坏死性凋亡期间溶酶体膜透化的活细胞成像

本方案描述了一种活细胞成像方法，利用荧光探针检测溶酶体膜完整性和酸化变化，监测死尸灭亡期间溶酶体膜渗透。该领域的挑战在于表征细胞器在细胞死亡过程中受损的动态，并精确界定这种损伤应如何驱动或促成细胞死亡。首先，将5000个细胞在两毫升抗生素补充DMEM培养基中进行无菌玻璃底盘中进行洗涤。

将盘放入设定在37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中，并过夜孵育。将20微升右旋糖酐绿珠加入25微克/毫升，加入新鲜抗生素补充的DMEM培养基中稀释。将旧培养基从盘中取出，换上含牛肉的2毫升补充DMEM培养基。

将盘放入设定为37摄氏度、含5%二氧化碳的培养箱中，孵育24小时，让珠子内化为溶酶体。现在将两微升一毫莫拉LysoTracker液加入两毫升新鲜DMEM培养基中。用这种染色溶液替换旧介质。

将细胞与5%二氧化碳在37摄氏度下孵育两小时。通过开启个人电脑、显微镜、扫描电源、激光电源、激光发射和徕卡电源，来启动共軛焦系统组件。打开环境控制，包括温度控制器（称为“立方体”）和二氧化碳气体混合控制器（称为“砖块”）。

打开二氧化碳和氧气供应。把温度控制器调到37摄氏度。把燃气和湿度控制器设置为5%二氧化碳和95%湿度。

组装成像舱。染色后，用2毫升PBS清洗细胞三次，然后加入2毫升新鲜补充的DMEM培养基。成像前先在物镜上涂抹浸油。

将天线安装在显微镜舞台上。将激光强度调整至3%但不超过5%，然后在显微镜软件中调整探测器增益以优化信号。通过调整对比度条来最小化背景。

获取未处理细胞的基线图像，作为对照条件。将平板放回层流罩，加入一毫升抗生素DMEM，辅以细胞死亡诱导剂。在采集软件中，将模式设置为XYT，格式化为512乘512，速度为400，变焦为3，线平均为1，线累积为3，帧累积为1，时间间隔为3分钟，持续时间为8小时，并启用自动对焦。

点击开始开始时移采集。初步影像确认LysoTracker和荧光素标记右旋糖酐的圆点稳定存在，表明治疗前溶酶体完整。TSZ治疗后四小时，LyoTracker荧光明显减弱，而右旋糖酐开始显示细胞质分布弥漫，表明初期溶酶体膜渗透。

治疗后8小时，LysoTracker信号几乎完全消失，许多细胞保留绿色右旋糖酐点，细胞质信号为绿色。我们证明，溶酶体膜的渗透作用可以在正在进行死细胞诱导的活细胞中直接观察到。该方案证明，LysoTracker和右旋糖酐微珠的结合能够实时监测溶酶体pH值和货物释放情况。

而该活细胞成像协议的进步之关键在于其能够实时监测小幅pH变化和溶酶体膜通透，捕捉流式细胞术和单层染色等终点分析中遗漏的动态事件。