Name: 胶质纤维酸性蛋白及其疾病相关变异生化分析的实验方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-28T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 学习GFAP生化分析方法，研究胶质纤维酸性蛋白及其疾病相关变异，探索亚历山大病的发病机制。该方法利用电子显微镜和层析技术，为神经退行性疾病研究提供标准化实验方案。

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我们感谢 Tracy Hagemann 博士（美国威斯康星大学麦迪逊分校 Waisman 中心）提供了 R237H 基因敲入大鼠。衷心感谢 Albee Messing 教授（美国威斯康星大学麦迪逊分校 Waisman 中心）在本研究中提出的建议与支持。本研究得到了科技部资助（项目编号：111-2320-B-007-008 和 112-2320-B-007-006，授予 N.-H. L. 和 M.-D. P.）。我们同时感谢中国台湾国立清华大学生物电子显微镜中心（MOST-104-2731-M-007-002）提供本研究所用设备。

本研究使用的动物是携带 R237H 基因敲入突变的 AxD 模型大鼠11。所有动物实验均经国立清华大学生命科学与医学学院动物实验管理委员会批准（NTHU IACUC 批准号：109088 和 111060），并遵循《实验动物照护与使用指南》中的相关规定。
1. 从细菌中纯化重组GFAP（图1）
<ol>
	<li>转化 E. coli 含WT或突变型GFAP cDNA的pET23b载体的BL21(DE3) pLysS菌株。</li>
	<li>在含有100 µg/mL氨苄青霉素和34 µg/mL氯霉素的1 L LB（Luria-Bertani）培养基中，于37 °C培养细菌至OD600约为0.2。</li>
	<li>加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，0.5 M），使其终浓度为 0.5 mM，在 37 °C 诱导 GFAP 表达 4 小时。</li>
	<li>通过离心收集细菌，离心条件为 6,371 xg 4 °C 下孵育 30 分钟。</li>
	<li>在Dounce匀浆器中，用50 mL TEN缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 8，5 mM EDTA，150 mM NaCl）并添加0.2 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）裂解细菌。</li>
	<li>以 22,045 x g 离心细菌裂解液g 在4 °C下孵育20分钟，然后用Triton X-100缓冲液（含1% (v/v) Triton X-100的TEN缓冲液）重悬沉淀。</li>
	<li>在相同条件下离心后，用高盐缓冲液（TEN 加 1% (v/v) Triton X-100 和 1.5 M KCl）提取所得沉淀。</li>
	<li>在相同条件下离心后，用TEN缓冲液洗涤沉淀。</li>
	<li>将最终沉淀物溶于10 mL尿素缓冲液（8 M尿素，20 mM Tris-HCl，pH 7.4，5 mM EDTA，0.2 mM PMSF）中，室温下搅拌3小时。</li>
	<li>80,000 × g 离心尿素提取物g 在4 °C条件下，于台式超速离心机中离心20分钟。</li>
	<li>向尿素可溶性组分中加入聚乙烯亚胺（1% (v/v)），使其终浓度为 0.06% (v/v)，冰上孵育 5 分钟。</li>
	<li>在 80,000 x g 条件下离心g 4 °C 下孵育 20 分钟，然后将上清液部分用缓冲液 A（6 M 尿素，20 mM MES，pH 6.0，14.4 mM β-巯基乙醇）进行透析。</li>
	<li>将透析液上样至NGC蛋白纯化系统中预先用缓冲液A平衡的CM-Sepharose离子交换柱。</li>
	<li>使用缓冲液A中0-0.5 M NaCl的线性梯度，在1 mL/min流速下洗脱蛋白质，持续1小时。</li>
	<li>合并含GFAP的组分，并用缓冲液B（6 M尿素，10 mM Tris-HCl（pH 8.0）和1 mM EDTA）透析。</li>
	<li>将透析液上样至预先用缓冲液B平衡的阴离子交换柱。以缓冲液B中0-0.5 M NaCl的线性梯度在1 mL/min流速下洗脱蛋白质，历时1小时。</li>
	<li>通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析柱流份。收集含有纯化GFAP的流份，并于-80 °C保存。 
	注意：可通过多次冻融循环促进细菌裂解。聚乙烯亚胺的终浓度不应超过0.06%（v/v），否则会导致蛋白质共同沉淀。操作PMSF和β-巯基乙醇等危险物质时，必须提供明确的安全操作指导和危险废物处理说明。PMSF具有高毒性，可引起皮肤、眼睛和呼吸道刺激。应在通风橱中新鲜配制PMSF溶液，并避免直接接触。β-巯基乙醇应在通风良好的环境中使用，因其会释放强烈且有毒的气体。</li>
</ol>
2. 体外 组装与沉降实验（图2)
<ol>
	<li>将纯化的野生型或突变型 GFAP 用含 6 M 尿素的低盐缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8，1 mM EDTA 和 14.4 mM β-巯基乙醇）稀释至 0.3 mg/mL。</li>
	<li>将样品在室温下分别用含 4 M 和 2 M 尿素的低盐缓冲液透析 4 小时。</li>
	<li>将样品在 4 °C 下用不含尿素的低盐缓冲液透析过夜。</li>
	<li>将样品在室温下用组装缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7，50 mM NaCl 和 14.4 mM β-巯基乙醇）透析 12–16 小时。</li>
	<li>将组装混合物转移至含 0.2 mL 组装缓冲液中 0.85 M 蔗糖的蔗糖垫顶部。</li>
	<li>在高速沉降实验中，使用台式微量超速离心机在 20 °C 下以 80,000 ×g 离心 20 分钟。</li>
	<li>通过甲醇/氯仿沉淀法浓缩上清组分中未组装的 GFAP15。将沉淀物重悬于 0.2 mL Laemmli 样品缓冲液（25 mM Tris-HCl（pH 6.8），1%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS），12.5%（v/v）甘油，0.01%（w/v）溴酚蓝和 355 mM β-巯基乙醇）中。</li>
	<li>将沉淀组分中已组装的 GFAP 用 Laemmli 样品缓冲液重悬。</li>
	<li>将上清和沉淀组分均在 10%（w/v）SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上电泳，并用 10 mL 考马斯亮蓝染色。</li>
	<li>在低速沉降实验中，使用台式离心机在 20 °C 下以 3,000 ×g 离心 5 分钟。</li>
	<li>向上清组分中未聚集的 GFAP 加入 0.2 mL Laemmli 样品缓冲液。</li>
