Name: 基于酚红线的非靶向泪液脂质采样程序在生物标志物发现中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-12T14:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 了解基于酚红线的人眼泪液脂质采样方法，通过LC-MS/MS分析实现可重复的脂质组学分析。该方法减少操作者差异，提高研究间可比性，有助于发现泪液生物标志物。

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本工作由创新香港研发平台计划（InnoHK）、中国香港特别行政区政府以及香港理工大学SHARP视觉研究中心资助。作者还衷心感谢香港理工大学化学与环境分析大学研究设施（UCEA）和生命科学大学研究设施（ULS）提供的技术支持。

本研究获得了香港理工大学机构审查委员会（IRB）的批准。受试者在参与研究前均签署了书面知情同意书。所用试剂和设备列于材料表中。
1. 基于酚红线（PRT）的人类泪液采集
<ol>
	<li>佩戴手套并消毒工作台，以防止样本污染。</li>
	<li>打开前请确认PRT包装密封且未过有效期。</li>
	<li>握住线材时应抓取弯曲钩的对侧末端，切勿触碰PRT的弯曲钩部分。</li>
	<li>请受试者注视上方鼻侧方向。</li>
	<li>轻轻下拉受试者的下眼睑，将PRT插入下眼睑颞侧结膜处，弯曲钩应置于靠近眼外眦的位置（图2）。</li>
</ol>
<img alt="泪道荧光素试验示意图；医学检查中突出显示泪液引流路径的眼部图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69474/69474fig2.jpg" data-altupdatedat="1773047343000" data-alt="图2"> 
图2：采集泪液时酚红棉线的位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69474/69474fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="6">
	<li>请受试者轻轻闭上眼睛，并将头部略微前倾，以防止泪液试纸（PRT）接触面部皮肤。 
	注意：泪液吸收后会逐渐形成红色染料前沿，这是由于pH敏感的酚红所致，可指示PRT的采样区域。为确保脂质组学分析所需的足够泪液体积，建议采集相当于50 mm PRT长度的泪液，通常在2分钟内完成。</li>
	<li>轻轻下拉受试者的下眼睑，并取出已采样的PRT，避免触碰采样区域。</li>
	<li>记录PRT采样区域的长度，并借助无菌镊子将PRT转移至新的样品管中。 
	注意：如果采样的PRT长度&lt;50 mm，请让受试者休息1–3分钟，并用同一只眼睛重复采集过程。每个采样的PRT应分别转移至独立的样品管中。</li>
	<li>正确标记并盖紧样品管。</li>
	<li>用甲醇和洁净的擦拭纸彻底清洁手套和镊子，以去除任何残留的泪液或污染物，然后使其自然晾干。</li>
	<li>对另一只眼睛重复步骤1.2–1.10。</li>
	<li>用封口膜密封样品管，并立即在-20°C条件下暂存或在-80°C条件下长期保存。避免不必要的冻融循环，并防止采样的PRT暴露于光照下。</li>
</ol>
2. 采样PRT的处理
<ol>
	<li>处理PRT前，先用甲醇预清洗显微剪刀。</li>
	<li>丢弃PRT的弯曲钩端（即前3 mm部分）（图3）。</li>
</ol>
<img alt="显示用于样品采集的标记切割区域的色谱图线段。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69474/69474fig3.jpg" data-altupdatedat="1773047343000" data-alt="图 3"> 
图 3：酚红棉线（PRT）的物理外观。（A）未使用的PRT，末端带弯曲钩状结构。（B）使用后的PRT，标示出被剪切并收集用于脂质提取的部分。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69474/69474fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>将PRT的取样区域（即酚红染料前沿以上的区域）切成2 mm的片段，并将这些片段转移至一支洁净的1.5 mL耐有机溶剂的微量离心管中。</li>
</ol>
3. 从采集的 PRT 样品中提取脂质的 MTBE/甲醇双相分离法
警告：甲基叔丁基醚（MTBE）和甲醇具有易燃性和挥发性。应在通风良好的区域或通风橱中使用。避免明火和火花。佩戴手套和实验服。操作后洗手。
<ol>
	<li>将样品置于冰上。</li>
	<li>向每个样品中加入 232 µL 冰冷的甲醇（质谱级），涡旋振荡 15 秒。</li>
	<li>将样品置于预冷的超声清洗仪中进行超声处理，持续 15 分钟。</li>
	<li>向每个样品中加入 774 µL MTBE（HPLC 级）和 194 µL 去离子水，涡旋振荡 15 秒。样品中 MTBE:甲醇:水的最终体积比应为 4:1.2:1（v/v/v）。</li>
