Name: 从人类胎盘组织中纯化HLA-G+ 囊外滋养层细胞以进行表型和功能分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习从人类胎盘组织中纯化HLA-G阳性囊外滋养层细胞的方法，用于研究母胎界面的免疫耐受机制。该方案通过FACS分选获得高纯度、高活性的原代细胞，适用于健康与病理妊娠的功能分析。

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我们感谢辛辛那提儿童医院医学中心风湿病科研究流式细胞术核心实验室的 Sherry Thornton 及其团队在流式细胞术和细胞分选方面提供的所有帮助；感谢参与医院的所有护士和医生在收集胎盘材料方面的努力；感谢 Tilburg 实验室所有成员以及辛辛那提儿童医院医学中心免疫学系教职人员富有启发性的讨论；本研究由美国国立卫生研究院 R01HD116852 项目（T.T.）；辛辛那提儿童研究基金会（T.T.）；Burroughs Wellcome 基金会下一代妊娠奖 #NGP10115（T.T.）；以及美国出生缺陷基金会俄亥俄州协作项目（T.T.）资助。S.T. 获日本学术振兴会科研费 KAKENHI 项目编号 22KK0287 和 25K12697 资助。

辛辛那提儿童医院的机构审查委员会已批准本研究方案（批准编号：2021-0336），该方案符合美国法律关于生物伦理考量、个人信息处理、传染性病原体管理以及知情同意程序的要求。每个实验室在开始实验前，均应获得符合本国研究指南的审批。
本方案通过改进我们之前的方案2,28，重点在于培养可维持活性达96小时的原代HLA-G+ EVT细胞，以用于后续功能检测。有关建立HLA-G+ EVT样细胞系的内容，请参见Hamilton等人的研究2；有关配对的母体蜕膜淋巴细胞的应用，请参见Ikumi等人的研究28。
1. 准备实验室（第0天）。
注意：处理样本时应使用二级生物安全柜（BSL2）。
<ol>
	<li>设置两个水浴，温度分别为 39 °C 和 37 °C。设置一个加湿的 CO2 培养箱，温度为 37 °C。</li>
	<li>配制 1× PBS、洗涤培养基 A、洗涤培养基 B、EVT 培养基 A、B 和 C（表 1 和 表 2）。</li>
	<li>在 37 °C 水浴中解冻 15 mL 的 10 mg/mL DNase I 溶液（表 1）以及 500 mL 的 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液。</li>
	<li>在 BSL2 柜内放置一个装有杀菌/灭活病毒溶液（例如 10% 漂白剂）的容器，用于收集液体废弃物。在 BSL2 柜内另设一个带有生物危害袋的废弃物容器，用于收集固体废弃物。</li>
	<li>在 BSL2 柜内准备好吸水垫、无菌解剖器械（弯头镊子和 6 ½" 剪刀）、无菌金属滤器、试管架以及无菌的 50 mL 锥形管。</li>
	<li>准备三个 50 mL 锥形管（其中两个各装入 1× PBS，另一个装入洗涤培养基 A），用于在解剖过程中收集胎盘组织碎片。</li>
</ol>
2. 样本采集（第0天）
注意：使用经剖宫产获取的妊娠24至42周的人类胎盘及其膜组织。经阴道分娩的胎盘可能获得的绒毛外滋养层细胞（EVT）较少。
<ol>
	<li>在BSL2级生物安全柜中立即开始处理胎盘，最好在分娩后1-2小时内进行，以最大限度地获得有活力的细胞。整个过程中始终将胎盘保持在室温条件下。</li>
	<li>检查胎盘，如有必要，记录其大小、重量及大体形态特征。</li>
</ol>
3. 组织解剖（第0天）
<ol>
	<li>胎膜解剖
	<ol>
		<li>将胎盘置于胎儿面朝上（可见脐带插入部位）。用手从侧膜向脐带插入处剥离靠近胎儿面的羊膜层，剪除并丢弃羊膜。</li>
		<li>从胎盘基底部开始，将绒毛膜蜕膜膜切割成2英寸长的条状，同时保持膜条仍附着于胎盘上。</li>
		<li>将绒毛膜蜕膜膜条放置于手指上，使蜕膜面朝上，用无菌弯头镊子轻轻刮取绒毛膜上的母体壁蜕膜。 
		注意：操作应迅速高效，避免绒毛膜干燥。</li>
		<li>将绒毛膜收集至含有20 mL洗涤液A的50 mL锥形管中。</li>
		<li>将壁蜕膜收集至含有20 mL PBS的50 mL锥形管中，用于蜕膜淋巴细胞分离，并按照Ikumi等28所述方案进行淋巴细胞分离。</li>