	<li>将沉淀组分中聚集的 GFAP 直接用与上清组分体积成比例的 Laemmli 样品缓冲液重悬。</li>
	<li>通过 10%（w/v）SDS-PAGE 凝胶分析上清和沉淀组分，随后进行考马斯亮蓝染色。 
	注意：甲醇和氯仿为有毒溶剂，可能引起严重健康危害。避免皮肤接触和吸入。应在通风橱中谨慎操作，防止泄漏。</li>
</ol>
3. 负染色法与电子显微镜观察（图2）
<ol>
	<li>在辉光放电清洗系统中，将覆有Formvar/碳膜的铜网在20 mA条件下进行45秒的辉光放电处理。</li>
	<li>将组装混合物滴加至经辉光放电处理的铜网上，使样品在支撑膜上结合60秒。</li>
	<li>用滤纸边缘轻轻吸去铜网边缘的多余液体。</li>
	<li>用蒸馏水洗涤铜网，然后加入20 µL 1% (w/v) 醋酸铀酰溶液染色60秒。</li>
	<li>去除多余的染色液，让铜网在空气中干燥30秒。</li>
	<li>使用H-7600透射电子显微镜（TEM），在100 kV加速电压下的高分辨率模式下观察铜网。 
	注意：在添加蛋白质样品前，于真空蒸发器中对铜网进行辉光放电处理，可改善样品在铜网上的吸附效果。醋酸铀酰是一种具有放射性且高度毒性的化学试剂，常用于电子显微镜的负染色。操作时必须严格遵守安全规程和危险废物处置指南，以最大限度降低对人员和环境的暴露风险。配制醋酸铀酰溶液时，仅可在通风橱内进行，以防止吸入空气中的颗粒或蒸气。</li>
</ol>
4. 氧化修饰（图3）
<ol>
	<li>在室温下，将GFAP溶于含6 M尿素的低盐缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8，1 mM EDTA和14.4 mM β-巯基乙醇）中，稀释至0.3 mg/mL，孵育2小时。</li>
	<li>在室温下，用含4 M尿素的低盐缓冲液透析2.5小时。使用磁力搅拌器轻轻搅拌缓冲液，以保持均匀分布并防止浓度梯度形成。</li>
	<li>2.5小时后，将透析膜转移至含2 M尿素的低盐缓冲液中，在室温下继续透析2.5小时，全程保持轻柔搅拌。</li>
	<li>在4 °C下，用不含尿素的低盐缓冲液透析18小时。</li>
	<li>将透析后的样品用10 mM H2O2处理15分钟，随后在室温下用10 mM或100 mM二硫苏糖醇（DTT）再处理15分钟。</li>
	<li>通过标准10%（w/v）SDS-PAGE（不含β-巯基乙醇）分析蛋白样品，并用10 mL考马斯亮蓝染色。 
	注意：H2O2为强氧化剂，可引起灼伤，操作时应格外小心。需佩戴个人防护装备，避免接触皮肤和眼睛。DTT可能对皮肤、眼睛和呼吸系统造成刺激。使用DTT和H2O2时，必须遵循适当的安全操作规程，以最大限度降低风险。</li>
</ol>
5. 从 AxD 大鼠脑中纯化 GFAP（图 4A，B）
<ol>
	<li>使用Douce匀浆器，以10 mL TEN缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，100 mM NaCl和5 mM EDTA）提取脑组织。</li>
	<li>将脑匀浆在4 °C下以76,000 ×g离心20分钟，然后用10 mL Triton X-100缓冲液（TEN缓冲液中含1% (v/v) Triton X-100）提取所得沉淀。</li>
	<li>在4 °C下以76,000 ×g离心20分钟，然后用10 mL蔗糖缓冲液（0.85 M蔗糖和0.5% (v/v) Triton X-100溶于TEN缓冲液）提取所得沉淀。</li>
	<li>在4 °C下以76,000 ×g离心20分钟，然后用10 mL高盐缓冲液（1.5 M KCl和0.5% (v/v) Triton X-100溶于TEN缓冲液）提取所得沉淀。</li>
	<li>在4 °C下以76,000 ×g离心20分钟，然后用10 mL尿素缓冲液（8 M尿素，10 mM Tris-HCl，pH 7.4，和5 mM EDTA）提取最终沉淀。</li>
	<li>收集上清组分，并在Q柱缓冲液（6 M尿素，10 mM Tris-HCl，pH 8，5 mM EDTA，和14.4 mM β-巯基乙醇）中透析。</li>
	<li>将透析后的样品加载至NGC层析系统中的阴离子交换柱。</li>
	<li>以Q缓冲液中0–0.5 M NaCl的线性梯度、1 mL/min的流速洗脱结合蛋白。</li>
	<li>合并含GFAP的组分，并在S柱缓冲液（6 M尿素，20 mM MES，pH 6，和14.4 mM β-巯基乙醇）中透析。</li>
	<li>将透析后的样品上样至阳离子交换柱，然后以S缓冲液中0–1 M NaCl的线性梯度、1 mL/min的流速洗脱结合蛋白。</li>
	<li>通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析洗脱组分，并收集含有纯化GFAP的组分。</li>
</ol>
6. 通过免疫印迹分析GFAP的泛素化（图4C）
<ol>
	<li>在10%（w/v）SDS-PAGE凝胶上电泳纯化的GFAP。</li>
	<li>将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜上。</li>
	<li>用含有0.1%（v/v）Tween 20的10 mL 3%（w/v）牛血清白蛋白TBS溶液（TBS：20 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl）在室温下孵育膜1小时以进行封闭。</li>
	<li>将膜与5 µL抗GFAP抗体和5 µL抗泛素一抗溶于5 mL TBST中，于4 °C孵育过夜。用TBST洗涤膜三次。</li>
	<li>将膜与5 µL 荧光染料标记的二抗（用5 mL TBST稀释）在室温下孵育至少1小时。用TBST洗涤膜三次。</li>
	<li>使用荧光图像检测系统采集图像。</li>
	<li>分析 体外 通过透射电子显微镜和沉降实验组装天然GFAP图5）采用与步骤2.1至2.13以及步骤3.1至3.6中所述相同的方法进行。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案建立了一个全面的实验框架，用于对GFAP及其疾病相关突变体进行生物化学表征。通过提供一种可靠且标准化的方法，该技术为深入理解GFAP的生物学功能及其病理学意义提供了重要资源，尤其在Alexander病（AxD）的研究背景下具有重要意义。在本节中，我们将讨论该方案的若干关键方面，包括可能的改进方法与故障排除策略、本方法的局限性、相较于现有技术的优势，以及其在特定研究领域中的广泛重要性与应用价值。
本研究建立了重组野生型GFAP及其疾病相关突变体纯化的标准化方案（图1），为后续的体外分析提供了便利。该详细方案可作为中间丝（IF）研究领域的重要参考，确保以高产量和高纯度可靠地制备GFAP蛋白。值得注意的是，该方案具有两个显著的实用优势：操作简便且易于放大。为确保GFAP纯化的可靠性与可重复性，以下几个关键步骤至关重要。首先，提取与纯化过程所使用的缓冲液经过专门优化，以维持GFAP的溶解性与稳定性，从而防止其沉淀并保持功能活性。例如，当缓冲液pH接近GFAP的等电点（约5.2）时，其溶解度降低，易发生沉淀。...

