Name: 从人类胶质瘤组织中制备新生血管组织，用于肿瘤血管生成定量蛋白质组学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 探索激光捕获显微切割结合iTRAQ定量蛋白质组学技术，从人类胶质瘤组织中精确分离新生血管并进行差异蛋白分析。该方法可识别371个差异表达蛋白，为肿瘤血管生成机制研究及抗血管生成治疗靶点发现提供科学依据。

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本工作得到中国国家自然科学基金（81272798 资助 X.Z.，82203592 资助 N.L.）、山东省自然科学基金（ZR2022QH112 资助 N.L.）、山东省泰山学者工程专项经费（NO.tstp20221143 资助 X.Z.）、中国国家高端外国专家人才计划（H20240743；外国专家：X.Z.）以及山东第一医科大学新兴战略领域科研培育项目（202403）的支持。

本涉及人体组织样本的实验方案已获得山东第一医科大学医学伦理审查委员会批准（批准号：R202211090133），并已取得患者及其家属的知情同意。本研究所用胶质瘤样本均来自中南大学湘雅医院神经外科手术切除标本，包括7例III级星形细胞瘤组织。正常对照血管（n = 3）取自因脑外伤而切除的受损脑组织中的微血管。所有患者均为首次就诊，术前未接受过放疗或化疗，并均由中南大学湘雅医院病理科确诊。三例正常对照血管组织来自中南大学湘雅医院神经外科手术中切除的因外力损伤但无胶质瘤的正常脑组织中的极细小血管。所用试剂与设备详见材料表。
1. 使用激光捕获显微切割技术从人脑胶质瘤组织中分离新生血管组织
<ol>
	<li>准备激光显微切割（LCM）载玻片：将聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜手动涂覆于可重复使用的金属载玻片上，并将涂覆后的载玻片保存于 -80 °C环境中。 
	注意：预涂覆的金属载玻片将用于直接黏附冷冻组织切片。</li>
	<li>配制甲苯胺蓝染色液（0.5%）：将0.25 g甲苯胺蓝溶于40 mL去离子水（ddH₂O）中，加入一片蛋白酶抑制剂，搅拌至完全溶解，再用去离子水定容至50 mL，过滤后置于冰上保存。</li>
	<li>处理组织：保持冷冻切片机在工作温度下运行（-25 °C的腔体/样本头温度）。从-80 °C环境中取出胶质瘤组织，置于冰上转移，用滤纸去除血液，选择合适的组织块进行包埋。</li>
	<li>组织包埋步骤：预先冷却样本盘，加入包埋介质并迅速包埋组织块，随后在-25 °C条件下冷冻10分钟以固化。</li>
	<li>切片并筛选血管：以8 µm厚度进行组织切片，将切片贴附于普通载玻片上，使用甲苯胺蓝染色液染色，并在光学显微镜下筛选新生血管区域。 
	注意：若未检测到血管，弃去3–5张组织切片，重复染色步骤，直至出现新生血管区域。</li>
	<li>将含血管的组织切片转移至已准备好的LCM载玻片上：将确认含有血管的切片转移至涂有PEN膜的LCM载玻片，密封、标记后保存于-80 °C环境中。</li>
	<li>用预冷的70%乙醇（4 °C，1–2分钟）固定LCM载玻片上的组织切片；倾去乙醇，再用0.5%甲苯胺蓝染色（4 °C，30秒）；倾去染液，用去离子水（4 °C）漂洗两次（使用两个独立的洗液槽），倾去液体，随后在蛋白酶抑制剂溶液中孵育30秒，最后保存于-80 °C环境中。</li>
	<li>提前启动LCM仪器，预热30分钟，再使用固态红外激光继续预热30分钟，然后安装500 µL微量离心管收集装置。</li>
	<li>将已装载组织样本的LCM切片（保存于-80 °C）置于准备好的LCM仪器上，借助配套软件调整焦距，聚焦于胶质瘤组织中的新生血管区域。</li>
	<li>沿新生血管外缘精确绘制激光标记线（避免触及血管壁），使用激光烧蚀并分离新生血管，随后将其收集至EP管盖中。 
	注意：可进行第二次激光烧蚀，以确保新生血管已完全分离。</li>
	<li>将收集的新生血管样本管倒置并密封，保存于-80 °C超低温冰箱中。</li>
</ol>