		<li>在50 mL锥形管中用剪刀将绒毛膜剪碎，直至形成小于&#60;2 mm2的小碎片。 
		注意：剪碎后沉降的膜组织总体积理想情况下应为30 mL。</li>
		<li>弃去洗涤液A，并用PBS多次洗涤，直至上清液澄清。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胎盘解剖
	<ol>
		<li>将胎盘母体面朝上放置，清除血凝块。使用无菌剪刀切割胎盘底板组织（长2 cm，宽2 cm，深0.5 cm），避免取用坏死、钙化或缺血区域。</li>
		<li>将底蜕膜组织块置于手指上，使绒毛（胎儿面）朝上。用剪刀小心地将绒毛从底蜕膜上分离，保留仅带有薄层绒毛的底蜕膜膜片（约2–3 mm）。</li>
		<li>将底蜕膜组织收集至含有20 mL PBS的50 mL锥形管中。剪碎底蜕膜组织，直至形成小于&#60;2 mm2的小碎片。 
		注意：剪碎后沉降的组织总体积理想情况下应为15 mL。</li>
		<li>弃去PBS，并用PBS多次洗涤底蜕膜，直至上清液澄清且无可见血液。</li>
		<li>将15 mL组织悬液均分为两份，分别加入两个50 mL锥形管中（每管7.5 mL）。 
		注意：从底蜕膜分离淋巴细胞的方案与此处不同，请参考Hamilton等2提供的方案。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 组织消化（第0天）
<ol>
	<li>在第3节最后一次清洗绒毛膜和基蜕膜后，将所有离心管中加入1× PBS，以200 × g 离心1分钟，弃去上清液。</li>
	<li>配制组织消化酶混合液（表1）。取150 mL预热的组织消化酶混合液加入一个300 mL玻璃瓶中，然后将30 mL绒毛膜组织加入该瓶中。</li>
	<li>在两个300 mL玻璃瓶中各加入20 mL预热的DMEM/F20和80 mL预热的组织消化酶混合液，然后在每个瓶中加入7.5 mL基蜕膜组织。</li>
	<li>将含有绒毛膜的瓶子置于39 °C水浴中，将含有基蜕膜的两个瓶子置于37 °C水浴中。在15分钟孵育期间，每隔3–4分钟摇动所有瓶子一次（第一次消化）。</li>
	<li>消化完成后，用金属筛网（孔径40）过滤消化后的组织。加入洗涤液B冲洗组织并溶解胶状物质。</li>
	<li>将细胞悬液通过100 µm滤网过滤至已标记组织类型和消化次数的50 mL离心管中。</li>
	<li>将未完全消化的组织重新转移回300 mL培养基瓶中进行第二次消化，按步骤4.2所述加入组织消化酶混合液，并重复步骤4.2–4.6。 
	注意：所有基蜕膜组织均转移至同一个300 mL瓶中。第一次消化和第二次消化所得细胞需分别保存。</li>
	<li>以650 × g 离心8分钟收集细胞悬液，弃去上清液。</li>
	<li>将相同组织类型和相同消化次数的沉淀合并（但保持第一次消化与第二次消化的沉淀相互分离），转入同一离心管中，并用洗涤液B补至25 mL。</li>
</ol>
5. Ficoll 密度梯度法（第 0 天）
<ol>
	<li>准备四个已标记组织类型和消化编号的50 mL锥形管。向管中加入12 mL Ficoll。</li>
	<li>小心地将细胞悬液加至Ficoll液面上。以800 × g离心20分钟（室温），不启用刹车。</li>
	<li>离心后，小心地将Ficoll与培养基界面处的细胞层转移至已按组织类型和消化编号标记的洁净50 mL锥形管中。 
	注意：使用无菌移液管小心收集该层，避免扰动界面。</li>
	<li>用洗涤缓冲液B补满管体，以650 × g离心8分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用残留的少量培养基（约0.5 mL）重悬细胞沉淀。如有需要，可保留约10%的细胞悬液用于表型分析，其余90%用于细胞分选。计数细胞以确定细胞数量和活力。</li>
</ol>
6. 滋养层细胞（第0天）的分选
<ol>
	<li>将重悬的细胞沉淀加入已标记组织类型和消化编号的无菌FACS管中。加入抗-CD45-BV785（1:100）、抗-HLA-G-APC（1:125）和抗-EGFR1-BV711（1:160）（表3）。室温避光孵育20分钟。</li>