	<li>再次将样品置于预冷的超声清洗仪中进行超声处理，持续 15 分钟。</li>
	<li>将样品在恒温混匀仪中孵育 8 小时，温度为 4 °C，转速为 1,200 rpm。</li>
	<li>让混合物在室温下静置 10 分钟。</li>
	<li>将所得混合物在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>离心后，混合物分为两相（图 4）。 
	注意：相分离完成后，应检查样品是否形成两个清晰的分层：上层为有机相（富含 MTBE），应呈透明并略带乳白色浑浊；下层为水相，因含有酚红指示剂而呈现黄色。只有当观察到如 图 4 所示的相特征时，方可继续后续操作。</li>
</ol>
<img alt="有机相-水相分离示意图；离心管中液-液萃取显示相分离。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69474/69474fig4.jpg" data-altupdatedat="1773047343000" data-alt="图4"> 
图4：使用MTBE-甲醇-水进行脂质萃取的相分离：上层为有机相，下层为水相。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69474/69474fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="10">
	<li>小心吸取含有脂质的上层有机相700 µL，转移至预冷的新的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>将含有残留甲基叔丁基醚（MTBE）和甲醇的下层水相作为危险化学废物丢弃。将废液收集于贴有标签的密闭容器中，并根据机构的危险废物处理规程和当地法规进行处置。切勿将溶剂倒入下水道。</li>
	<li>使用制冷型SpeedVac浓缩仪在4 °C条件下干燥脂质提取物，持续4小时。 
	注意：为确保完全干燥，从2小时开始定期检查样品干燥程度。必要时延长干燥时间，直至样品完全干燥。</li>
	<li>将干燥后的脂质提取物在-20 °C下保存用于短期储存，或在-80 °C下保存用于长期储存。</li>
</ol>
4. 用于 LC-MS/MS 分析的提取泪液脂质的重建
<ol>
	<li>用50 µL预冷的甲醇（质谱级）/氯仿（高效液相色谱级）混合液（1:1，v/v）作为溶剂（每使用1 mm PRT对应1 µL溶剂）重新溶解干燥的脂质提取物，随后在预冷的超声清洗仪中进行超声处理15分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以14,000 × g 离心10分钟，对重新溶解的脂质提取物进行离心。</li>
	<li>小心转移40 µL上清液至装有玻璃插件的自动进样玻璃小瓶中。</li>
	<li>使用无切口隔垫的敞口盖紧密封小瓶，准备进行LC-MS/MS分析。</li>
</ol>
5. 通过液相色谱-串联质谱法进行样品采集
<ol>
	<li>进行液相色谱时，将色谱柱温箱和自动进样器的温度分别设置为 50 °C 和 4 °C。</li>
	<li>每次进样时，将 5 µL 样品加载至反相液相色谱柱（C18；1.7 µm，100 mm × 2.1 mm），并在 24 分钟的分离梯度中以 0.3 mL/min 的流速对脂质进行分离。
	<ol>
		<li>使用流动相 A：由 60:40 乙腈（质谱级）:水（v/v）混合物组成，含 5 mM 甲酸铵（质谱级）和 0.1%（v/v）甲酸（质谱级）；流动相 B：含 90:10 异丙醇（质谱级）:乙腈（v/v），并添加 5 mM 甲酸铵和 0.1%（v/v）甲酸。</li>
		<li>采用以下梯度程序：0–2 分钟：40% B；2–2.5 分钟：40% B；2.5–3 分钟：58% B；3–18 分钟：99% B；18–20 分钟：99% B；20–20.1 分钟：40% B；20.1–24 分钟：40% B。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于 Orbitrap 质谱仪，在正离子模式下设置喷雾电压为 +3.5 kV，负离子模式下为 -2.5 kV。</li>
	<li>调节鞘气流速至 45 Arb，辅助气体流速至 10 Arb。</li>
	<li>设置扫气流速为 2 Arb。</li>
	<li>将离子传输管温度设为 300 °C，汽化器温度设为 320 °C。</li>
	<li>采用数据依赖性采集（DDA）模式。</li>
	<li>对于 MS1，设置分辨率为 120,000，扫描范围为 100–2000 m/z，标准 AGC 目标值，自动进样时间，动态排除时间为 6 秒，强度阈值为 5.0e4。</li>
	<li>对于 MS2，设置分辨率为 15,000，自动扫描范围，标准 AGC 目标值，动态进样时间，隔离窗口为 1.6 m/z，碰撞能量类型为高能碰撞解离（HCD），归一化碰撞能量（NCE）采用分段值 15、30 和 40。</li>
	<li>使用 LipidSearch 软件或其他兼容平台分析原始数据。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

