Name: 建立典型脂肪胰腺肥胖大鼠模型的方法的开发和验证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 7 s
Description: 了解建立典型脂肪胰腺肥胖大鼠模型的标准化方法，包括胰腺组织采样和免疫组织化学技术。该方案为肥胖机制研究提供了可重复的动物实验基础。

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本工作得到了第七批全国名老中医药专家学术经验继承工作继承人及指导老师项目、国家自然科学基金青年科学基金项目［资助号 82305376］、2024年度江苏省科技青年人才支持项目［资助号 JSTJ-2024-380］的资助。
流程图使用 FigDraw 和 Biorender 制作。

动物处理程序已获得南京中医药大学动物伦理委员会批准（编号：202006A016），并符合ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南、伦理准则、《1986年动物（科学程序）法》操作指南及相关指南，以及欧盟用于科学目的动物保护指令2010/63。所有实验动物在解剖前均按照批准的啮齿类动物麻醉程序进行麻醉。该程序分为三个独立部分。
1. 建立肥胖大鼠模型
<ol>
	<li>实验动物与分组
	<ol>
		<li>选取4周龄（80–120 g）对高脂饮食（HFD）敏感的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠作为实验动物。</li>
		<li>所有大鼠先以维持饲料适应性喂养1周，随后随机分为两组：对照组和模型组。</li>
		<li>1周后，模型组更换为HFD喂养，对照组继续维持原饲料喂养，两组均持续喂养14周。HFD配方详见表1，标准维持饲料配方见表2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>饲养条件与实验参数
	<ol>
		<li>环境参数：温度22 ± 2 °C，湿度50 ± 10%，12 h光照/黑暗循环，自由饮水与进食。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>监测指标
	<ol>
		<li>每周固定时间记录体重和摄食量。 
		注：傍晚测量可最大限度减少应激反应，并与昼夜节律活动模式保持一致18。</li>
		<li>根据记录数据绘制体重增长曲线。</li>
		<li>以体重超过同龄对照组20%作为肥胖建模成功的标准。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>成分</td>
			<td>含量 (g/kg)</td>
			<td>提供的主要营养素</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>普通粉状饲料</td>
			<td>365</td>
			<td>碳水化合物、植物蛋白、脂肪、维生素复合物、矿物质等基本营养供给</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>猪油</td>
			<td>310</td>
			<td>饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酪蛋白</td>
			<td>250</td>
			<td>必需氨基酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>胆固醇</td>
			<td>10</td>
			<td>胆固醇</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>纤维素与矿物质混合物</td>
			<td>60</td>
			<td>纤维、钙、磷、钠等</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-蛋氨酸 蛋氨酸/蛋氨酸氨基酸</td>
			<td>3</td>
			<td>必需氨基酸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>酵母</td>
			<td>1</td>
			<td>B族维生素、β-葡聚糖等</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1</td>
			<td>NaCl&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于建立大鼠模型肥胖症（DIO）的特殊高脂饮食配方。 本表详细列出了本研究中模型组所使用的高脂饮食（HFD）的具体成分，该饮食从适应期结束开始给予，直至组织采集为止。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>成分</td>
			<td>含量</td>
			<td>单位</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>水分</td>