	<li>加入1 mL洗涤液B，以650 × g 离心8分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用洗涤液B重悬细胞沉淀，制成约1 × 106 个细胞/mL的细胞悬液。</li>
	<li>在细胞分选前，通过40 µm细胞滤网过滤细胞，并根据图1A所述的设门策略，将CD45-HLA-G+EGFR+ EVT分选至含有1 mL EVT培养基A的收集管中。 
	注意：为获得最佳滋养层细胞活力，应使用气流式细胞分选仪（如Bigfoot或MoFlo）并配备100 µm喷嘴。基于流体的分选仪（如DB S6或Sony Nano）可能降低滋养层细胞活力；而磁珠分选方法（如Easysep或MACS）虽可维持细胞活力，但纯度较低，可能导致培养中出现间质细胞过度生长。</li>
	<li>将含有分选后细胞的FACS管离心，弃去上清液，用EVT培养基B重悬细胞沉淀。 
	注意：在分选细胞的同时，请进入下一节准备培养板。</li>
</ol>
7. 继发性检测用原代 HLA-G+ EVT 培养（第 0 - 1 天）
<ol>
	<li>在室温下，用 50 µL 浓度为 20 µg/mL 的纤连蛋白（表 2）包被平底 96 孔细胞培养板的孔，孵育 45 分钟。</li>
	<li>去除纤连蛋白溶液，向各孔中加入含有 EVT 培养基 B 的细胞悬液。每孔目标接种密度为：基底 EVT 细胞 0.5 × 105 个/200 µL 培养基，绒毛膜 EVT 细胞 1.0 × 105 个/200 µL 培养基。将细胞培养板置于 37 °C、湿润的 CO2 培养箱中孵育 12–18 小时（第 0 天孵育）。</li>
	<li>第 1 天，弃去培养基 B，用 1× PBS 轻柔洗涤细胞，然后加入 EVT 培养基 C，根据需要加入或不加入 T 细胞进行后续（共）培养（参见第 8 节）。</li>
</ol>
8. 原代HLA-G+ EVT细胞与活化T细胞的共培养（第0 - 4天）
<ol>
	<li>CD8 刺激+来自3的T细胞rd 第三方供体（第0-1天）
	<ol>
		<li>在HLA-G分选过程中+ EVT（第0天），使用参考的人类CD8从配对的母体血液或无关供体血液样本中分离外周血免疫细胞群+ T细胞富集混合液（参见 材料表随后进行Ficoll密度梯度离心或FACS分选。</li>
		<li>根据需要，在淋巴细胞培养基中使用抗CD3/28磁珠或细胞因子（如IL2、IL15、IL12或IL18）预刺激T细胞或NK细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与活化T细胞共培养EVT（第1-4天）
	<ol>
		<li>统计淋巴细胞数量，并用淋巴细胞培养基制备细胞悬液，浓度为 0.5 × 10⁶/mL6 / mL。加入 1 × 105 将淋巴细胞加入到原代EVT细胞孔中（EVT培养基C与淋巴细胞培养基的体积比为1:1）。将培养板置于湿润的CO₂培养箱中孵育24-72小时。2 37 °C 培养箱中孵育。</li>
		<li>收获淋巴细胞用于流式细胞术分析，并收集上清液用于细胞因子分析。</li>
		<li>第4天使用胰蛋白酶消化法收集EVT，并将EVT收集至FACS管中，用于流式细胞术分析（参见第9节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 初代 HLA-G+ EVT 的表型分析
注意：立即进行流式细胞术染色，并始终将 EVT 及所有所需溶液置于室温下。
<ol>
	<li>将含有原代EVT的FACS管在650 × g 条件下离心7分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入caspase 3/7染色溶液（表3），轻轻混匀。</li>
	<li>使用抗体（表3）对细胞进行染色，轻轻混匀后继续孵育20分钟（总孵育时间为30分钟）。</li>
	<li>加入1 mL EVT培养基C，于650 × g 离心7分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用0.4 mL EVT培养基C重悬细胞沉淀，向每管中加入7-AAD染色溶液（5 µL/细胞悬液），立即上流式细胞仪分析。</li>
</ol>