2. 激光捕获显微切割分离的胶质瘤新生血管组织中蛋白质的提取及蛋白含量定量
<ol>
	<li>准备含有4%十二烷基硫酸钠（SDS）、1 mM二硫苏糖醇（DTT）和150 mM Tris-HCl（pH 8.0）的蛋白提取缓冲液。 
	注意：SDS为有害粉尘，严重刺激眼睛、皮肤和呼吸道，必须在通风橱中称量；DTT具有刺激性，也必须在通风橱中称量。</li>
	<li>将激光捕获显微切割（LCM）获取的胶质瘤新生血管组织重悬于提取缓冲液中，在冰水浴中超声处理1分钟以实现完全裂解。</li>
	<li>在16,000 × g 条件下离心10分钟，转移上清至新的微量离心管中。</li>
	<li>取少量上清用于蛋白定量。向剩余上清中加入DTT（终浓度：1 mM DTT），轻轻吹打混匀以避免产生气泡。分装后于-80 °C保存。</li>
	<li>按照以下步骤进行二喹啉乙酸（BCA）蛋白定量检测：
	<ol>
		<li>配制工作液（试剂A:B = 50:1）。</li>
		<li>配制牛血清白蛋白（BSA）标准品溶液（0.5 mg/mL）。</li>
		<li>根据表1加入相应溶液。</li>
		<li>将样品/标准品与工作液混合后转移至96孔板。</li>
		<li>37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>在562 nm处测定吸光度。</li>
		<li>根据标准曲线计算蛋白浓度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 采用定量蛋白质组学分析制备的新生血管蛋白
<ol>
	<li>制备提取的新生血管蛋白的胰蛋白酶肽样品。
	<ol>
		<li>向每份提取的蛋白质样品（肿瘤；对照）中加入预冷的丙酮（样品：丙酮 = 1:5，v/v），充分混匀，并于 -20 °C 孵育 &#176;C孵育1小时。以12,000 x 胶质瘤 (4 &#176;C）15 分钟。弃去上清液以去除蛋白提取试剂（SDS、DTT 和 Tris-HCl），将沉淀重悬于 20 &#181;L 溶解缓冲液含 1 &#181;L 1% SDS 
		注意：使用丙酮时需在通风良好的环境中进行，佩戴安全护目镜，远离点火源，并将废液置于专用的防爆容器中处理。</li>
		<li>加入2 &#181;加入还原剂（DTT）至各样品中，充分混匀，并于60℃孵育 &#176;C孵育1小时。加入1 &#181;L-半胱氨酸封闭试剂（碘乙酰胺），室温孵育10分钟。</li>
		<li>加入胰蛋白酶（蛋白质：胰蛋白酶 = 20:1，v/v）至各样品中，涡旋混匀后于37℃孵育。 &#176;C 过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用同重标记相对与绝对定量（iTRAQ）试剂标记已制备的胰蛋白酶消化肽段。 
	注意：本实验方案使用六重 iTRAQ 试剂（plex 标签 113、114、115、116、117 和 118）标记胰蛋白酶消化的肽段样本（肿瘤；对照），每种样本重复标记三次。表2).
	<ol>
		<li>用50 µL异丙醇复溶每管iTRAQ试剂 &#181;L-异丙醇</li>
		<li>将胰蛋白酶消化的肽段样品加入相应的试剂管中，室温孵育1小时。</li>
		<li>通过加入 3 终止反应&#215; 加入超纯水至终体积，然后在室温下孵育30分钟。</li>
		<li>将标记的六个样本等量混合，充分混匀后冻干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用强阳离子交换（SCX）对iTRAQ标记的胰蛋白酶消化肽样本进行分级分离。
	<ol>
		<li>将冻干肽在2 mL溶液A（10 mM KH&#8322;PO&#8324;，25%乙腈，pH 2.7）。上样至磺乙基功能化阳离子交换柱（4.6 &#215; 100 mm, 5 &#181;m, 200 &#197;).</li>