			<td>12.196</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>粗蛋白 (CP%)</td>
			<td>18.272</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>消化能 (DE)</td>
			<td>3.186</td>
			<td>Mcal/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>代谢能 (ME)</td>
			<td>2.939</td>
			<td>Mcal/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>净能 (NE)</td>
			<td>2.228</td>
			<td>Mcal/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙醚提取物 (EE%)</td>
			<td>4.417</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>粗纤维 (CF%)</td>
			<td>3.677</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>钙 (Ca%)</td>
			<td>0.991</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总磷</td>
			<td rowspan="2">0.681</td>
			<td rowspan="2">%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;(总磷%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>非植酸磷</td>
			<td>0.19</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>食盐</td>
			<td>0.407</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>赖氨酸</td>
			<td>1.118</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>可消化赖氨酸</td>
			<td>0.813</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蛋氨酸</td>
			<td>0.53</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>苏氨酸</td>
			<td>0.779</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>色氨酸</td>
			<td>0.221</td>
			<td>%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>铜 (Cu)</td>
			<td>22.06</td>
			<td>mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>铁 (Fe)</td>
			<td>173.69</td>
			<td>mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>锰 (Mn)</td>
			<td>102.1176</td>
			<td>mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>锌 (Zn)</td>
			<td>60.3687</td>
			<td>mg/kg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：大鼠的标准维持饲料配方。 该表格列出了标准维持饲料的配方，所有大鼠在适应期均接受该饲料喂养，对照组在整个研究期间持续使用该饲料。
2. 组织采集
<ol>
	<li>术前准备
	<ol>
		<li>禁食处理：安乐死前禁食12小时，以减少肠道内容物对生化分析的干扰。</li>
		<li>麻醉：给予异氟烷 通过 吸入麻醉以实现深度麻醉（诱导浓度4%，维持浓度1.5%-2%）。麻醉机配备异氟烷挥发罐，麻醉维持浓度保持在1.5%-2%。作为准备参考，每只大鼠整个实验过程中液态异氟烷的物理消耗量约为0.5 mL–0.8 mL。</li>
		<li>监测麻醉深度：持续监测呼吸频率和角膜反射。在整个手术过程中维持稳定的麻醉状态，以防止死后胰腺自溶。</li>
		<li>处理麻醉不足：若麻醉深度不足或意识恢复，应立即提高异氟烷浓度以补充麻醉，并在继续操作前重新检查生命体征。 
		注意：异氟烷麻醉符合南京中医药大学实验动物中心的伦理要求。此外，现有证据表明，在啮齿类动物中，异氟烷可能比氯胺酮具有更高的安全性。19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>新鲜组织采集
	<ol>