Alexander病（AxD）是一种由编码胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的基因发生显性突变所引起的遗传性疾病1，GFAP属于III型中间丝（IF）蛋白，主要存在于成熟的星形胶质细胞中。AxD的特征包括GFAP表达上调2、反应性星形胶质细胞增生3，以及Rosenthal纤维的积聚，后者是由GFAP及其相关蛋白（如αB-晶状体蛋白4和泛素5）组成的蛋白包涵体。GFAP基因的突变会破坏正常的中间丝组装过程6，导致异常聚集、诱发细胞应激反应7，并通过异常的翻译后修饰（PTMs）——如磷酸化8、氧化9和泛素化10——进一步加剧蛋白稳定性失调。
尽管GFAP在AxD病理过程中起着核心作用，但突变型GFAP如何破坏中间丝组装、促进蛋白聚集并诱导细胞应激的分子机制仍不清楚。这一知识空白阻碍了针对GFAP聚集和毒性的靶向治疗策略的开发。研究GFAP及其与AxD相关变异体的生物化学特性，对于揭示疾病进展的分子机制至关重要。然而，GFAP本身易于聚集的特性及其在疾病相关变异体中异常的组装行为，为实验分析带来了独特的挑战。开展可控的生化研究需要纯化的GFAP蛋白，可通过动物模型或重组表达获得，以探究AxD突变对中间丝组装、蛋白聚集及病理修饰的影响。
本研究中介绍的实验方法相较于其他技术具有多项优势。例如，尽管基于细胞的模型11和免疫组织化学研究12能够为GFAP的表达与定位提供有价值的见解，但由于细胞环境的复杂性，这些方法往往难以精确揭示中间丝组装与聚集的生化机制。相比之下，本文所述的方法（如体外（in vitro）中间丝组装实验、沉降分析以及翻译后修饰（PTM）表征）能够对GFAP及其疾病相关变异体的内在生化特性进行可控研究。这些方法使研究人员能够在简化的体系中解析中间丝的组装与聚集行为，有助于揭示GFAP功能障碍的分子机制。既往研究已证明，此类生化技术在分析中间丝蛋白（如desmin13和角蛋白keratins14）方面具有实用性，进一步印证了其在GFAP研究中的适用性。
此外，本文还提供了相关信息，帮助读者判断所述方法是否适用于其特定的应用场景。对于致力于研究GFAP的生化特性、组装行为或翻译后修饰（PTMs）的研究人员而言，这些技术在探究与疾病相关的变异体及其病理效应方面尤为有用。通过将这些生化方法与其他实验体系（如基于细胞的研究或动物模型）相结合，研究人员能够更全面地理解GFAP在Alexander病（AxD）及其他相关星形细胞病中的功能障碍机制。
本方法的总体目标是介绍针对GFAP及其与Alexander病（AxD）相关变异体的生化分析实验方法，包括蛋白质纯化技术、体外（in vitro）纤维组装实验、沉降分析以及翻译后修饰（PTM）的表征。这些方法为深入理解GFAP在AxD中功能障碍的分子机制提供了关键见解，为治疗策略的开发奠定了基础。此外，这些实验技术的应用将推动我们对AxD中GFAP生物化学特性的认识，并促进中间纤维（IF）研究领域的整体发展。