		<li>使用溶液B（500 mM KCl，10 mM KH）以1 mL/min的恒定流速进行洗脱&#8322;PO&#8324;，25% ACN，pH 2.7）：0%&#8594;10 %（2 分钟） &#8594; 10 %&#8594;20 %（25 分钟） &#8594; 20 %&#8594;45 %（5 分钟） &#8594; 50 %&#8594;100 %（5 分钟）。全程在 214 nm 处监测，每分钟收集一管，共收集 30 个组分。</li>
		<li>通过真空离心浓缩各组分，然后用 40 重悬 &#181;L 的 0.1%（v/v）三氟乙酸（TFA）。所有 30 个组分均储存于 -80 &#176;C 冰箱 
		注意：三氟乙酸（TFA）具有强腐蚀性和毒性，可导致严重的皮肤和眼部损伤，并刺激呼吸系统；必须在通风橱中操作，佩戴适当的个人防护装备，包括耐酸手套、护目镜和实验服，废弃物须作为酸性废液收集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 LC-MS/MS 分析每个分馏的肽样品。
	<ol>
		<li>使用C18反相固相萃取柱（标准密度，柱床内径7 mm，体积3 mL）进行脱盐。</li>
		<li>使用 C18 反相液相色谱柱（10 cm 长，75 &#181;m i.d.，3 &#181;m 树脂）以洗脱 10 &#181;每种组分分别用溶液C（0.1%甲酸）和溶液D（80%乙腈和0.1%甲酸）以250 nL/min的流速进行140 min的梯度洗脱。</li>
		<li>在线将经液相色谱分离的肽段输入高分辨率质谱仪进行 MS/MS 分析。</li>
		<li>使用 Proteome Discoverer 1.4 将 Q Exactive 生成的原始谱图文件（.raw）转换为 .mgf 格式，然后将这些 .mgf 文件提交至 MASCOT 2.2 服务器 软件内置的数据库搜索模块 
		注意：&#160;Uniprot 人类&#160;数据库（共 146,704 条序列；于 2025 年 7 月 20 日下载自&#160;http://www.uniprot.org）使用详细的搜索参数（表3).</li>
		<li>从 MASCOT 服务器中获取搜索结果文件（.dat），并重新导入 Proteome Discoverer 1.4。在错误发现率（FDR）阈值下进行数据过滤 &#60;0.01 以获得高置信度的鉴定结果。</li>
		<li>利用 MS/MS 数据鉴定蛋白质氨基酸序列，通过 iTRAQ 报告离子强度定量蛋白质丰度。</li>
		<li>计算实验重复性以确定差异表达蛋白（DEPs）的截断值及显著性 p 值&#60;0,05. 
		注意：在本研究中，截断值确定为倍数变化（FC） &#62; 1.4，可有效消除系统误差。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析胶质瘤新生血管差异表达蛋白的功能特征。
	<ol>
		<li>访问 DAVID（功能注释、可视化与集成发现数据库，版本 6.7；&#160;https://david.ncifcrf.gov/) 主页并选择 开始分析 在菜单栏中启动分析。</li>
		<li>选择左侧面板作为上传界面；将蛋白质或基因 ID 输入到 步骤 1 按照提示将输入框中的内容复制粘贴。</li>
		<li>对于 步骤 2，选择与上传的蛋白质匹配的标识符类型；本研究使用了&#160;UniProt登录号</li>
		<li>对于 步骤 3选择基因列表或背景设置：基因富集分析需要选定一个背景基因集。系统默认使用该物种的全基因组，用户也可上传自定义的蛋白质/基因列表作为背景。</li>
		<li>点击 提交列表 提交条目并启动分析。 
		注意：分析结果显示在“注释摘要结果”面板的右侧。用户可根据分析需求选择输出内容；本研究特别使用了&#160;GOTERM_BP_FAT&#160;列出以分析涉及差异表达蛋白的生物过程。</li>
		<li>获取胶质瘤新生血管差异表达蛋白的生物过程（BPs）、细胞组分（CCs）、分子功能（MFs）及KEGG通路。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明无竞争利益。