基于PRT的泪液采样与脂质提取的优势 
本文所介绍的基于PRT的泪液脂质组学流程提供了一种微创且实用的采样方法，适用于全面的泪液脂质谱分析。与需要较长时间接触且采集样本量较大的Schirmer试纸条相比，PRT采样速度快，可在2分钟内完成，适用于包括泪液分泌减少或眼部敏感性增高在内的多种人群，且所获得的泪液样本适用于高分辨率液相色谱-质谱（LC-MS）脂质组学分析14,20。与耗时较长、操作技术要求高且依赖操作者经验的微毛细管管采集方法不同，基于PRT的采样方法几乎无需专门培训，可在临床环境中轻松实施，具有高度的可重复性和易用性14。在脂质提取方法方面，采用MTBE/甲醇体系的液相分离法避免了氯仿的毒性，同时对大多数脂质类别而言，其脂质回收率与传统的Folch法和Bligh-Dyer法相当甚至更优，尽管在某些极性较强的溶血磷脂（如LPC、LPE）上回收率可能略有降低。该流程成功鉴定出跨越23个脂质类别的700余种独特泪液脂质分子，...

泪膜是最外层的屏障，可保护眼表免受病原体侵袭并维持眼部稳态1,2，而泪膜中的脂质层是防止泪液蒸发和维持泪膜稳定性的关键成分3,4。泪脂成分的失调已与多种眼病相关，包括干眼症（DED）、睑板腺功能障碍（MGD）和过敏性结膜炎5,6,7,8。因此，对泪脂组学进行详细表征已成为一项重要且前沿的研究方向，有助于更全面地理解这些眼表疾病背后的分子病理机制9。
尽管泪液脂质组学方法具有重要的临床意义，但泪液脂质组学面临的一个关键挑战是建立标准化、可重复的采集与分析流程。目前的泪液采样方法，如Schirmer试纸条和微毛细管，各自存在明显局限性。Schirmer试纸条与眼表接触面积较大，常引起眼部刺激和反射性流泪9,10。相比之下，微毛细管采集高度依赖操作者技术，不同人员操作时可能产生不一致的结果11。此外，这些采样工具使用不当还可能带来眼表损伤的风险。这些局限性可能影响后续数据分析的准确性和可重复性12,13。此外，需要复杂操作步骤的泪液采集方法可能限制其在不同实验室和临床环境中的普及与标准化。因此，迫切需要建立一种无创、可靠且可重复的泪液采集与处理流程，以保持泪液原始脂质谱的完整性。
近期研究强调了酚红棉线（PRT）在蛋白质组学和代谢组学应用中用于下游液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析流程的实用性14,15。PRT作为泪液采集工具具有内在优势。其纤细的结构、微侵入性以及简便的采样过程可最大限度地降低技术复杂性，减少操作者依赖的变异性，同时被大多数受试者良好耐受14,16。然而，目前尚未建立针对基于PRT的泪液脂质组学分析的标准化流程。
本方案介绍了一种可重复的泪液脂质组学整合工作流程：一种基于PRT的、适用于脂质分析的用户友好型泪液采集方法，一种经优化的甲基叔丁基醚（MTBE）/甲醇脂质提取方案，包含明确的溶剂与样本比例及储存控制17,18，以及一种利用高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）改进的脂质鉴定方法。该标准化方法可实现稳定的泪液脂质组学分析，有助于后续生物标志物的发现和疾病特征的刻画。此外，该方法特别适用于泪液量较少或对异物感耐受性较低的受试者（图1）。
<img alt="Phenol red thread method; diagram of human tear lipid analysis via LC-MS/MS and lipid identification." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69474/69474fig1.jpg" data-altupdatedat="1773047343000" data-alt="Figure 1"> 
图1基于酚红线（PRT）的人类泪液脂质组学工作流程示意图采用PRT方法采集受试者的泪液，该方法可实现稳定且几乎无不适感的样本获取。样本处理包括依次使用甲基叔丁基醚/甲醇进行两相萃取、SpeedVac浓缩以及泪液脂质提取物的重悬，以用于液相色谱-串联质谱分析（LC-MS/MS）。