		<li>皮肤消毒：用75%乙醇快速喷洒整个体表（1-2秒），以防止毛发污染腹腔器官。</li>
		<li>体位固定：将大鼠仰卧置于解剖台上，用胶带牢固固定四肢。</li>
		<li>剖腹术：用镊子夹住腹部皮肤，用剪刀沿肋缘下缘做横向切口。采用钝性分离法分离皮下筋膜和结缔组织。</li>
		<li>胰腺识别：轻轻将肠管向左推移，以暴露胃、脾脏和十二指肠。脾脏与胰腺尾部相连，胃则紧邻胰腺。</li>
		<li>快速解剖：用镊子轻轻抬起脾脏，逐步切断胰腺与脾脏、胃及十二指肠系膜的连接，以分离胰腺。由于胰腺组织脆弱，应避免直接钳夹胰实质，并注意保护胰管和血管，以防组织撕裂。</li>
		<li>组织保存：将解剖出的胰腺迅速用预冷的 PBS（1× 磷酸盐缓冲液，pH 7.4）或生理盐水冲洗，以去除残留血液。立即将胰腺转移至 2 mL 冻存管中，30 秒内浸入液氮中，随后于 -80 °C 长期保存。</li>
		<li>安乐死与尸体处理 
组织取材后，通过颈椎脱位法对所有实验大鼠实施安乐死。根据南京中医药大学实验动物中心的规定，动物尸体属于病理性生物医疗废物（废物代码：831-003-01）。所有动物尸体须按规定密封于密闭袋中，并统一存放于指定冷冻设备中。尸体将由学校进行集中、环保的无害化处理，严禁随意丢弃。 
		注意：避免在室温下暴露，以防生物分子发生酶降解20,21.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌注组织采集（后续步骤相同）
	<ol>
		<li>暴露心脏：用左手提起大鼠的皮肤组织，右手打开胸腔，充分暴露心脏。 
		注意：在进行开胸切口以实施心脏灌注手术之前，必须先诱导达到深度麻醉状态。</li>
		<li>准备左心室以进行灌注：在左心室上做一个与灌注针直径相匹配的小切口，并切开右心耳以允许血液流出。</li>
		<li>灌注生理盐水：将灌注针轻轻插入左心室，以10 mL/min的流速缓慢灌注100 mL生理盐水，直至右心房流出液变澄清。</li>
		<li>灌注固定液：切换至200 mL的4%多聚甲醛固定液，流速为5 mL/min。每只大鼠先灌注100 mL生理盐水，随后灌注200 mL的4%多聚甲醛。本研究使用市售的PFA溶液。由于PFA溶液不稳定，其效果可能因配制方法和新鲜程度而存在显著差异，因此液体溶液需避光保存于4 °C。已分装开启的溶液应尽快使用，以确保其有效性。若由粉末配制，应在使用前新鲜配制。 
		注意：佩戴手套、护目镜和实验服；由于多聚甲醛具有毒性，操作须在通风橱中进行。根据南京中医药大学实验动物中心的规定，多聚甲醛废弃物被归类为化学性生物医疗废物（废物代码：831-004-01）。使用后必须储存在贴有生物危害标志的专用废液容器中，由学校统一集中处理，严禁随意丢弃。</li>
		<li>确认灌注成功：检查肢体是否出现僵硬，以判断固定是否有效。</li>
		<li>将胰腺置于含有30 mL 4%多聚甲醛溶液的50 mL离心管中。将离心管静置避光保存2–4小时，以固定组织。</li>
		<li>将胰腺转移至一个新的50 mL离心管中，管内含30 mL 70%乙醇溶液。将离心管静置并避光保存约20–24小时。22.</li>
		<li>石蜡包埋：将组织包埋于石蜡中。将包埋后的组织储存于4 °C或-20 °C。 
		注意：本研究使用了石蜡切片。冷冻切片也是一种可行的替代方法，但必须在实验前验证抗体在特定切片类型中的性能，以确保获得最佳结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 胰腺免疫组织化学（IHC）染色
<ol>
	<li>切片与贴片方案
	<ol>
		<li>石蜡切片：使用切片机将组织切成 6 µm 厚的切片，并贴附于载玻片上。</li>
		<li>漂浮法：将切片置于 40 °C 的组织漂浮浴中，以展平皱褶。</li>
		<li>组织收集：将切片贴附于涂有粘附剂的载玻片上（每张载玻片贴 2–3 片），并在 80 °C 的载玻片加热器上干燥。</li>
		<li>载玻片干燥：切片完成后，将贴好组织的载玻片转移至 60 °C 烤箱中过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱蜡与复水方案
	<ol>
		<li>将载玻片放入染色架中，并依次浸入以下溶液：二甲苯 I，7 分钟；二甲苯 II，7 分钟；无水乙醇，5 分钟；90% 乙醇，5 分钟；85% 乙醇，5 分钟；75% 乙醇，5 分钟；蒸馏水，5 分钟；PBS，5 分钟（三次）。 
		注意：二甲苯步骤应在通风橱中佩戴手套和护目镜进行。二甲苯废液的处理应遵循与对多聚甲醛相同的步骤 2.3.4 所规定的方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原修复方案
	<ol>
		<li>柠檬酸钠溶液的配制：配制 pH 6.0 的柠檬酸钠缓冲液。我们采用自制缓冲液，将一包粉末溶于 1 L 水中。</li>
		<li>微波处理程序：将载玻片放入盛有柠檬酸钠缓冲液的玻璃染色缸中，确保液体覆盖载玻片，然后将染色缸放入微波炉中。样品按以下程序进行微波处理：中火（600 W）8 分钟，随后静置不加热 8 分钟，最后低火（300 W）7 分钟。</li>
		<li>自然冷却至室温：让容器自然冷却至室温。</li>