<table><tbody><tr><td>30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 37.5:1</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>usb</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>抗GFAP抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>12389</td><td></td></tr><tr><td>抗泛素抗体</td><td>Millipore</td><td>ST 1200</td><td>克隆 FK2</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XP 离心机</td><td>贝克曼</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>usb</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>CM-Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>1707 1901</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝染料</td><td>usb</td><td>32826</td><td></td></tr><tr><td>铜网</td><td>Ted Pella</td><td>01753-F</td><td></td></tr><tr><td>CS 150 NX 微型超速离心机</td><td>日立</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>邓氏匀浆器</td><td>Wheaton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>尿液</td><td>DTT</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌 BL21(DE3) pLysS 菌株</td><td>安捷伦</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasiGlow</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL试剂</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL 105001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>usb</td><td>15699</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18312</td><td></td></tr><tr><td>HiRes S 柱</td><td>Cytiva</td><td>2927 5877</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q 柱</td><td>Cytiva</td><td>1711 5301</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>UR</td><td>IPTG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>霍尼韦尔</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基（LB琼脂）</td><td>usb</td><td>75851</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基（LB肉汤）</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>霍尼韦尔</td><td>31434S</td><td></td></tr><tr><td>NGC色谱系统</td><td>伯乐（BioRad）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 超速离心机</td><td>贝克曼</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>ACROS ORGANICS</td><td>215740050</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>转子</td><td>贝克曼</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S55S 转子</td><td>日立</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S80AT3 转子</td><td>日立</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>usb</td><td>75819</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 520 山羊抗小鼠 IgG&amp;nbsp;</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>12005867</td><td></td></tr><tr><td>StarBright Blue 700 山羊抗兔 IgG&amp;nbsp;</td><td>伯乐（BioRad）</td><td>12004161</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5391</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>usb</td><td>76320</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜 H-7700</td><td>日立</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>usb</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>电子显微镜科学&amp;nbsp;</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>霍尼韦尔</td><td>15604H</td><td></td></tr></tbody></table>