随后获取脂质组学谱图 通过 LC-MS/MS 分析，并使用 LipidSearch 软件进行注释与鉴定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69474/69474fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>乙腈（ACN），液相色谱-质谱级</td><td>RCI Labscan</td><td>LM1005</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC CSH C18 色谱柱</td><td>沃特世公司</td><td>186005297</td><td>130&amp;Aring;, 1.7 &amp;micro;2.1 mm × 100 mm</td></tr><tr><td>甲酸铵，LC-MS级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>55674</td><td></td></tr><tr><td>自动进样器玻璃小瓶</td><td>威尔里奇科学公司</td><td>2ML-9-V1002</td><td>2 mL 透明玻璃瓶，12×32 mm 平底，9-425 螺纹，带标签（含书写区）</td></tr><tr><td>蓝色 9-425 开顶螺纹盖&amp;nbsp;</td><td>威尔里奇科学公司</td><td>9-SP1003</td><td>带9毫米白色聚四氟乙烯/红色硅胶隔垫，1毫米</td></tr><tr><td>氯仿，HPLC 级</td><td>杜克桑试剂</td><td>1271</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 离心管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>甲酸（FA），&amp;nbsp; LC-MS 级</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>玻璃微量插件</td><td>威尔里奇科学公司</td><td>2ML-N2002</td><td>250 &amp;micro;l 插入件，透明玻璃，锥形底带聚苯乙烯弹簧，规格：5.8*28.5mm</td></tr><tr><td>异丙醇，液相色谱-质谱级</td><td>RCI Labscan</td><td>LM1162</td><td></td></tr><tr><td>LipidSearch 软件</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>OPTON-30879</td><td>版本 5</td></tr><tr><td>甲醇，&amp;nbsp; LC-MS级</td><td>RCI Labscan</td><td>LM1115</td><td></td></tr><tr><td>酚红棉线试验&amp;nbsp; (PRT)</td><td>天津精明新技术开发有限公司</td><td>20192160086</td><td></td></tr><tr><td>冷藏离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>冷藏式CentriVap离心浓缩仪及CentriVap冷阱</td><td>Labconco</td><td>16108335</td><td></td></tr><tr><td>带螺帽微量管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3488</td><td></td></tr><tr><td>叔丁基甲基醚（MTBE），HPLC 级</td><td>杜克桑试剂</td><td>1070</td><td></td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技 Dionex UltiMate 3000 高效液相色谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Orbitrap IQ-X Tribrid 质谱仪</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSN05-10001</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>Crest 超声波</td><td>P500D-45</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>基准测试</td><td>BV1003</td><td></td></tr></tbody></table>

