基于酚红线的非靶向泪液脂质采样程序在生物标志物发现中
December 12th, 2025
该方案描述了一种独特的临床方案，用于利用酚红线和基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的工作流程采集人类泪液样本，以发现泪液脂质组剖面。简单的甲基叔丁基醚（MTBE）/甲醇双相分离方法能够快速提取泪脂，并实现高回收率，以发现泪液生物标志物。
我们建立了一种更标准化、作更简便的苯酚红线方法，以帮助实现可重复的泪液脂质组学谱，为未来泪液生物标志物的发现做准备。当前的挑战是Schirmer条状刺激，而毛细血管在泪液收集方面表现出的差异。这阻碍了实验报告性和研究间比较。
首先，请戴手套并彻底消毒工作站，以防止样本被污染。用酚红线夹住弯曲钩子对面的末端，确保不要碰到弯曲的钩子区域。让受试者将目光转向上鼻方向。
然后轻轻拉下受试者的下眼睑，将酚红线和弯曲钩子插入靠近眼角的下颞叶结膜。现在，让受试者轻轻闭上眼睛，微微前倾头，以防止酚红线接触面部皮肤。再次拉下受试者的下眼睑，轻轻取出酚红线，避免接触采样区域。
记录采样红色区域的长度。用无菌产钳，将PRT转移到新的样本管中。现在正确标记并封住样品管。
如果采样长度小于50毫米，请受试者休息一到三分钟，然后用同一只眼睛重复泪液收集。将每个新采样的PRT放入单独的样品管中。使用甲醇和干净的纸巾彻底清洁手套和镊子，以去除任何泪痕残留或污染物。
然后让它们完全自然风干。用防腐剂封住所有样品管，并立即以零下20摄氏度储存为临时保存，零下80摄氏度为长期储存。在处理酚红线之前，先用甲醇预洗微剪刀和镊子。
从每根酚红线的前三毫米处剪断弯曲的钩头。将采样区域切至酚红染料前端，切成两毫米级，并用干净的1.5毫升有机溶剂耐受微离心管收集这些片段。丢弃弯曲的钩端和不需要的PRT区域。
将样品冰敷以保持低温再提取。现在，在每个样品中加入232微升冰冷质谱级甲醇，并用涡旋15秒彻底混合。在预冷的超声清洗剂中对样品进行超声波处理15分钟。
然后向每个样品加入774微升HPLC级甲基叔丁基醚和194微升去离子水。再次旋转15秒，充分混合溶剂。再用预冷却的超声波清洗剂对样本进行超声波处理，再浸泡15分钟。
超声波处理后，将样品置于温度为4摄氏度的热混合器中，以每分钟1200转的速度摇晃，持续八小时。然后让混合物在室温下静置10分钟，不受干扰。将混合物以10,000克、摄氏4度离心10分钟。
离心后，确保混合物明显分为两个不同的液相。小心收集700微升含脂质的上部有机相，并将其转移到预冷的1.5毫升微型离心管中。丢弃含有残留甲基叔丁基醚和甲醇的下水相作为有害化学废弃物。
用冷藏的SpeedVac浓缩器将脂质提取物晾干，温度设定在四摄氏度，持续四小时。然后将干燥脂质提取物以零下20摄氏度储存短期保存，或零下80摄氏度储存以供长期保存。通过将甲醇与氯仿以一比一体积比例混合，制备甲醇-氯仿溶剂混合物。
用50微升冰冷的甲醇-氯仿溶剂混合物重新合成干燥脂质提取物。将复原溶液放入预冷超声清洗剂中超声波清洗15分钟。现在，将重组的脂质提取物以14,000克、4摄氏度离心10分钟。
小心地将40微升的上清液转移到带有玻璃插入的自动采样玻璃瓶中。用非裂缝隔盖紧密封瓶盖，准备液相色谱串联质谱分析。通过严格标准，分别在复制一、重复二和复制三个样本组中识别出773、890和1,025个独特脂质物种。
正离子模式识别出1,302种脂质，分别为26%A级、13.2%B级和60.8%C级。负离子模式鉴定出257种脂质物种，分别为约8.2%的A级、22.9%的B级和68.9%的C级。尽管存在储存相关变异，三组样本中一致识别出394种独特的脂质。
三次就诊的受试者间变异系数在正性模式下为21.5%，在负向模式下为31.3%。该方案解决了缺乏可重复性泪液脂质分析的标准化工作流程，并可提升研究间的可比性。我们基于PRT的方法最大限度地减少刺激，实现快速泪液收集，并降低的变异性。
我们未来的研究将在大型队列中验证泪脂组生物标志物，并整合多组学以实现个性化诊断。
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概述
本协议概述了一种使用酚红线收集人类泪液样本的标准化方法，旨在增强泪液脂质组学研究的可重复性。该工作流程结合了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行脂质提取和分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 临床研究
背景
- 目前的泪液收集方法通常会导致刺激或变异。
- 标准化对于可靠的生物标志物发现至关重要。
- 酚红线提供了一种较少侵入性的泪液采样替代方案。
- LC-MS/MS为脂质组学分析提供了一个强大的平台。
研究目的
- 建立一种可重复的泪液脂质组学分析方法。
- 最大限度地减少操作者变异并提高研究间可比性。
- 促进未来泪液脂质生物标志物的研究。
使用的方法
- 使用酚红线收集泪液样本。
- 使用双相分离方法提取脂质。
- 通过LC-MS/MS分析脂质种类。
- 在受控温度下储存样本以保持稳定性。
主要结果
- 在正离子模式下鉴定了超过1,300种脂质种类。
- 在样本中一致鉴定了394种独特的脂质种类。
- 正模式下的受试者间变异为21.5%。
- 该方法增强了脂质组学研究的可重复性和可比性。
结论
- 酚红线方法减少了刺激和变异。
- 标准化的工作流程提高了泪液脂质组学分析的可靠性。
- 未来的研究将集中在较大队列中验证脂质生物标志物。
常见问题
Executive Industry Relevance