激光显微切割联合同位素标记定量蛋白质组学首次鉴定出胶质瘤血管生成的大规模蛋白质组谱
肿瘤血管生成是胶质瘤的关键病理特征，与其高度侵袭性和治疗抵抗性密切相关6,7。传统的抗血管生成疗法（如 VEGF 抑制剂）由于靶点单一及代偿性耐药机制，临床疗效有限19,20,21,22。&#8203;以肿瘤血管生成为靶向的研究具有重要的科学意义。获取肿瘤血管生成的大规模蛋白质组谱图具有迫切需求。本方案的一项关键创新在于利用激光显微切割技术（LCM），从胶质瘤组织中有效分离并富集足量新生血管组织，从而首次获得胶质瘤中肿瘤血管生成的大规模蛋白质组谱图。该技术通过 LCM 直接靶向新生血管组织进行肿瘤...

胶质瘤是一类高度异质性的中枢神经系统（CNS）肿瘤，起源于为神经元提供结构和代谢支持的胶质细胞1，组织学上可分为星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤和室管膜瘤等亚型2。根据世界卫生组织（WHO）分级系统，胶质瘤Ⅰ级和Ⅱ级属于低级别胶质瘤（LGG），通常表现为生长缓慢、具有潜在的长期稳定性，且根据解剖位置的不同，常可进行手术切除。相比之下，Ⅲ级和Ⅳ级属于高级别胶质瘤（HGG），以未分化、恶性程度高为特征，具有高度侵袭性行为和不良预后3。目前的治疗手段仍然有限且疗效不佳；尽管最大程度的安全切除联合术后放疗/化疗可在一定程度上改善预后，但由于肿瘤呈弥漫性浸润性生长且边界不清，难以实现根治性切除，因此仍存在显著的治疗局限性和毒性反应4,5。人类胶质瘤，尤其是高级别胶质瘤，是高度血管化的恶性肿瘤，其生长、增殖和侵袭过程高度依赖于异常的新生血管形成，这是胶质瘤恶性表型的关键特征之一6,7。靶向肿瘤血管生成的研究在实现治疗突破方面具有重要的科学意义。
血管生成本质上涉及内皮细胞在特定刺激下的增殖、迁移和分化，相关研究主要集中在调控因子上：（i）诱导因子，包括血管内皮生长因子（VEGF）8、血管素（VASN）9、缺氧诱导因子1（HIF1）10、转化生长因子β（TGF-β）11、内皮素（endocan）12、血小板源性生长因子（PDGF）13和表皮生长因子（EGF）14；以及（ii）抑制因子，包括血管抑素（angiostatin）15、内皮抑素（endostatin）16、血小板活化因子受体-1（TSP-1）17和金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）18。在I/II/III期脑肿瘤临床试验中，大多数抗血管生成药物靶向VEGF信号通路，因其在血管生成中起核心作用，例如贝伐珠单抗（bevacizumab）是一种通过阻断VEGF抑制新生血管形成的单克隆抗体19,20,21。然而，近期的II/III期临床试验显示，与单用洛莫司汀相比，接受贝伐珠单抗联合洛莫司汀治疗的晚期胶质母细胞瘤患者并未显示出显著的总体生存获益19,20,21,22。关键的是，抗VEGF治疗虽可改善血管异常，但仅能抑制血管生成，缺乏对肿瘤的直接细胞毒性作用，且可能诱导治疗耐药性。因此，仅靶向单一或少数几个血管生成调控因子难以实现根治；有效的治疗策略需同时抑制血管生成，并阻断肿瘤通过血管途径的侵袭与转移。蛋白质在胶质瘤中的诊断和预后价值已得到充分证实，但数十年来恶性胶质瘤的治疗进展仍然有限。
蛋白质组学可利用基于质谱（MS）的技术，包括自上而下法（TDP）和自下而上法（BUP），对生物样本中的全部蛋白质进行全局分析，涵盖表达谱、翻译后修饰（PTMs）以及蛋白质相互作用。高通量质谱技术单次运行即可鉴定数以万计的蛋白质，因而在研究肿瘤机制及治疗靶点发现中具有重要作用。胶质瘤组织以及血液及其衍生物23,24,25、脑脊液26和尿液27等液体活检样本中的蛋白质丰度及其翻译后修饰均可被鉴定。在肿瘤血管系统中，异常的蛋白质表达和翻译后修饰驱动病理性血管改变。胶质瘤新生血管形成过程中的蛋白质变化可通过蛋白质组学方法加以识别，这推动了针对胶质瘤新生血管可靠蛋白质组学分析方案的建立。
然而，新生血管组织仅是全部胶质瘤组织中的一个组成部分。从全部胶质瘤组织中分离并纯化新生血管组织，是实现胶质瘤血管生成准确定量蛋白质组学分析的关键步骤。激光捕获显微切割（LCM）28,29,30,31 是一种有效分离和纯化全部胶质瘤组织中新生血管组织的方法。要获得足量的新生血管组织蛋白用于定量蛋白质组学分析极为困难。2007年，一个研究团队尝试使用LCM从IV级胶质瘤中分离新生血管组织进行蛋白质组学分析，仅通过质谱（MS）鉴定出4种蛋白质32。随后在2012年，该团队继续使用LCM富集IV级胶质瘤的新生血管组织进行定量蛋白质组学分析，也仅通过质谱鉴定出29种蛋白质33。这两项关于胶质瘤血管生成的蛋白质组学研究显示出极低的蛋白质组通量，无法反映胶质瘤血管生成复杂的蛋白质组全景。
本方案建立了一种能够获取足量新生血管蛋白的方法，用于胶质瘤血管生成的定量蛋白质组学分析，从而构建肿瘤血管生成的大规模蛋白质组学图谱。该研究对于发现有效的基于血管生成的生物标志物以及抗血管生成治疗靶点/药物具有重要的科学意义。