基于酚红棉线采样法用于生物标志物发现中非靶向泪液脂质组学研究

Phenol Red Thread-based Sampling Procedure for Untargeted Tear Fluid Lipidomics in Biomarker Discovery

泪液脂质对于泪膜稳定性和眼表健康至关重要。泪液成分的变化可能与睑板腺功能障碍和脂质代谢紊乱等眼部及全身性疾病相关。对泪液脂质进行谱型分析，有助于发现可用于疾病诊断与管理的生物标志物。然而，常规的泪液采样方法存在明显局限性：Schirmer 试纸因其与眼表接触面积较大，常引起眼部刺激和不适；而毛细管采集法则由于操作者间差异，尤其是不同人员操作时，可能导致重复性较差。这些局限性可能影响脂质组学数据的准确性和一致性。本研究介绍了一种基于酚红线（PRT）的微创采样方法，经优化适用于泪液脂质组学分析。PRT 的细小结构可最大限度降低眼部刺激风险，并实现快速、轻柔的泪液采集。该方法操作简便、用户友好，适用于泪液量减少或对异物感耐受性较低的受试者，同时通过减少操作者依赖性差异，提高了样本采集的可重复性。采用优化的甲醇/甲基叔丁基醚（MTBE）相分离法提取 PRT 采集的泪液脂质，并通过高分辨 LC-Orbitrap-IQX MS/MS 结合 LipidSearch 软件进行分析。该工作流程鉴定出超过 700 种独特的泪液脂质分子，每种均通过特定的脂肪酸来源产物离子加以表征。结果表明，基于 PRT 的采样方法可实现稳定的脂质回收，适用于泪液脂质组学分析。这种微创且可重复的方法为临床和实验性泪液脂质研究提供了实用平台，最终也有助于生物标志物的发现和疾病监测。

从16名健康志愿者中采集了复合泪液样本，每位志愿者分别在三个独立的访视中进行采样，每次访视间隔两周（R1为最早批次；R2、R3依次在前一次采样后两周采集）。使用LipidSearch软件并设定严格筛选标准（即信噪比≥100、等级为C及以上，离子强度≥30,000），在R1–R3样本中分别鉴定出773、890和1,025种独特的脂质分子（图5A）。正离子模式共鉴定出1,302种脂质分子，其中26.0%为A级（即脂质类别及该脂质的所有脂肪酸链均被完全鉴定；共338种脂质），13.2%为B级（即脂质类别完全鉴定，脂肪酸链部分鉴定），60.8%为C级（即检测到特异于脂质类别的离子或由脂肪酸衍生的产物离子）。负离子模式鉴定出257种独特的脂质分子，其中8.2%为A级（21种脂质），22.9%为B级，68.9%为C级（图5B）。两种模式联合分析共检测到1,559种不同的脂质分子。尽管存在与储存相关的差异，仍有394种脂质分子在全部三个样本集中被稳定检出（图6）。三次访视间...

本方案描述了一种独特的临床方案，采用酚红线法采集人泪液样本，并结合基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的工作流程，用于发现泪液脂质组学特征。该简单的甲基叔丁基醚（MTBE）/甲醇双相分离方法可实现快速泪液脂质提取，具有高回收率，适用于泪液生物标志物的发现。