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<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+multi-omic+profiling+of+human+placental+syncytiotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts.</a> Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).</li>
<li>Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+primary+human+placental+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of primary human placental leukocytes.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).</li>
</ol>

本研究不存在利益冲突。

方案中的关键步骤
为了获得有活力的绒毛外滋养层细胞（EVT），必须在分娩后立即从胎盘开始细胞分离，并在室温下完成从分离到分选的所有操作步骤。由于EVT比淋巴细胞体积更大且更具黏附性，因此在分选过程中应采取以下预防措施以避免堵塞：i）分选前将细胞悬液通过40 µm细胞筛网过滤；ii）使用含有DNase的培养基制备细胞悬液；iii）避免细胞悬液过度浓缩（理想浓度约为~1 × 10⁶ 个细胞/mL）；iv）使用喷嘴直径至少为100 µm的分选仪。与基于流体系统的细胞分选仪（例如BD分选仪、Sony Nano）相比，气流式分选仪（例如Bigfoot、MoFlo）可获得更高的有活力EVT产量。
方法的改进与故障排除
底蜕膜 EVT 初次消化后消化过度或不足
不同胎盘的底蜕膜组织消化效率存在差异。消化过度的组织会形成大而黏稠的聚集体，难以通过金属筛网。通常，在过滤过程中加入10-30 mL洗涤液B有助于分散这些聚集体。如果此方法未能解决问题，可直接向组织中加入1-2 mL DNase。如果第一次消化导致过度消化，第二次消化时应将组织消化酶混合液的浓度从80%降低至70%。第一次消化过滤后，残留组织体积应减少至原来的一半以下。如果残留组织体积未发生明显变化，第二次消化时应将组织消化酶混合液的浓度从80%提高至90%-100%。绒毛膜组织在不同胎盘间的消化情况较为一致，因此通常无需调整组织消化酶混合液的浓度。
对于超出上述方案所述体积的较大组织的消化
对于超过30 mL的绒毛膜消化或超过15 mL的基蜕膜组织消化，应使用额外的含有组织消化酶混合液的瓶子。单个瓶子中组织体积过大容易导致消化不充分。
方法的局限性
经阴道分娩的胎盘所获得的滋养层细胞（EVT）产量较低。EVT在分选前或分选后均不能进行冷冻保存，因为它们对冻融应激非常敏感，这会显著降低其存活率和功能。因此，本方案不包含任何可暂停的步骤。
该方法相较于现有方法的重要性
我们此前报道了使用组织培养基B和胶原包被板从足月胎盘建立HLA-G+ EVT样细胞系的方案。然而，该培养基中的多种抑制剂以及胶原可能会影响共培养系统中T细胞的功能2。另一项先前研究未使用组织培养基B，虽可评估共培养中的T细胞，但由于细胞变异性，无法对EVT进行有效评估1,10。本方案的优势在于，在支持活性原代EVT培养的同时，最大限度地减少了培养基对实验的干扰。该方案提供了一个实验平台，可用于研究EVT的免疫学功能及其在周围免疫细胞作用下的功能变化——这一领域迄今尚未得到充分探索。