<table><tbody><tr><td>96孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific (USA)</td><td>468667</td><td>耗材</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>NanJing Reagent (China)</td><td>C0720114023</td><td>试剂</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Merck (China)</td><td>CN34892</td><td>试剂</td></tr><tr><td>BCA蛋白检测试剂盒</td><td>Abcam (UK)</td><td>ab102536</td><td>试剂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）标准品</td><td>Solarbio (China)</td><td>PC0001-1</td><td>试剂</td></tr><tr><td>离心管（50 mL）</td><td>Kirgen (China)</td><td>KG2811</td><td>耗材</td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica (Germany)</td><td>C1900</td><td>设备</td></tr><tr><td>半胱氨酸</td><td>Aladdin (China)</td><td>C108238</td><td>试剂</td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Amresco (USA)</td><td>D8220</td><td>试剂</td></tr><tr><td>EASY-Spray C18反相高效液相色谱柱</td><td>Thermo Scientific (USA)</td><td>ES800A</td><td>耗材</td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Sartorius (USA)</td><td>BSA224S</td><td>设备</td></tr><tr><td>包埋介质</td><td>Leica (Germany)</td><td>39475237</td><td>耗材</td></tr><tr><td>Empore SPE C18固相萃取柱</td><td>Sigma-Aldrich (USA)</td><td>66872-U</td><td>耗材</td></tr><tr><td>Eppendorf管</td><td>Kirgen (China)</td><td>KG2211</td><td>耗材</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Cytiva (USA)</td><td>Grade42</td><td>耗材</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Aladdin (China)</td><td>F112032</td><td>试剂</td></tr><tr><td>玻璃烧杯</td><td>SHUBO (China)</td><td>1015479</td><td>耗材</td></tr><tr><td>玻璃量筒</td><td>SHUBO (China)</td><td>1601</td><td>耗材</td></tr><tr><td>&amp;zwnj;高分辨率液相色谱-质谱联用仪</td><td>Thermo Scientific (USA)</td><td>Q-Exactive</td><td>设备</td></tr><tr><td>保温容器</td><td>Fhefon (China)</td><td>LCZYX-12</td><td>耗材</td></tr><tr><td>倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>Leica (Germany)</td><td>XDS-1</td><td>设备</td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Solarbio (China)</td><td>I8010</td><td>试剂</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Aladdin (China)</td><td>I112018</td><td>试剂</td></tr><tr><td>iTRAQ试剂</td><td>Sigma-Aldrich (USA)</td><td>4381663</td><td>试剂</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Beyotime (China)</td><td>ST1596</td><td>试剂</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>ShangHai YuanYe (China)</td><td>S24278</td><td>试剂</td></tr><tr><td>激光捕获显微切割系统</td><td>Leica (Germany)</td><td>LMD 6000</td><td>设备</td></tr><tr><td>激光捕获显微切割载玻片</td><td>Leica (Germany)</td><td>3800040</td><td>耗材</td></tr><tr><td>Leica高轮廓一次性刀片</td><td>Leica (Germany)</td><td>14035838926</td><td>耗材</td></tr><tr><td>液氮罐</td><td>KEYICRYO (China)</td><td>YDS-3</td><td>设备</td></tr><tr><td>磁力加热搅拌器</td><td>ShanghaiSILE (China)</td><td>LAB-0002-0068-SHSL</td><td>设备</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>TECAN (Switzerland)</td><td>INFNITE F200</td><td>设备</td></tr><tr><td>PEN&amp;nbsp;膜</td><td>Leica (Germany)</td><td>11505189</td><td>耗材</td></tr><tr><td>pH计</td><td>Sartorius (USA)</td><td>PB-10</td><td>设备</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf (Germany)</td><td>3123000268</td><td>设备</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf (Germany)</td><td>3123000241</td><td>设备</td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf (Germany)</td><td>3123000225</td><td>设备</td></tr><tr><td>PolySULFOETHYL A</td><td>PolyLC Inc (USA)</td><td>104SE0303</td><td>耗材</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Roche (Switzerland)</td><td>05892791001</td><td>试剂</td></tr><tr><td>冷冻离心机</td><td>Beckman (USA)</td><td>AllegraTM X-22R</td><td>设备</td></tr><tr><td>冰箱</td><td>MEILING (China)</td><td>BCD-180KCT</td><td>设备</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Amresco (USA)</td><td>1027P033</td><td>试剂</td></tr><tr><td>染色缸</td><td>Beyotime (China)</td><td>FG005</td><td>耗材</td></tr><tr><td>不锈钢药匙</td><td>Muzixing (China)</td><td>XYS-101</td><td>耗材</td></tr><tr><td>吸头</td><td>Kirgen (China)</td><td>KG1313</td><td>耗材</td></tr><tr><td>甲苯胺蓝染色液</td><td>Sigma-Aldrich (USA)</td><td>198161-5G/198161-25G</td><td>试剂</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Aladdin (China)</td><td>T103293</td><td>试剂</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco (USA)</td><td>T8230</td><td>试剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA溶液</td><td>Solarbio (China)</td><td>T1300</td><td>试剂</td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td>Sanyo (Japan)</td><td>MDF-382E</td><td>设备</td></tr><tr><td>超纯水净化系统</td><td>ELGA (UK)</td><td>PureLAB flex</td><td>设备</td></tr><tr><td>超声波细胞破碎仪</td><td>QSONICA (USA)</td><td>Q500</td><td>设备</td></tr><tr><td>真空冷冻干燥机</td><td>Thermo (USA)</td><td>SNL 315SV</td><td>设备</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Crystal Technology &amp; Industries (USA)</td><td>HYQ-3110</td><td>设备</td></tr><tr><td>水浴培养箱</td><td>Shanghai Yiheng Technology Instrument (China)</td><td>HWS-26</td><td>设备</td></tr><tr><td>称量纸</td><td>Cole-parmer (USA)</td><td>133802</td><td>耗材</td></tr></tbody></table>