用于胶质纤维酸性蛋白及其疾病相关变异体生化分析的实验方法

Experimental Approaches for Biochemical Analysis of Glial Fibrillary Acidic Protein and Its Disease-associated Variants

胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是一种关键的中间丝蛋白，在维持中枢神经系统星形胶质细胞的结构完整性和功能中起重要作用。GFAP基因的突变是亚历山大病（AxD）的根本病因，该病是一种罕见且常致死的神经退行性疾病，其特征是GFAP水平升高以及GFAP以罗森塔尔纤维的形式积聚。本文概述了一整套用于生化表征GFAP及其致病突变体的实验方法。通过优化表达和先进的纯化技术，我们获得了高产量且高纯度的野生型和突变型GFAP蛋白。采用生化检测方法评估了致病性突变对中间丝组装、溶解性及聚集性的影响。此外，我们还探讨了异常翻译后修饰在GFAP聚集中的作用及其对中间丝特性的影响。本研究加深了我们对GFAP在AxD中作用的理解，并为开发靶向GFAP功能障碍的治疗策略奠定了基础。同时，本文所介绍的方法学为研究GFAP突变的生化后果以及推进GFAP相关疾病的干预措施提供了有价值的工具。

为了研究导致 Alexander 病的突变如何影响 GFAP 的组装特性，我们使用基于 PET 表达系统的细菌系统表达重组蛋白。本文详细描述了 GFAP 蛋白的表达与纯化方案，并以野生型 GFAP 为例进行说明。在 IPTG 诱导后（图 1A，第 2 泳道），GFAP 通过三步纯化流程进行纯化，包括包涵体的制备（图 1B）以及使用 CM 柱（图 1C，第 1 泳道）和 Q 柱（图 1C，第 2 和第 3 泳道）进行的离子交换层析。
通过透析法在体外组装纯化的重组GFAP，并采用醋酸铀负染色后结合电子显微镜进行观察。野生型GFAP形成典型的10 nm中间丝（图2A），而R239H突变型GFAP则倾向于发生聚集（图2B）。低速离心实...