人类胎盘包含四类广泛的滋养层细胞类型：滋养层干细胞、合体滋养层细胞、绒毛细胞滋养层细胞以及绒毛外滋养层细胞（EVT），每种类型均具有独特的功能和表型特征。其中，EVT表现出独特的免疫学特征，包括高表达免疫抑制分子，如HLA-G、PD-L1、PD-L2和B7家族成员，以及多态性的HLA-C1,2,3,4,5,6。EVT可深入侵入母体蜕膜组织、螺旋动脉及子宫肌层，从而与母体免疫细胞直接接触7。EVT&#160;的一个显著特征是表达多态性HLA-C，该分子是与母体T细胞和NK细胞相互作用的关键介质，必须加以调控以维持妊娠期间的免疫耐受。作为EVT表达的唯一经典MHC分子，HLA-C还能向母体记忆T细胞呈递抗原，提供免疫保护作用8。然而，多项研究表明，EVT可直接增加调节性CD4 T细胞的数量，并诱导CD8 T细胞和NK细胞进入耐受性状态，从而保护自身免受细胞毒性攻击和免疫排斥9,10,11,12,13。此外，一些研究报道，在子痫前期、早产或流产后的胎盘样本中，母体免疫细胞与EVT的免疫学特征相较于健康对照组发生了改变14,15,16,17,18,19,20,21。这些免疫学变化可能由多种因素引起，包括：i）母体T细胞预先存在的异常；ii）EVT免疫抑制功能受损；或iii）两类细胞之间相互作用的破坏。为了阐明其潜在的机制驱动因素，建立能够评估母体免疫细胞与EVT相互作用的离体（ex vivo）实验模型系统至关重要。
本文所介绍的方法和策略相较于利用经典滋养层细胞系、滋养层干细胞模型或类器官的现有方法具有多项优势。最重要的是，经典滋养层细胞系和滋养层干细胞模型无法重现原代绒毛外滋养层细胞（EVT）的关键特征，包括其主要组织相容性复合体（MHC）表达谱3,5,22,23。其次，人滋养层干细胞（hTSC）和类器官培养体系所需的复杂培养基中含有多种分子抑制剂，这些成分会直接影响免疫细胞的功能和表型，从而阻碍对EVT与免疫细胞相互作用的准确评估22,24,25,26,27。最后，hTSC在分化后产生的细胞异质性，以及胎盘类器官结构的“内向外”生长特性，使得免疫细胞可能与在体内并无对应生理意义的滋养层细胞类型发生相互作用，从而降低了研究结果的清晰性和可靠性22,27。
本文描述了从人类足月胎盘组织中分离纯化原代HLA-G+绒毛外滋养层细胞（EVT）的方法，可在有或无免疫细胞群体共存的条件下对这些细胞进行长达96小时的培养。所用培养基不含影响EVT及免疫细胞功能的分子抑制剂，同时可维持细胞活性。该方法为在健康及复杂妊娠状态下直接开展EVT与免疫细胞相互作用的离体（ex vivo）研究提供了有价值的平台，有望促进母胎免疫耐受关键调控因子的发现，并为解决胎盘炎症提供潜在治疗靶点。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>-20&amp;nbsp;&amp;deg;C 冰箱</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C 5% CO2 培养箱</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C 冰箱</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-240</td><td></td></tr><tr><td>55 mM &amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>6 &amp;frac12;&amp;rdquo; 剪刀</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-AAD 活性染色液</td><td>Biolegend</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>-80&amp;nbsp;&amp;deg;C 冰箱&amp;nbsp;</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>REPROCELL</td><td>04-0014</td><td></td></tr><tr><td>AF700 标记小鼠 IgG1 k 同型对照</td><td>Biolegend</td><td>400144</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 标记大鼠 IgG2a, &amp;kappa; 同型对照</td><td>Biolegend</td><td>400524</td><td></td></tr><tr><td>B7H3 PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>351012</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 SE 细胞分析仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bigfoot 光谱细胞分选仪</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>BSL2 生物安全柜</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV605 标记小鼠 IgG1, &amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Biosciences</td><td>562652</td><td></td></tr><tr><td>BV750 标记小鼠 IgG1, &amp;kappa; 同型对照&amp;nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400105</td><td></td></tr><tr><td>BV785 标记小鼠 IgG1, &amp;kappa; 同型对照</td><td>Biolegend</td><td>400170</td><td></td></tr><tr><td>CD45 BV785</td><td>Biolegend</td><td>304048</td><td></td></tr><tr><td>细胞解离筛</td><td>Millipore Sigma&amp;nbsp;</td><td>CD1-1KT（孔径 60）</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛网 40&amp;micro;m、70&amp;micro;m、100&amp;micro;m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22363547; 22363548; 22363549</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent caspase-3/7 绿色检测试剂</td><td>invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021, 3 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML 1046-5MG</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>VWR Life Science</td><td>97063-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads 人 T 细胞激活剂 CD3/CD28（用于 T 细胞扩增和激活）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>EGF，人源，重组，无动物成分</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>EGFR1 BV711</td><td>Biolegend</td><td>352920</td><td></td></tr><tr><td>FACS DIVA 软件</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>Cytivia</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>FlowJo</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td></tr><tr><td>HLA-C PE</td><td>BD Biosciences</td><td>566372</td><td></td></tr><tr><td>HLA-E PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>342608</td><td></td></tr><tr><td>HLA-G APC</td><td>abcam</td><td>AB40915</td><td></td></tr><tr><td>人 AB 血清</td><td>Corning</td><td>35060CI</td><td></td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素 (hCG) (2500 IU/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>人纤连蛋白 (1 mg/mL)</td><td>Corning</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>人重组 IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒，100 倍浓度 (ITS-G)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITGA6 APC/cy7</td><td>Biolegend</td><td>313627</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>磁力分离器</td><td>promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>新生牛血清 (NCS)</td><td>gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>PD-L1 AF700</td><td>invitrogen</td><td>56-5983-42</td><td></td></tr><tr><td>PD-L2&amp;nbsp; BV750</td><td>Biolegend</td><td>345528</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 标记小鼠 IgG1 k 同型对照</td><td>Biolegend</td><td>400126</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle594 标记小鼠 IgG1, &amp;kappa; 同型对照</td><td>Biolegend</td><td>400176</td><td></td></tr><tr><td>青霉素和链霉素&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 10X 溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>PVR BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>748276</td><td></td></tr><tr><td>研究级 FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB12999102</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep 人 CD8+ T 细胞富集混合液</td><td>Stem Cell</td><td>15023</td><td></td></tr><tr><td>SB431542, 10 mM</td><td>Apex-Bio</td><td>A8249</td><td></td></tr><tr><td>37&amp;nbsp;&amp;deg;C 摇床水浴箱</td><td>任意供应商</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express 1x 无酚红</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>VPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 无血清造血细胞培养基</td><td>Lonza</td><td>04-380Q</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688000-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

从人类足月胎盘组织中分离纯化 hla-g+ 细胞外滋养层细胞用于表型鉴定与功能分析

Purification of HLA-G+ Extravillous Trophoblasts from Human Term Placental Tissues for Phenotyping and Functional Analysis