		<li>PBS：用 PBS 漂洗载玻片，每次 5 分钟，共两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育
	<ol>
		<li>H2O2：在组织切片上加入 3% H2O2，作用 10 分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。每张载玻片加入约 50–80 µL H2O2。</li>
		<li>PBS：用 PBS 漂洗载玻片，每次 5 分钟，共三次。</li>
		<li>链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC）：将 SABC 溶液滴加至组织上，在 37 °C 孵育箱中染色 30 分钟。每张载玻片加入约 50–80 µL SABC。</li>
		<li>PBS：用 PBS 漂洗载玻片，每次 5 分钟，共三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显色
	<ol>
		<li>3,3'-二氨基联苯胺（DAB）：将 DAB 显色液滴加至组织切片上，观察至出现黄褐色着色为止。染色时间约为 1–5 分钟。根据组织特异性和环境温度调整染色时间。对于胰腺组织，建议在 22 °C 下染色 2 分钟。</li>
		<li>漂洗：立即用蒸馏水轻柔冲洗载玻片以终止反应。</li>
		<li>浸洗：将载玻片浸入蒸馏水中 5 分钟，以去除残留试剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>苏木精染色
	<ol>
		<li>苏木精：将载玻片浸入苏木精溶液中 1 分钟。苏木精溶液使用纯水按 56 mg/mL 的比例配制。</li>
		<li>漂洗：用蒸馏水漂洗两次，每次 5 秒。</li>
		<li>盐酸酒精分化：将载玻片浸入盐酸酒精分化液中 1 秒进行分化。</li>
		<li>浸洗：将载玻片浸入自来水中 10 分钟，以获得稳定的蓝色细胞核染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脱水：依次将载玻片通过以下溶液进行脱水：70% 乙醇、80% 乙醇、90% 乙醇、无水乙醇、二甲苯 I 和二甲苯 II，每种溶液中各 3 分钟。 
	注意：二甲苯步骤应在通风橱中佩戴手套和护目镜进行。</li>
	<li>封片
	<ol>
		<li>中性树胶封片：使用橡胶头滴管将中性树胶滴加至载玻片上，盖上盖玻片。避免用力挤压胶头，以防产生气泡。每张载玻片使用约 50 µL 中性树胶。</li>
		<li>晾干：将载玻片置于通风橱中过夜，使中性树脂完全干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 蛋白质印迹（WB）分析
<ol>
	<li>组织分解
	<ol>
		<li>取200 mg大鼠胰腺组织，放入含有1 mL裂解缓冲液和3个小钢珠的2 mL研磨管中。裂解缓冲液由完全蛋白酶抑制剂混合物和RIPA裂解缓冲液组成，混合比例为1片蛋白酶抑制剂：50 mL RIPA裂解缓冲液。</li>
		<li>使用球磨仪进行研磨，参数如下：频率：30/s；时间：30 s；重复10–15次，直至肉眼不可见白色颗粒。</li>
		<li>将上层蛋白质上清液转移至1.5 mL微量离心管中，避免吸取泡沫。在4 °C条件下，以16900 ×g离心30 min。 
		注：用于Western blot分析的匀浆物来自整个胰腺组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质定量：根据制造商说明书，使用Pierce BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白质浓度。BCA工作液的混合比例为溶液A：溶液B = 50:1。</li>
	<li>蛋白质电泳：
	<ol>
		<li>将制备好的胰腺蛋白质样品（每泳道上样6 µL）加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶-Young PAGE、Bis-Tirs、10 × 8中进行电泳。</li>
		<li>使用Mini-PROTEAN Tetra系统，先以70 V运行0.5 h，然后以110 V运行1 h。将20× MOPS电泳运行缓冲液用纯水稀释至1×浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转膜
	<ol>
		<li>使用纯水将eBlot L2转膜浓缩液5×稀释至1×工作浓度。该1×转膜缓冲液最多可重复使用3次。使用纯水将eBlot L2平衡浓缩液5×稀释至1×工作浓度。</li>
		<li>将PVDF膜（Immobilon-P转印膜）裁剪至适当尺寸（例如7.5 cm × 5.5 cm），孔径为0.45 µm。</li>
		<li>在尺寸为90 × 60 × 32 mm的孵育盒中倒入约30 mL甲醇。将PVDF膜浸入甲醇中5 s以活化。</li>
		<li>在另一个洁净的孵育盒中倒入约30 mL已配制的1×平衡溶液。小心从电泳板中取出凝胶，并将其放入平衡溶液中。</li>