从人脑胶质瘤组织制备新生血管组织用于肿瘤血管生成的定量蛋白质组学分析

Preparation Of Neovascular Tissues from Human Glioma Tissues for Quantitative Proteomics Analysis of Tumor Angiogenesis

胶质瘤是中枢神经系统中发病率和死亡率均较高的原发性恶性肿瘤。肿瘤血管生成是胶质瘤病理生理学的标志性特征，也是肿瘤微环境中的重要事件。肿瘤新生血管结构异常，具有双重作用：既为肿瘤提供营养供应，又作为转移门户，使肿瘤细胞侵入血液循环。抗血管生成治疗是癌症研究领域的热点。以往大多数研究集中于肿瘤血管生成的激活因子与抑制因子，但这仅在有限范围内阐明了肿瘤血管生成机制。异常的蛋白表达或翻译后修饰导致胶质瘤中血管形态异常。本实验方案采用激光捕获显微切割技术（LCM），从胶质瘤组织中分离并纯化足量的新生血管组织，用于同位素标记定量蛋白质组学分析，以鉴定胶质瘤新生血管组织与对照组之间差异表达的蛋白质。这些数据为阐明肿瘤血管生成的病理机制、发现抗血管生成治疗靶点以及构建基于肿瘤血管生成的生物标志物提供了重要的科学依据。

已获得足量的LCM分离蛋白质样品，用于定量蛋白质组学分析
为了获得胶质瘤新生血管组织中差异表达蛋白的可靠蛋白质组学谱型，本研究选取了最常见的胶质瘤亚型——III级星形细胞瘤，并利用激光显微切割技术（LCM）分离新生血管组织，因为该组织中富含新生血管。此外，定量蛋白质组学分析要求每个样本至少含有400 µg蛋白质。本研究采用LCM技术，从7例III级星形细胞瘤组织中精确分离出新生血管组织，共获得8.4 mg的LCM分离新生血管组织（表4）。同时，以因脑外伤而切除的3例受损脑组织为来源，共获得27.5 mg正常对照微血管组织（表4）。
由于激光显微切割分离的新生血管组织样本极为珍贵，因此在提取前估算其蛋白质含量至关重要。通常情况下，蛋白质提取率可达样本重量的5%–10%。因此，胶质瘤新生血管组织的预计蛋白含量为420–840 µg，对照组织为1375–2750 µg，此数量足以满足定量蛋白质组学分析的要求(表4)<...