人类母胎界面代表一种独特的免疫环境，在此环境中，母体免疫细胞与胎儿绒毛外滋养层细胞（EVT）发生直接的细胞接触，以建立并维持免疫耐受。EVT表现出独特的免疫表型，其特征是表达多种耐受性分子，如HLA-G、PD-L1和PD-L2，这些分子在调控母体免疫反应中发挥关键作用。此外，人类EVT还表达HLA-C，可被母体NK细胞和T细胞直接识别，从而促进其活化。重要的是，目前用于研究的动物模型中不存在HLA-C或HLA-G的同源物，且小鼠滋养层细胞缺乏MHC分子的表达。因此，在生理和病理条件下，研究来源于胎盘组织的人类EVT的表型与功能特性，对于阐明妊娠维持机制以及与子痫前期、早产、胎儿生长受限和胎盘植入等疾病相关的胎盘炎症病理生理过程至关重要。本实验方案系统阐述了从健康足月胎盘组织以及早产和子痫前期胎盘组织中分离和鉴定原代人类EVT的方法，包括：（1）胎盘及绒毛膜组织的解剖分离；（2）酶消化处理及单细胞悬液制备；（3）通过FACS分选纯化EVT；（4）利用高维流式细胞术进行表型鉴定；以及（5）短期培养与功能分析。 体外 与母体免疫细胞共培养长达96小时。重点在于获得高纯度且具有活性的绒毛外滋养层细胞（EVT），以适用于后续应用，如免疫学功能检测、蛋白质和基因表达分析。本方案的实施为深入理解EVT与母体免疫细胞之间的相互作用及其在正常妊娠和复杂妊娠中的意义，提供了可靠且可重复的实验平台。

预期细胞产量
从15 mL底蜕膜中，预期通过第一次消化可获得0.1–0.3 × 106 个HLA-G+ EVT细胞，第二次消化可获得0.1–0.6 × 106 个细胞（总计0.2–0.8 × 106 个细胞）。从30 mL绒毛膜中，预期通过第一次消化可获得0.4–1.0 × 106 个HLA-G+ EVT细胞，第二次消化可获得0.4–1.5 × 106 个细胞（总计0.8–2.5 × 106 个细胞）。分离得到的EVT细胞中，caspase 3/7- 7-AAD- 活细胞的比例预期为90–95%。
原代HLA-G+ 细胞滋养层细胞培养
对谱系标志物（HLA-G、HLA-C、EGFR）和细胞死亡标志物的流式细胞术分析表明，该方案可提供存活的原代EVT培养物，直至培养第4天（分选后的EVT接种后96小时）（图1B-D）。培养24、48和72小时后，原代绒毛膜和d.basalis HLA-G+ EVT的代表性明场显微镜图像如（图2A-F）所示。
原代HLA-G+ EVT细胞与T细胞的共培养
本方案提高了原代 EVT 在从胎盘分离后 96 小时的存活率，相较于我们此前的报道有所改进1,2,10。因此，该方案使得在模拟母胎界面急性炎症的条件下，通过与预先激活的淋巴细胞共培养来分析 EVT 的应答成为可能。通过细胞外流式细胞术染色检测，EVT 表达多态性 HLA-C 以及免疫抑制性共抑制分子，如 PD-L1、PD-L2、PVR（又称 CD155）、B7H3 和 HLA-E（图 3A、B）。根据方案第 8 节，在与活化的淋巴细胞共培养 72 小时后，EVT 的 HLA-C、PD-L1、PD-L2 和 HLA-E 表达均上调，但 PVR 和 B7H3 的表达未见升高（图 4A、B）。此外，通过 7AAD 和 caspase 3/7 染色显示，未观察到 EVT 死亡率增加（图 4C、D）。
<img alt="Flow cytometry analysis of EVT cells; dot plots show HLA-G, EGFR1 expression, caspase-3/7 activity." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig1.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="Figure 1"> 
图1EVT细胞分选的设门策略及分选后EVT培养的流式细胞术图谱 (A代表性门控策略用于分选底蜕膜EVT和绒毛膜EVT。R1为前向-侧向散射图中的活细胞门控。R2为排除CD45的门控+ 白细胞。R3 是 HLA-G+EGFR+EVT 门控。R4 为 7-AAD-caspase3/7- 活的EVT。尽管分选时不一定需要R4门，但此处展示R4门以证明原代EVT的活力。B代表性流式细胞术图显示分选后的 HLA-G+EGFR+EVT，培养96小时后 体外 培养。C，Dcaspase 3/7 的频率- 7-AAD- 分选时（第0天）及培养96小时后（第4天）的活体EVT <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Chorionic and d.basalis EVT microscopy images showing cellular changes over 24-72 hours for cell analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig2.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="Figure 2"> 
图2EVT 期间的形态学特征 体外 培养 代表性绒毛外滋养层细胞（EVT）的光学显微镜图像，显示处理后（A24 小时，（B) 48 小时，以及（C) 培养72小时后的蜕膜基底层EVT以及（D）24 小时，（E）48 小时，以及（F培养72小时。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看该图的放大版本。</a>
<img alt="EVT 分析的流式细胞术直方图和 MFI 图，包括 HLA-C、PD-L1、PD-L2 标记物。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig3.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 3"> 
图 3．原代 EVT 的免疫表型。（A）通过细胞外流式细胞术染色（第 0 天）检测的原代 EVT 上 HLA 和共抑制分子的代表性流式图。（B）配对线图显示了底蜕膜 EVT（蓝色）和绒毛膜 EVT（绿色）在第 0 天时 IgG 对照和各标记物完全染色的原始 MFI 值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="原代滋养层细胞与淋巴细胞相互作用；流式细胞术分析；蛋白表达比较；统计学数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig4.jpg" data-altupdatedat="1784001604000" data-alt="图 4"> 
图 4．原代滋养层细胞在有或无活化淋巴细胞情况下的免疫表型（第4天）。（A）原代滋养层细胞经72小时培养后（第4天），在有或无活化的第三方淋巴细胞共培养条件下的代表性流式图。（B）配对折线图显示滋养层细胞在有或无活化的第三方淋巴细胞存在下的MFI值。蓝色图示代表底蜕膜来源的滋养层细胞，绿色图示代表绒毛膜来源的滋养层细胞。（C）第4天在有或无活化的第三方淋巴细胞共培养条件下，caspase 3/7- 7-AAD- 活细胞滋养层细胞的代表性流式细胞术图。（D）配对折线图显示在有或无活化的第三方淋巴细胞存在下，caspase 3/7- 7-AAD- 活细胞滋养层细胞的比例。蓝色图示代表底蜕膜来源的滋养层细胞，绿色图示代表绒毛膜来源的滋养层细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1. 组织解离和消化的关键试剂。 另请参见1,2,24。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%201_final.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2. 滋养层细胞（EVT）培养及与T细胞共培养的关键试剂。 另见1,2,24。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%202_v2_final.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3. 用于分选和流式细胞术分析的关键抗体和试剂。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%203_final.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本方案可实现从人类足月胎盘的底蜕膜和绒毛膜中分离、鉴定和培养原代HLA-G+绒毛外滋养层细胞（EVT）。原代EVT培养物可维持96小时的活力，可用于与配对的母体免疫细胞共培养，并进一步对其相互作用进行流式细胞术和分子分析。