Standardized, minimally invasive tear fluid sampling is critical for robust lipidomic biomarker discovery in ocular and systemic disease research. The phenol red thread (PRT)-based protocol addresses reproducibility and operator variability, enabling higher predictive confidence in early biomarker validation. This workflow supports translational continuity from discovery to preclinical research by ensuring consistent, high-quality lipidomic data across studies and sites.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reproducible interrogation of tear lipid profiles for biomarker hypothesis testing.
- Reduces biological and procedural variability, supporting functional target validation.
- Facilitates portfolio triage by providing robust, quantitative lipidomic datasets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tear fluid samples for downstream high-resolution LC-MS/MS workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing operator-dependent variability.
- Supports scalable, user-friendly sample collection suitable for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipidomic outputs with disease-relevant biomarker discovery and monitoring.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent sample quality.
- Reduces risk of false negatives in translational biomarker studies due to sampling artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The PRT-based sampling protocol integrates into the biomarker discovery continuum, from early hypothesis testing to preclinical validation, by providing a standardized input for lipidomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven lipidomic profiling and pathway clarification in ocular and systemic disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tear lipid samples for high-throughput LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Enables identification and comparison of over 700 unique lipid species across replicates and conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease monitoring through robust, minimally invasive sampling.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, standardized protocol adaptable across research teams and clinical cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biomarker studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tear fluid collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing sampling-related risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires personnel trained in standardized PRT handling and sample processing.
- Needs access to high-resolution LC-MS/MS instrumentation and lipidomics software.
- Demands cross-team adherence to contamination control and storage protocols.
- Adaptable to subjects with low tear volume or sensitivity to traditional sampling methods.
- Potential limitations include storage-related lipid variability and need for further validation in large cohorts.