本方案利用激光显微切割技术，成功从胶质瘤样本中制备出足量高质量的新生血管组织，用于肿瘤血管生成的定量蛋白质组学分析，克服了传统研究主要集中于血管生成因子的局限性，提供了胶质瘤血管生成的大规模蛋白质组学图谱。

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，具有较高的发病率和死亡率。肿瘤血管生成是其显著特征……

我们对不同肿瘤分级的胶质瘤血管系统进行蛋白质组学分析，以鉴定生物标志物和神经病理学靶点，揭示驱动血管生成和肿瘤进展的机制。现有方法面临全裂解液中蛋白质降解、一级肿瘤样本稀少以及激光显微切割（LCM）过程中非血管成分污染等问题。本实验方案优化了样本处理流程，提高了血管蛋白谱分析的准确性。首先，获取聚萘二甲酸乙二醇酯膜和可重复使用的载玻片。手动将膜涂覆到可重复使用的载玻片上，并将涂覆好的载玻片在零下80摄氏度条件下保存。将冷冻切片机的腔室和样品头温度均维持在零下25摄氏度。从-80摄氏度冰箱中取出胶质瘤组织，并置于冰上转移。用滤纸去除残留血液。将包埋介质涂于预冷的包埋盘上，迅速包埋组织块。将整个组织块在零下25摄氏度冷冻10分钟以硬化。切片后，将组织切片贴附于标准载玻片上。用0.5%甲苯胺蓝溶液染色，并在光学显微镜下观察新生血管结构。然后将含有阳性组织切片的容器转移至涂有聚萘二甲酸乙二醇酯的激光捕获显微切割载玻片上。密封载玻片，标记标签，并在-80摄氏度下保存。固定载玻片上的组织，染色后将处理好的样品在-80摄氏度下冷冻保存。提前启动激光显微切割仪器，并预热30分钟。使用固态红外激光再预热30分钟，并安装一个500微升的微型离心管收集装置。接着，将载有组织样本的激光显微切割专用载玻片装入准备好的仪器中，利用配套软件对胶质瘤组织中的新生血管进行调焦。沿新生血管的外缘精确勾勒激光标记线，同时避免触及血管壁。使用激光烧灼并分离新生血管，将分离的血管收集至微量离心管盖中。将收集到的新生血管样本管倒置并密封，随后存放在-80摄氏度的冰箱中。将收集的组织重悬于蛋白提取缓冲液中。在冰水浴中对悬液进行超声处理1分钟，以实现完全裂解。将裂解物在16,000 G离心10分钟，然后将上清液转移至新的微量离心管中。使用苦味酸法测定上清液中的蛋白含量，取少量上清液进行蛋白定量。向上清液中加入二硫苏糖醇，使其终浓度为1毫摩尔，并用移液器轻轻混匀，避免产生气泡。分装处理后的上清液，于-80摄氏度保存。向每份提取的蛋白质样品中加入冰冷的丙酮，样品与丙酮的体积比为1:5。混匀后，在-20 °C孵育1小时，然后在4 °C、12,000 ×g离心15分钟。弃去上清液，以去除十二烷基硫酸钠、二硫苏糖醇和三羟甲基氨基甲烷盐酸盐。将沉淀重悬于20微升溶解缓冲液中，其中包含1微升1%十二烷基硫酸钠。接着，向样品中加入2微升二硫苏糖醇还原试剂，并充分混匀。在60摄氏度孵育1小时后，加入1微升碘乙酰胺半胱氨酸封闭试剂，在室温下孵育10分钟。按蛋白质与胰蛋白酶体积比20:1的比例，向每个样品中加入胰蛋白酶。涡旋混匀样品，并在37摄氏度下孵育过夜。用50微升异丙醇重新溶解每个iTRAQ样品。将相应的三联肽样品加入试剂管中，在室温下孵育1小时。孵育结束后，加入三倍反应体积的超纯水以终止反应，并在室温下继续孵育30分钟。等量混合六个标记样品，充分混匀后进行冻干。将冻干肽溶解于2毫升溶液A中，溶液A包含10毫摩尔的磷酸二氢钾和25%乙腈，pH值为2.7。将样品通过磺乙基功能化的阳离子交换柱后，使用适当的缓冲液梯度将各组分分别收集到不同的离心管中。最后，通过真空离心浓缩每个组分。用 40 微升体积分数为 0.1% 的三氯乙酸重悬各组分，并将所有组分在 -80 摄氏度下保存。通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）分析各组分的肽段样品。鉴定出的肽段质量偏差呈以零为中心的正态分布。肽段长度分布显示，绝大多数肽段的长度为8至20个氨基酸残基。所有已鉴定蛋白质的相对分子质量分布表明，几乎100%的蛋白质分子量分布在0至200千道尔顿之间。且大多数蛋白质的等电点分布在4至10之间。定量分析鉴定出胶质瘤新生血管组织与对照组相比存在371种差异表达蛋白，其中包括170种表达上调蛋白和201种表达下调蛋白。基因本体分析在371种差异表达蛋白中鉴定出76个具有统计学意义的细胞组分、75个具有统计学意义的生物学过程以及46个具有统计学意义的分子功能。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析在371种差异表达蛋白中鉴定出23条具有统计学意义的信号通路变化。利用四种算法进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析，鉴定了25个枢纽差异表达蛋白。本方案能够分析胶质瘤血管系统中的差异蛋白表达，鉴定出与肿瘤分级相关的血管生成相关蛋白，并利用气道技术对蛋白组学基因进行定量。一个重要挑战是在光学显微镜下准确定位肿瘤新生血管，并精确收集分离的血管。我们未来的研究将分析特定级别的血管生成蛋白组学、PTM 组学、通路图谱以及多组学整合的生物标志物和药物靶点。