本研究概述了对GFAP及其致病突变进行生化表征的实验方法，重点在于中间丝的组装、聚集以及翻译后修饰。通过对高纯度GFAP蛋白的分析，揭示了Alexander病发病机制的相关见解，可能为研究潜在治疗靶点以及理解GFAP突变及相关疾病提供框架。

胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是一种关键的中间丝蛋白，对维持星形胶质细胞的结构完整性和功能至关重要……

我的研究聚焦于受累星形胶质细胞中GFAP的变化，以及其功能障碍如何导致亚历山大病。我们分享了易于遵循的GFAP研究方法。与疾病相关的GFAP变异体更难研究，因为它们无法正常组装，容易聚集，并具有异常的修饰。首先，将辉光放电仪的电离棒和碳支持膜铜网放入辉光放电清洗系统中。在20毫安电流下对铜网进行45秒的清洗。将样品混合液滴加到经辉光放电处理的铜网上。用滤纸边缘吸去多余的液体，然后用蒸馏水清洗载网。用 20 微升 1% 醋酸铀染色液对载网染色 60 秒。去除多余的染色液，让载网在空气中干燥30秒。使用透射电子显微镜，以100千伏的加速电压在高分辨率模式下观察制备好的载网。使用含有10毫升10缓冲液的匀浆器从小鼠脑白质营养不良大鼠中提取脑组织。将脑匀浆在4°C条件下以76,000 G离心20分钟。随后依次用10毫升Triton X-100缓冲液、蔗糖缓冲液、高盐缓冲液和尿素缓冲液提取所得沉淀。收集上清组分，并用Q柱缓冲液进行透析。现在将透析后的样品上样至NGC色谱系统的阴离子交换柱中。使用Q缓冲液中0至0.5摩尔氯化钠的线性梯度，以每分钟1毫升的流速洗脱结合的蛋白质。合并含有胶质纤维酸性蛋白的组分，并将其对S柱缓冲液进行透析。现在将透析后的样品上样至阳离子交换柱，并在S缓冲液中以每分钟1毫升的流速，使用0至1摩尔氯化钠的线性梯度洗脱结合的蛋白质。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析洗脱组分。收集含有纯化胶质纤维酸性蛋白的组分。野生型GFAP在体外形成均匀的10纳米丝状结构，而R239H突变体则产生致密的聚集结构。在低速离心条件下，大部分野生型GFAP保留在上清液中，而大多数R239H突变型GFAP存在于沉淀组分中。在高速离心条件下，几乎所有野生型GFAP和R239H突变型GFAP均出现在沉淀组分中，表明沉淀效率良好。经双氧水处理后，野生型GFAP形成多个高分子量条带，这些条带可被DTT还原为单体形式。在无氧化应激的情况下，R239H GFAP 形成了一条分子量约为 180 千道尔顿的高分子量条带，需要高浓度的二硫苏糖醇才能将其转化为单体形式。定量分析证实，与野生型 GFAP 相比，更高比例的 R239H GFAP 以高分子量形式存在。免疫印迹证实，R237H 大鼠脑组织中的天然 GFAP 存在泛素化修饰，表现为 GFAP 与泛素信号的重叠。电子显微镜显示，来自 Alexander 病大鼠脑组织的 GFAP 无法形成纤维。在低速离心条件下，大部分来自 Alexander 病大鼠脑组织的 GFAP 仍存在于上清液中；而在高速离心条件下，GFAP 沉淀至沉淀组分。定量分析证实，GFAP 在低速与高速离心之间的分布从上清液向沉淀组分发生了转移。目前我们仍不清楚突变型GFAP如何改变中间丝结构、引发蛋白聚集以及损害细胞功能。本方案可直接研究这些机制。我们已建立一种标准化方法，用于纯化正常和突变型GFAP蛋白，从而更便于研究该蛋白及其在疾病中的作用。本方案简化了正常和突变型GFAP的制备流程，以阐明纤维组装、聚集及修饰在 Alexander 病发病机制中的作用。