从人类足月胎盘组织中分离纯化 HLA-G+ 细胞外滋养层细胞用于表型鉴定与功能分析

人类母胎界面代表一种独特的免疫微环境，在此环境中，母体免疫细胞与胎儿绒毛外滋养层细胞（EVT）……

本方案旨在从人胎盘组织中分离纯化原代人滋养层细胞，以研究其在正常妊娠及病理条件下的功能特性与免疫学特性。因此，该方案提供了一个可重复的实验平台，克服了既往在使用原代人绒毛外滋养层细胞时存在的一些局限性，尤其是细胞活力问题。本方案经过优化，可显著提高细胞的活力与纯度。首先，获取一个人类胎盘样本。将胎盘置于胎儿面朝上的位置，使脐带插入部位可见。手动从侧膜向脐带插入部位剥离羊膜，并将其移除。然后使用剪刀剪除并丢弃羊膜。从胎盘基底部开始向上将绒毛膜蜕膜层切成两英寸长的条状，同时保持每条组织仍与胎盘相连。将绒毛膜蜕膜条置于两根手指上，使蜕膜面朝上。用无菌弯头镊子轻轻刮取绒毛膜上的母体壁蜕膜组织。将壁蜕膜组织收集至一个含有 20 毫升 PBS 的 50 毫升锥形管中，用于淋巴细胞分离。随后将绒毛膜收集至另一个含有 20 毫升洗涤液 A 的 50 毫升锥形管中。用剪刀在 50 毫升管内将绒毛膜剪成小于 2 平方毫米的小块。弃去管中的洗涤液A。用PBS反复洗涤组织，直至上清液变澄清。进行胎盘解剖时，将胎盘母体面朝上放置，并去除血凝块。使用无菌剪刀剪取胎盘底板组织，避免取材于坏死、钙化或缺血区域。将含有绒毛的底蜕膜组织置于手指上，使绒毛面朝上。然后用剪刀小心去除绒毛，保留一层薄薄的绒毛层，获得一个厚度为二至三毫米的膜状组织。将底蜕膜组织收集到含有20毫升PBS的50毫升锥形管中。然后将组织切成小于2平方毫米的小块。接下来，弃去管中的PBS。用 PBS 反复洗涤底蜕膜，直至上清液清澈且无可见血液。然后将 15 毫升组织悬液均分至两个 50 毫升锥形管中。用 PBS 注满所有离心管。将离心管在 200G 条件下离心一分钟，倒去上清液。向一个 300 毫升的玻璃瓶中加入 150 毫升温热的组织消化酶混合液。向瓶中加入 30 毫升绒毛膜组织。将20毫升温热的DMEM/F-20和80毫升温热的组织消化酶混合液分别加入两个300毫升的玻璃瓶中。然后向每个瓶中加入7.5毫升底蜕膜组织。将瓶子置于水浴中孵育。在15分钟孵育期间，每隔三到四分钟摇晃所有瓶子一次。消化完成后，使用孔径为40的金属筛过滤组织。然后加入洗涤液B冲洗组织，并溶解胶状物质。将未消化的组织转移回玻璃瓶中，重复消化步骤。然后将细胞悬液通过100微米滤网过滤至已标记的50毫升锥形管中。第一次和第二次消化所得的细胞需分别保存。然后以650 × g离心细胞悬液8分钟。弃去上清液。将相同组织类型和相同消化次数的沉淀合并至同一管中。然后用洗涤液 B 定容至 25 毫升。在四个已标记组织类型和消化编号的 50 毫升锥形管中各加入 12 毫升 Ficoll。小心地将细胞悬液铺加在 Ficoll 液面上。然后在室温下以800G离心20分钟，不要中断。小心吸取位于Ficoll培养基界面的细胞层，并转移至洁净的标记试管中。随后用洗涤液B补满试管，以650G离心8分钟，并重悬沉淀物。将重悬的沉淀物放入已标记组织类型和消化编号的无菌荧光激活细胞分选管中。加入抗CD45 BV785、抗HLA GAPC和抗EGFR1 BV711抗体。室温避光孵育20分钟。用洗涤液B洗涤并重悬细胞后，立即通过40微米细胞筛。将CD45阴性、HLA-G阳性、EGFR阳性的绒毛外滋养层细胞分选至含有1毫升EVT培养基A的试管中。谱系标志物流式细胞术分析显示，原代绒毛外滋养层细胞培养至第4天仍保持活性。