preparation-neovascular-tissues-from-human-glioma-tissues-for

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

从人类胶质瘤组织中制备新生血管组织，用于肿瘤血管生成定量蛋白质组学分析

恶性胶质瘤是一类具有显著临床和分子特征的高度侵袭性胶质肿瘤，其构成具有异质性。在临床前动物模型中，原位移植的原代异种移植瘤能够重现恶性胶质瘤亚型的组织病理学和分子特征。...

原位胶质瘤原代异种移植模型重现浸润性生长及异柠檬酸脱氢酶I突变

采用无血清神经球培养基对分离的高级别胶质瘤手术标本进行传代培养，以富集具有肿瘤干细胞表型的细胞。对于无法形成神经球的标本，提供了一种替代性实验方案。同时介绍了保持神经球三维结构的石蜡包埋技术，用于免疫细胞化学分析。...

优化高级别胶质瘤手术标本的细胞培养，用于临床相关动物模型及三维免疫化学分析

本文介绍了一种简单的方法，用于分离和流式细胞术分析胶质瘤浸润的外周血单个核细胞，该方法可获得随时间变化的定量数据，反映进入早期脑肿瘤微环境的免疫细胞数量及其活化状态。...

胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析

利用三维人类生物凝胶培养系统，可将多形性胶质母细胞瘤的患者来源异种移植瘤微型化为活体微肿瘤。这种模拟体内环境的三维肿瘤检测方法适用于药物反应测试和分子谱型分析，包括激酶组学分析。...

利用三维人类生物凝胶培养系统和患者来源的胶质母细胞瘤细胞生成微肿瘤用于激酶组学分析和药物反应测试

本方案旨在利用显色免疫组织化学法和ImageJ软件，对胶质母细胞瘤患者切除组织中的肿瘤微环境组分进行定量鉴定。...

患者胶质母细胞瘤切除组织中细胞微环境的定量免疫组织化学分析

以三维培养方式生长的神经球是研究胶质瘤生物学的有力工具。本文介绍了一种在通过石蜡包埋保持胶质瘤神经球三维结构的前提下进行免疫组织化学分析的实验方案。该方法可用于表征胶质瘤神经球的特性，如干性及神经分化能力。...

通过石蜡包埋的三维胶质瘤神经球培养物免疫组织化学评估胶质瘤生物标志物

激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

该论文介绍了采用固相微萃取技术对人脑肿瘤进行现场取样，随后进行生化分析，以期发现生物标志物。...

脑肿瘤代谢组学与脂质组学分析的现场取样与提取

蛋白质组失调在弥漫性浸润性胶质瘤的扩散过程中起着重要作用，但仍有多种相关蛋白质尚未被鉴定。数字空间分析技术（DSP）为高效、高通量地表征可能参与浸润性胶质瘤侵袭与迁移的候选蛋白质的差异表达提供了一种有效方法。...

用于表征成人型弥漫性浸润性胶质瘤微环境的数字空间分析

我们介绍一种利用新诊断和复发性肿瘤患者来源的磁性胶质瘤球体构建的三维胶质母细胞瘤迁移模型。该平台可实现对患者特异性迁移动态的可视化，并可用于评估治疗效果。在迁移完成后，该检测方法还可进行多重分析，以评估蛋白质的定位和表达模式。...

可重复的缺氧条件下磁性纳米颗粒介导类球体定位的三维胶质母细胞瘤迁移实验

探索激光捕获显微切割结合iTRAQ定量蛋白质组学技术，从人类胶质瘤组织中精确分离新生血管并进行差异蛋白分析。该方法可识别371个差异表达蛋白，为肿瘤血管生成机制研究及抗血管生成治疗靶点发现提供科学依据。

从人脑胶质瘤组织制备新生血管组织用于肿瘤血管生成的定量蛋白质组学分析

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