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胶质纤维酸性蛋白及其疾病相关变异生化分析的实验方法

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利用抗原表位修复法通过SDS-PAGE/免疫印迹检测人脑皮层组织匀浆中的Aβ多聚体

一种使用尿素/硫脲/SDS缓冲液从人和小鼠脑组织中提取蛋白质的常用方法，可实现通过二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）对蛋白质进行鉴定，并随后通过微型二维电泳免疫印迹法（mini 2DE...

共识脑源性蛋白质提取方案：用于人和小鼠脑蛋白质组研究的双向差异凝胶电泳与微型双向电泳免疫印迹法

通过结合原子力显微镜与生物淘选技术，我们建立了一套针对任意生物样本中疾病特异性蛋白质变体（即使浓度较低）的阴性和阳性生物淘选系统，成功获得了针对肌萎缩侧索硬化症相关TDP-43蛋白变体的抗体。...

基于新型原子力显微镜生物筛选技术分离肌萎缩侧索硬化中TDP-43变异体形态特异性试剂

本文描述了一种提供新型定量方法的ELISA。该方法利用针对Ser129磷酸化α-突触核蛋白（αS）形式或该蛋白C端区域的多种抗体，在突触核蛋白病的转基因小鼠模型（M83）中特异性检测与疾病相关的α-突触核蛋白（αSD）。...

检测过表达人源A53T突变型α-突触核蛋白转基因小鼠脑内与疾病相关的α-突触核蛋白：增强型ELISA法

本文介绍了一种从人死后脑组织中分离出溶解度逐渐降低/聚集态α-突触核蛋白（α-syn）的实验方案。通过使用去垢剂强度逐步增强的缓冲液，并结合高速超速离心技术，可检测病变与非病变组织中α-syn聚集特性的差异。...

从帕金森病患者脑组织中连续提取可溶性与不可溶性α-突触核蛋白

本文介绍了两种可单独或联合使用的方法，用于分析β-淀粉样蛋白对纤维蛋白凝块结构的影响。其中包括一种制备凝块的方案 体外...

通过光谱学与扫描电子显微镜分析β-淀粉样蛋白诱导的纤维蛋白凝块结构异常

本文介绍一种针对皮肤活检切片的游离式间接免疫荧光检测方案，可用于鉴定与帕金森病相关的α-突触核蛋白的疾病特异性构象变异体，以及周围神经系统中的多种蛋白质。...

通过游离免疫荧光检测法靶向皮肤外周神经纤维中的α-突触核蛋白聚集体

本方案描述了一种通过脑组织捐献项目及对脑组织进行适当表征来追踪个体脑衰老轨迹的方法。脑捐献者参与了一项长期纵向研究，包括系列多维度评估。本方案包含脑组织处理的详细描述以及准确的诊断方法学。...

Abbiategrasso脑库衰老大脑采集、处理与表征操作规程

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外...

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

本文介绍了一种从大鼠大脑皮层分离胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞以建立原代培养的实验方案，用于在hSOD1G93A大鼠模型中研究肌萎缩侧索硬化症病理生理机制时，进行细胞内Ca2+动态变化的延时视频成像。...

大鼠星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养及其在肌萎缩侧索硬化研究中的应用

这种结合质谱法蛋白质组学分析的生化纯化方法有助于对淀粉样纤维核心进行稳健表征，可能加速阿尔茨海默病防治靶点的发现。...

脑源性淀粉样纤维核心的生化纯化与蛋白质组学表征

学习GFAP生化分析方法，研究胶质纤维酸性蛋白及其疾病相关变异，探索亚历山大病的发病机制。该方法利用电子显微镜和层析技术，为神经退行性疾病研究提供标准化实验方案。

用于胶质纤维酸性蛋白及其疾病相关变异体生化分析的实验方法

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