基于酚红棉线采样法用于生物标志物发现中非靶向泪液脂质组学研究

我们建立了一种更为标准化且易于操作的基于酚红线的方法，以帮助获得可重复的眼泪脂质组学谱，用于未来眼泪生物标志物的发现。目前的挑战在于，Schirmer试纸会引起刺激，而毛细管在泪液采集过程中存在操作者间的变异性。这阻碍了实验结果的可报告性以及不同研究之间的比较。

首先，戴上手套并彻底消毒工作台，以防止样本受到任何污染。用手握住酚红线的弯曲钩的对侧末端，注意不要触碰弯曲钩部分。请受试者将视线转向上方鼻侧方向。

然后轻轻下拉受试者的下眼睑，将酚红线试纸的弯曲钩端置于靠近眼外角的下侧睑结膜处。接着，请受试者轻轻闭上眼睛，并将头部略向前倾，以防止酚红线试纸接触面部皮肤。再次下拉受试者的下眼睑，轻轻取出酚红线试纸，避免接触采样区域。

记录所取红色区域的长度。使用无菌镊子将PRT转移至新的样本管中。然后正确标记并盖好样本管。

如果采集的长度小于50毫米，则让受试者休息一至三分钟，然后使用同一只眼睛重复采集泪液。将每条新采集的PRT分别放入单独的样本管中。使用甲醇和干净的擦镜纸彻底清洁手套和镊子，以去除任何泪液残留物或污染物。

然后让其完全自然晾干。用封口膜密封所有样品管，并立即于-20摄氏度条件下暂存，或于-80摄氏度条件下长期保存。在处理酚红棉线前，先用甲醇预清洗显微剪刀和镊子。

将每根酚红线的弯曲钩端从末端起约前三毫米处剪除。将酚红染料前沿之前的取样区域切成两毫米长的小段，并用干净的1.5毫升耐有机溶剂的微量离心管收集这些片段。丢弃弯曲钩端及PRT的无用部分。

将样品置于冰上，以在提取前保持低温。向每个样品中加入232 µL预冷的质谱级甲醇，涡旋振荡15秒以充分混匀。将样品置于预冷的超声波清洗仪中，超声处理15分钟。

然后向每个样品中加入 774 µL HPLC 级甲基叔丁基醚和 194 µL 去离子水。再次涡旋振荡 15 秒，使溶剂充分混匀。将样品再次置于预冷的超声清洗仪中，超声处理 15 分钟。

超声处理后，将样品置于设置为4°C、以1,200转/分钟振荡的ThermoMixer中孵育8小时。然后将混合物在室温下静置10分钟。在4°C条件下，以10,000 G离心10分钟。

离心后，确保混合物明显分离为两个不同的液相。小心吸取含有脂质的上层有机相700微升，并转移至预冷的新的1.5毫升微量离心管中。将含有残余甲基叔丁基醚和甲醇的下层水相作为危险化学废物弃去。

使用预冷的真空离心浓缩仪在4°C条件下干燥脂质提取物，持续4小时。随后将干燥后的脂质提取物在-20°C下短期保存或在-80°C下长期保存。通过将甲醇与氯仿按1:1的体积比混合，配制甲醇-氯仿溶剂混合液。

使用 50 微升预冷的甲醇-氯仿溶剂混合液重新溶解干燥的脂质提取物。将重新溶解的溶液置于预冷的超声清洗仪中，超声处理 15 分钟。随后，在 14,000 G 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。

将40微升所得上清液小心转移至配有玻璃插件的自动进样器玻璃小瓶中。使用无切口隔垫的敞口盖将小瓶 tightly 密封，以备进行液相色谱-串联质谱分析。根据严格的标准，在第一组重复、第二组重复和第三组重复样本中，分别鉴定出773、890和1,025种独特的脂质种类。

正离子模式鉴定出1,302种脂质分子，其中约26%为A级，13.2%为B级，60.8%为C级鉴定结果。负离子模式鉴定出257种脂质分子，其中约8.2%为A级，22.9%为B级，68.9%为C级鉴定结果。尽管存在与储存相关的差异，但在全部三组样本中均稳定鉴定出394种独特的脂质分子。

在正离子模式下，三次访视间的受试者间变异系数为21.5%，负离子模式下为31.3%。本方案针对缺乏标准化流程以实现可重复的泪液脂质组学分析这一问题，有助于提高不同研究之间的可比性。我们基于PRT的方法可最大限度减少刺激，实现快速泪液采集，并降低操作者间的差异性。

我们未来的研究将在大规模队列中验证泪液脂质组学生物标志物，并整合多组学数据以实现个体化诊断。