分别在培养24小时、48小时和72小时后，采集原代绒毛膜和底蜕膜HLA-G阳性绒毛外滋养层细胞的代表性明场显微镜图像。绒毛外滋养层细胞表达多态性HLAC以及免疫抑制性共抑制分子。当与活化的淋巴细胞共培养72小时后，绒毛外滋养层细胞增加了HLAC、PD-L1、PD-L2和HLA-E的表达，但未增加PVR和B7H3的表达。与活化的淋巴细胞共培养后，未观察到绒毛外滋养层细胞死亡增加。该方案使得科研人员能够将原代绒毛外滋养层细胞用于多种检测。其优势在于细胞活性高，可用于细胞培养、低温培养、流式细胞术、蛋白质组学和转录组学分析，从而利用这些活性良好且得率高的绒毛外滋养层细胞开展研究。本方案中最重要的一个环节是必须使用新鲜的胎盘组织材料。不能将它们冷藏。滋养层细胞很容易死亡，因此请在分娩后尽快获取胎盘组织，最好在分娩后两小时内完成，并始终在室温下保存。这是获得高活性绒毛外滋养层细胞的关键。因此，利用这些原代滋养层细胞，您可以采用一些更进一步且更具创新性的方法，例如长期细胞培养。您可以利用它们建立为期四天的原代细胞培养体系。这些细胞的存活时间可长达96小时，这已经相当长，足以支持与T细胞和NK细胞等免疫细胞进行共培养实验。另一项创新在于，可以利用这些方法建立滋养层样细胞系，该方法最初由 Aoki 描述，我们也在这些培养物中加以应用，以真正建立可长期增殖的细胞类型，可用于基因组编辑及其他更长期的培养实验。因此，我认为，利用这些创新方法（包括长期细胞培养），能够帮助您设计出用于长期机制研究的培养体系，从而可在其中进行基因组编辑、基因敲除、基因敲入、蛋白质过表达等操作，以深入探究滋养层细胞在与免疫细胞群体相互作用时，如何介导免疫耐受，或在特定情况下允许免疫应答及增强细胞毒性作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

从人类胎盘组织中纯化HLA-G+ 囊外滋养层细胞以进行表型和功能分析

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利用单克隆抗体TG30和GCTM-2检测细胞表面抗原富集与清除人胚胎干细胞

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从人类母胎界面分离白细胞

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体外 人多能干细胞向滋养层细胞的分化

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三维重建与分析免疫标记并透明化处理的人类胎盘小叶血管网络

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从足月胎盘的胎膜中分离原代人蜕膜细胞

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单细胞收集围植入期人类胚胎中的滋养层细胞

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ex vivo 人胎盘外植体培养用于研究病毒在母胎界面的传播

学习从人类胎盘组织中纯化HLA-G阳性囊外滋养层细胞的方法，用于研究母胎界面的免疫耐受机制。该方案通过FACS分选获得高纯度、高活性的原代细胞，适用于健康与病理妊娠的功能分析。

从人类足月胎盘组织中分离纯化 HLA-G⁺ 细胞外滋养层细胞用于表型鉴定与功能分析

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