泪液脂质对泪膜稳定性和眼表健康至关重要。泪液成分的改变可能与眼部及全身性疾病相关……

我们建立了一种更为标准化且易于操作的基于酚红线的方法，以帮助获得可重复的眼泪脂质组学谱，用于未来眼泪生物标志物的发现。目前的挑战在于，Schirmer试纸会引起刺激，而毛细管在泪液采集过程中存在操作者间的变异性。这阻碍了实验结果的可报告性以及不同研究之间的比较。首先，戴上手套并彻底消毒工作台，以防止样本受到任何污染。用手握住酚红线的弯曲钩的对侧末端，注意不要触碰弯曲钩部分。请受试者将视线转向上方鼻侧方向。然后轻轻下拉受试者的下眼睑，将酚红线试纸的弯曲钩端置于靠近眼外角的下侧睑结膜处。接着，请受试者轻轻闭上眼睛，并将头部略向前倾，以防止酚红线试纸接触面部皮肤。再次下拉受试者的下眼睑，轻轻取出酚红线试纸，避免接触采样区域。记录所取红色区域的长度。使用无菌镊子将PRT转移至新的样本管中。然后正确标记并盖好样本管。如果采集的长度小于50毫米，则让受试者休息一至三分钟，然后使用同一只眼睛重复采集泪液。将每条新采集的PRT分别放入单独的样本管中。使用甲醇和干净的擦镜纸彻底清洁手套和镊子，以去除任何泪液残留物或污染物。然后让其完全自然晾干。用封口膜密封所有样品管，并立即于-20摄氏度条件下暂存，或于-80摄氏度条件下长期保存。在处理酚红棉线前，先用甲醇预清洗显微剪刀和镊子。将每根酚红线的弯曲钩端从末端起约前三毫米处剪除。将酚红染料前沿之前的取样区域切成两毫米长的小段，并用干净的1.5毫升耐有机溶剂的微量离心管收集这些片段。丢弃弯曲钩端及PRT的无用部分。将样品置于冰上，以在提取前保持低温。向每个样品中加入232 µL预冷的质谱级甲醇，涡旋振荡15秒以充分混匀。将样品置于预冷的超声波清洗仪中，超声处理15分钟。然后向每个样品中加入 774 µL HPLC 级甲基叔丁基醚和 194 µL 去离子水。再次涡旋振荡 15 秒，使溶剂充分混匀。将样品再次置于预冷的超声清洗仪中，超声处理 15 分钟。超声处理后，将样品置于设置为4°C、以1,200转/分钟振荡的ThermoMixer中孵育8小时。然后将混合物在室温下静置10分钟。在4°C条件下，以10,000 G离心10分钟。离心后，确保混合物明显分离为两个不同的液相。小心吸取含有脂质的上层有机相700微升，并转移至预冷的新的1.5毫升微量离心管中。将含有残余甲基叔丁基醚和甲醇的下层水相作为危险化学废物弃去。使用预冷的真空离心浓缩仪在4°C条件下干燥脂质提取物，持续4小时。随后将干燥后的脂质提取物在-20°C下短期保存或在-80°C下长期保存。通过将甲醇与氯仿按1:1的体积比混合，配制甲醇-氯仿溶剂混合液。使用 50 微升预冷的甲醇-氯仿溶剂混合液重新溶解干燥的脂质提取物。将重新溶解的溶液置于预冷的超声清洗仪中，超声处理 15 分钟。随后，在 14,000 G 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。将40微升所得上清液小心转移至配有玻璃插件的自动进样器玻璃小瓶中。使用无切口隔垫的敞口盖将小瓶 tightly 密封，以备进行液相色谱-串联质谱分析。根据严格的标准，在第一组重复、第二组重复和第三组重复样本中，分别鉴定出773、890和1,025种独特的脂质种类。正离子模式鉴定出1,302种脂质分子，其中约26%为A级，13.2%为B级，60.8%为C级鉴定结果。负离子模式鉴定出257种脂质分子，其中约8.2%为A级，22.9%为B级，68.9%为C级鉴定结果。尽管存在与储存相关的差异，但在全部三组样本中均稳定鉴定出394种独特的脂质分子。在正离子模式下，三次访视间的受试者间变异系数为21.5%，负离子模式下为31.3%。本方案针对缺乏标准化流程以实现可重复的泪液脂质组学分析这一问题，有助于提高不同研究之间的可比性。我们基于PRT的方法可最大限度减少刺激，实现快速泪液采集，并降低操作者间的差异性。我们未来的研究将在大规模队列中验证泪液脂质组学生物标志物，并整合多组学数据以实现个体化诊断。

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