体外受精 细菌泛素化的重建及VCP/p97介导的消除

我们的研究揭示了VCP或p97如何作为细胞质防御者，抵御多种不同病原体。这释放了VCP或p97在治疗应用和生物工程策略中的潜力。除了常规生物化学外，超高分辨率显微镜、低温显微镜、低温电磁场分析还用于研究这些宿主效应因子如何在病原体上组织并消灭它们。

首先，在Todd Hewitt酵母培养基中，以37摄氏度、5%二氧化碳的环境，在6个菌株2型中培养。将一部分过夜培养液接种到10份新鲜Todd Hewitt酵母培养基中，并在37摄氏度与5%二氧化碳下培养，直到600纳米的光学密度达到0.4。然后将900微升链球菌肺炎培养液与600微升50%甘油混合，并将甘油高汤储存在零下80摄氏度。

然后将新鲜的肺炎链球菌高汤从零下80摄氏度解冻，并完全接种到5毫升的Todd Hewitt酵母培养基中。取大约10的七次方链球菌肺炎细胞。要彻底清洗细胞，将细菌重新悬浮在反应缓冲液中，并在室温下以21,000克离心机冷却五分钟。

用549哺乳动物细胞裂解液重新悬浮沉淀。然后加入纯化的泛素和一毫莫拉三磷酸腺苷，在27摄氏度下孵育一到两小时。然后用含有一颗摩尔尿素的反应缓冲液洗涤细菌一次，接着仅用反应缓冲液再洗两次。

用1%的对甲醛固定细菌。固定后，用含有每毫升一毫克甘氨酸的PBS培养细胞15分钟。然后用PBS洗两次。

通过将泛素与其他必要组分结合反应缓冲液，制备反应混合物。将反应混合物总体积调整为100至150微升。将细菌重新悬浮在含泛素酶的反应混合物中，并在27摄氏度下培养悬浮液两小时。

用含尿素的反应缓冲液清洗细菌三次后，用1%的对甲醛固定细菌。固定后，用含有每毫升一毫克甘氨酸的PBS培养细胞15分钟。然后将样本在3%BSA中以27摄氏度培养一小时，并用PBS洗涤样本两次。

将泛素化细菌重新悬浮在初级抗体溶液中，该溶液的制备浓度高于免疫荧光检测通常使用的浓度。然后在27摄氏度下孵育一小时。用PBS清洗细菌两次后，将其重新悬浮于与Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 555结合的对应二抗中。

现在将大约10到20微升标记的细菌样本落投到玻璃载玻片上，并混合5到10微升的装载介质，无论是否使用DAPI。在样本上盖上盖片，并用薄纸吸走多余的液体。将六颗微摩尔VCP p97与一颗微摩尔NPLOC4和一颗微摩尔UFD-1结合。

将反应混合物的体积调整到大约90微升，使用反应缓冲液，并在冰上孵育两小时。接着，将一到两毫莫拉腺苷三磷酸加入含有p97 UFD-1、NPLOC4的反应混合物中。然后将10的7个泛素链球菌肺炎细胞的幂次方结合起来，在37摄氏度下潜伏两小时。

处理后立即从反应混合物中取出10微升的分量，进行序列稀释。在脑心输注螺旋板上滴注每种稀释液10到20微升。评估零点到两小时时间点之间的殖民形成单位。

通过将两小时CFU计数除以零小时CFU计数，再乘以100来计算细菌存活率。在用哺乳动物细胞裂解液或重构的E-1、E-2、E-3酶系统处理时，观察到肺炎链球菌显著泛素化。对照组中泛素化信号缺失，且在泛素化肺炎链球菌暴露于OTUB1时显著减弱，证实了K48关联的多泛素修饰。

线谱分析显示泛素与细菌信号完全重叠，确认了它们的空间共定位。三维重建证实了泛素和肺炎链球菌信号的空间重叠。野生型p97与其辅因子UFD1和NPLOC4结合时，无论泛素化是用细胞裂解液还是纯化酶系统，均可在两小时内将细菌存活率降至10%至20%。

在省略泛素化、p97被热灭活或使用催化性失活的p97 E57 8Q突变体时，均未观察到细菌存活率下降，证实泛素化和活性p97对杀死细菌至关重要。我们的研究揭示了宿主E3泛素连接酶如何修饰不同病原体，并探讨清除感染威胁的效应机制。接下来，我们旨在探索p97或VCP的调控机制，并进一步设计其增强抗菌活性。