从人类足月胎盘组织中分离纯化 HLA-G⁺ 细胞外滋养层细胞用于表型鉴定与功能分析

本方案旨在从人胎盘组织中分离纯化原代人滋养层细胞，以研究其在正常妊娠及病理条件下的功能特性与免疫学特性。因此，该方案提供了一个可重复的实验平台，克服了既往在使用原代人绒毛外滋养层细胞时存在的一些局限性，尤其是细胞活力问题。本方案经过优化，可显著提高细胞的活力与纯度。

首先，获取一个人类胎盘样本。将胎盘置于胎儿面朝上的位置，使脐带插入部位可见。手动从侧膜向脐带插入部位剥离羊膜，并将其移除。

然后使用剪刀剪除并丢弃羊膜。从胎盘基底部开始向上将绒毛膜蜕膜层切成两英寸长的条状，同时保持每条组织仍与胎盘相连。将绒毛膜蜕膜条置于两根手指上，使蜕膜面朝上。

用无菌弯头镊子轻轻刮取绒毛膜上的母体壁蜕膜组织。将壁蜕膜组织收集至一个含有 20 毫升 PBS 的 50 毫升锥形管中，用于淋巴细胞分离。随后将绒毛膜收集至另一个含有 20 毫升洗涤液 A 的 50 毫升锥形管中。用剪刀在 50 毫升管内将绒毛膜剪成小于 2 平方毫米的小块。

弃去管中的洗涤液A。用PBS反复洗涤组织，直至上清液变澄清。进行胎盘解剖时，将胎盘母体面朝上放置，并去除血凝块。

使用无菌剪刀剪取胎盘底板组织，避免取材于坏死、钙化或缺血区域。将含有绒毛的底蜕膜组织置于手指上，使绒毛面朝上。然后用剪刀小心去除绒毛，保留一层薄薄的绒毛层，获得一个厚度为二至三毫米的膜状组织。

将底蜕膜组织收集到含有20毫升PBS的50毫升锥形管中。然后将组织切成小于2平方毫米的小块。接下来，弃去管中的PBS。

用 PBS 反复洗涤底蜕膜，直至上清液清澈且无可见血液。然后将 15 毫升组织悬液均分至两个 50 毫升锥形管中。用 PBS 注满所有离心管。

将离心管在 200G 条件下离心一分钟，倒去上清液。向一个 300 毫升的玻璃瓶中加入 150 毫升温热的组织消化酶混合液。向瓶中加入 30 毫升绒毛膜组织。

将20毫升温热的DMEM/F-20和80毫升温热的组织消化酶混合液分别加入两个300毫升的玻璃瓶中。然后向每个瓶中加入7.5毫升底蜕膜组织。将瓶子置于水浴中孵育。

在15分钟孵育期间，每隔三到四分钟摇晃所有瓶子一次。消化完成后，使用孔径为40的金属筛过滤组织。然后加入洗涤液B冲洗组织，并溶解胶状物质。

将未消化的组织转移回玻璃瓶中，重复消化步骤。然后将细胞悬液通过100微米滤网过滤至已标记的50毫升锥形管中。第一次和第二次消化所得的细胞需分别保存。

然后以650 × g离心细胞悬液8分钟。弃去上清液。将相同组织类型和相同消化次数的沉淀合并至同一管中。

然后用洗涤液 B 定容至 25 毫升。在四个已标记组织类型和消化编号的 50 毫升锥形管中各加入 12 毫升 Ficoll。小心地将细胞悬液铺加在 Ficoll 液面上。

然后在室温下以800G离心20分钟，不要中断。小心吸取位于Ficoll培养基界面的细胞层，并转移至洁净的标记试管中。随后用洗涤液B补满试管，以650G离心8分钟，并重悬沉淀物。

将重悬的沉淀物放入已标记组织类型和消化编号的无菌荧光激活细胞分选管中。加入抗CD45 BV785、抗HLA GAPC和抗EGFR1 BV711抗体。室温避光孵育20分钟。

用洗涤液B洗涤并重悬细胞后，立即通过40微米细胞筛。将CD45阴性、HLA-G阳性、EGFR阳性的绒毛外滋养层细胞分选至含有1毫升EVT培养基A的试管中。谱系标志物流式细胞术分析显示，原代绒毛外滋养层细胞培养至第4天仍保持活性。分别在培养24小时、48小时和72小时后，采集原代绒毛膜和底蜕膜HLA-G阳性绒毛外滋养层细胞的代表性明场显微镜图像。

绒毛外滋养层细胞表达多态性HLAC以及免疫抑制性共抑制分子。当与活化的淋巴细胞共培养72小时后，绒毛外滋养层细胞增加了HLAC、PD-L1、PD-L2和HLA-E的表达，但未增加PVR和B7H3的表达。与活化的淋巴细胞共培养后，未观察到绒毛外滋养层细胞死亡增加。

该方案使得科研人员能够将原代绒毛外滋养层细胞用于多种检测。其优势在于细胞活性高，可用于细胞培养、低温培养、流式细胞术、蛋白质组学和转录组学分析，从而利用这些活性良好且得率高的绒毛外滋养层细胞开展研究。本方案中最重要的一个环节是必须使用新鲜的胎盘组织材料。

不能将它们冷藏。滋养层细胞很容易死亡，因此请在分娩后尽快获取胎盘组织，最好在分娩后两小时内完成，并始终在室温下保存。这是获得高活性绒毛外滋养层细胞的关键。

因此，利用这些原代滋养层细胞，您可以采用一些更进一步且更具创新性的方法，例如长期细胞培养。您可以利用它们建立为期四天的原代细胞培养体系。这些细胞的存活时间可长达96小时，这已经相当长，足以支持与T细胞和NK细胞等免疫细胞进行共培养实验。

另一项创新在于，可以利用这些方法建立滋养层样细胞系，该方法最初由 Aoki 描述，我们也在这些培养物中加以应用，以真正建立可长期增殖的细胞类型，可用于基因组编辑及其他更长期的培养实验。因此，我认为，利用这些创新方法（包括长期细胞培养），能够帮助您设计出用于长期机制研究的培养体系，从而可在其中进行基因组编辑、基因敲除、基因敲入、蛋白质过表达等操作，以深入探究滋养层细胞在与免疫细胞群体相互作用时，如何介导免疫耐受，或在特定情况下允许免疫应答及增强细胞毒性作用。