><td>Abcam</td><td>Ab93699</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 裂解缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>无RNase的微量离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>T75 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 培养瓶</td><td>格雷纳</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 单克隆抗体（ZO1-1A12），Alexa Fluor 594</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339194</td><td></td></tr></tbody></table>

利用机械细胞拉伸生物反应器生成三维胶原嵌合a549/mrc-5肺泡类器官

Generation of 3D Collagen-Embedded A549/MRC-5 Alveolar Organoids using a Mechanical Cell-Stretching Bioreactor

尽管呼吸动力学和机械应变在肺泡生物学中起着关键作用，但它们对呼吸系统疾病发病机制的贡献常常被忽视。为弥补这一空白，我们开发了一种类器官模型，利用细胞拉伸生物反应器对肺泡上皮-成纤维细胞类器官施加可控的机械应变。该平台可模拟肺泡组织的空间结构和多细胞复杂性，从而研究细胞间通讯和机械转导如何影响健康与疾病状态下组织的结构与功能。在本实验方案中，我们描述了使用A549肺泡上皮细胞系和MRC-5肺成纤维细胞系在基底膜细胞外基质水凝胶中生成并培养上皮-成纤维细胞类器官的方法。随后，类器官通过非酶法分离，并嵌入生物反应器专用培养板中的三维胶原凝胶中。我们详细说明了施加等双轴应变的操作流程，以模拟呼吸加重期间出现的病理性呼吸模式。最后，我们提供了一套标准的表征工作流程，包括针对细胞特异性标志物的免疫染色以及用于分析免疫介质释放的免疫检测方法。上述分析手段共同支持对类器官结构与功能的评估。本方案提供了一个用户友好、可重复且可灵活调整的平台，用于在机械应力条件下研究肺泡生物学，其参数易于修改，可满足多样化的实验目标，推动对肺部疾病机制的研究进展。

由细胞系衍生的肺泡上皮-成纤维细胞类器官建立后培养超过21天。在此期间观察到其形态学变化，并在第3、9和21天评估类器官数量、面积和直径，以监测其生长和发育情况。与第3天相比，每孔类器官的平均数量在第9天和第21天显著减少（图2A）。相比之下，类器官的平均面积和直径在第9天和第21天显著增加，表明类器官持续生长并扩张（图2B、C）10。
图3A、B 分别展示了静态（无应变）和应变条件下肺泡上皮-成纤维细胞类器官模型的代表性共聚焦图像，经免疫荧光染色显示F-actin（细胞骨架的主要成分）、ZO-1（定位于上皮细胞紧密连接处的支架蛋白）以及细胞核10。在应变条件下，肺成纤维细胞形成了F-actin阳性的胞质突起，破坏了类器官典型的球形形态。相应地...

本方案概述了在细胞外基质水凝胶支架上由A549肺泡上皮细胞和MRC-5肺成纤维细胞生成类器官，随后将其包埋于三维胶原凝胶中，并利用细胞拉伸生物反应器施加机械应变，以研究肺泡机械生物学。

利用机械细胞拉伸生物反应器生成三维胶原嵌合A549/MRC-5肺泡类器官

尽管呼吸动力学和机械应变在肺泡生物学中发挥关键作用，但它们对呼吸系统疾病发病机制的贡献……

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科研

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Bioengineering

生物工程

利用机械细胞拉伸生物反应器生成3D胶原蛋白嵌入A549/MRC-5肺泡类器官

本文描述了一种制备由I型胶原和原代人成纤维细胞组成的三维基质的方法。这种类器官凝胶能够模拟组织间质的基本特征，适用于多种显微镜观察，因此是评估细胞侵袭性迁移的有用基质。...

三维环境中的细胞行为评估：可调节的I型胶原类器官培养检测平台

本研究开发了一种新型成像方案，采用定制的电机驱动机械执行器，可实现对活细胞在机械应变下的实时响应进行测量。该系统适用于力学生物学研究，能够施加高达20%的应变，同时支持使用共聚焦显微镜或原子力显微镜进行近实时成像。...

活细胞成像在机械拉伸过程中的应用

本研究介绍了一种通过直接培养胶原蛋白、平滑肌细胞和内皮细胞来快速制备活体血管组织的技术。此外，还描述了一种用于工程化血管组织力学表征的新方案。...

用于血管组织再生的三维细胞化胶原凝胶的构建

本文描述了将诱导多能干细胞逐步定向分化为包含近端和远端肺上皮细胞以及间充质的三维全肺类器官的方法。...

利用诱导多能干细胞构建三维全肺类器官以模拟肺发育生物学及疾病

本方案介绍了一种在微重力条件下培养成釉细胞样细胞并实现其三维生长的方法，以维持细胞的细长极化形态及牙釉质特异性蛋白的表达。同时描述了牙周组织工程构建物和肺器官在微重力条件下的培养条件。...

微重力条件下牙源性和呼吸系统细胞与器官的增殖

该方案描述了一种可进行成像的生物反应器，可用于选择性去除大鼠气管的内源性上皮，并在外源细胞接种后使其在管腔表面均匀分布，随后实现长期培养 体外...

成像引导式生物反应器用于生成生物工程化气道组织

本方案介绍了一种从原代肺组织中获取人肺类器官、扩增肺类器官并诱导其向近端分化，从而生成能够真实模拟人类气道上皮的三维和二维气道类器官的方法。...

建立人类肺类器官及近端分化以生成成熟气道类器官

本方案描述了开放式顶盖器官芯片（Open-Top Organ-Chip）的功能及其建立和成熟原代组织（皮肤、肺泡、气道和肠道）全层器官芯片培养所需的关键培养模式，为研究人类上皮/间充质与血管微环境界面的多种功能特性提供了机会。 体外.

在开放式器官芯片上重建人类上皮组织的细胞结构与功能

本文展示了一种三步法类器官模型（二维[2D]扩增、二维[2D]刺激、三维[3D]成熟），该模型为肌腱基础研究提供了一种有前景的工具，也为肌腱组织工程提供了一种潜在的无支架方法。...

利用人皮肤成纤维细胞展示自组装细胞片培养及手动构建类肌腱/韧带三维类器官

关键词：自组装细胞片，三维类器官，人皮肤成纤维细胞，肌腱样组织，韧带样组织

本研究介绍了一种经济高效且简便的3D细胞结构制备方法，该方法采用基于印章的系统在琼脂糖模具中制备微孔。该系统可促进均一的类球体/类器官形成，从而增强细胞间相互作用。该方法降低了实验变异性，适用于药物筛选和组织工程等应用。...

利用新型印章装置从二维细胞培养生成三维球状体/类器官

本方案描述了一种基于明确成分水凝胶的方法，可在可控的三维培养系统中生成模拟乳腺形态发生关键特征的人类乳腺类器官。...

一种基于明确水凝胶的三维人乳腺类器官生成方法，可重现乳腺形态发生过程

University of British Columbia - Okanagan.  该方案概述了从A549肺泡上皮细胞和MRC-5肺纤维细胞在细胞外基质水凝胶支架上生成类器官，随后嵌入3D胶原凝胶中，并利用细胞拉伸生物反应器对机械应变进行机械应变，以研究肺泡机械生物学。

利用机械细胞拉伸生物反应器生成三维胶原嵌合A549/MRC-5肺泡类器官

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