		<li>将已活化的PVDF膜从甲醇中取出，同样放入含有平衡溶液的孵育盒中。确保膜位于凝胶下方以实现良好接触。使两者充分平衡。</li>
		<li>按照转膜装置制造商的说明，将转膜&#34;三明治&#34;结构按从上到下的顺序放置：海绵、凝胶、PVDF膜、海绵。确保各层之间无气泡残留。将组装好的转膜组件正确放入转膜装置腔室中。连接电源，以标准模式运行15 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭
	<ol>
		<li>准备两个孵育盒，一个加入约15 mL TBST（Tris缓冲盐水-Tween20），另一个加入约15 mL 5% BSA封闭液。</li>
		<li>TBST溶液的配制：将一袋Tris缓冲盐粉末溶于2 L纯水中，然后加入2 mL Tween 20。</li>
		<li>将PVDF膜放入TBST溶液中，确保与凝胶接触的一面朝上。</li>
		<li>在室温下，以40 rpm在摇床上洗涤PVDF膜3–5 min。</li>
		<li>将PVDF膜转移至封闭缓冲液中，在室温下以20 rpm在摇床上封闭1 h。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一抗孵育
	<ol>
		<li>将PVDF膜放入含有TBST的孵育盒中，在室温下以40 rpm在摇床上洗涤3次，每次5 min。</li>
		<li>在另一抗体孵育盒中，用5% BSA封闭液按1:40000比例稀释Vinculin多克隆抗体，于4 °C孵育过夜（14–18 h），并在摇床上以20 rpm缓慢振荡。</li>
		<li>确保抗体使用根据本节指定比例配制的5% BSA封闭液进行稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育
	<ol>
		<li>将PVDF膜放入含有15 mL TBST溶液的孵育盒中，在室温下以40 rpm在摇床上洗涤3次，每次5 min。</li>
		<li>将Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody用5% BSA封闭缓冲液按1:2000比例稀释，配制二抗溶液。</li>
		<li>在室温下以20 rpm在摇床上孵育1 h23。</li>
		<li>按照上述方法，用TBST溶液洗涤PVDF膜3次，每次5 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测
	<ol>
		<li>在孵育盒中直接按1:1体积比混合AccuWest ECL Plus试剂A和AccuWest ECL Plus试剂B，配制工作底物溶液。后续所有操作均需避光进行。</li>
		<li>将PVDF膜在溶液中孵育5–10 s，随后立即使用增强型化学发光（ECL）试剂-Vilber Fusion FX6 MINI检测免疫反应条带。典型曝光时间范围为5–10 s。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

作为代谢综合征的主要驱动因素，单纯性肥胖是系统性脂质代谢紊乱的最初表现。若不进行干预，其可能进展为2型糖尿病（T2DM）及严重的糖尿病并发症，凸显了早期代谢纠正的必要性30。胰腺脂肪变性（脂肪胰腺）是肥胖中异位脂质沉积的早期标志，它重新定义了胰腺为一种非经典的脂肪器官，挑战了传统的脂肪-肝脏轴心学说。这一转变对于阐明器官间代谢交互作用具有重要意义，有助于揭示能量失衡机制，并预防肥胖相关疾病（如T2DM、非酒精性脂肪性肝病[NAFLD]）31,32,33。新兴研究提出非酒精性脂肪性胰腺病（NAFPD）作为一种新的临床实体，与代谢综合征密切相关34。值得注意的是，儿童NAFPD与NAFLD的加速进展相关，表现为严重的肝脂肪变性、肝损伤和肝纤维化，因此NAFPD被视为T2DM、胰腺炎及脂肪肝疾病早期诊断和干预的战略性生物标志物3...

单纯性肥胖是指在无其他合并症情况下独立存在的肥胖，主要归因于不健康的生活方式（如不合理的饮食模式和体力活动不足）所导致的能量失衡1。肥胖显著推动了年轻人群中非传染性疾病发病率的上升，其特征为高患病率、发病年龄提前以及多系统并发症，已成为一项严峻的全球公共卫生挑战2。脂肪胰是一种在代谢紊乱过程中脂肪异位沉积于这一非脂肪器官的病理状态。脂肪胰反映了脂肪组织与胰腺生理病理之间的关键相互作用。过量的胰腺脂肪积聚会取代正常的腺泡和胰岛组织，导致外分泌和内分泌功能双重受损3,4。这一病理过程会破坏α/β细胞比例，促进β细胞去分化，进而丧失胰岛素分泌功能5，并介导脂肪对β细胞的直接脂毒性损伤6。同时，α细胞增生及胰岛素释放失调会加剧血糖波动，加速向2型糖尿病（T2DM）及其相关并发症的进展7。
研究脂肪胰腺的发病机制揭示了代谢性疾病进展背后的新机制8。尽管以往的肥胖研究主要关注肝脏脂肪变性，但新近证据表明，胰腺脂质沉积是代谢紊乱中更早发生的事件9。这一范式转变使得构建一个针对单纯性肥胖的双器官病理模型成为可能，该模型整合了胰腺和肝脏的脂肪变性10。研究这两个器官之间的相互作用，可能阐明从脂质代谢紊乱、肥胖、胰岛素抵抗到糖尿病这一疾病谱系中的关键通路，为疾病机制提供新的见解11。在胰腺的病理过程中，最初的表现为显著的胰腺脂肪沉积，并伴有胰腺脂肪细胞的大量扩张。这种变化主要出现在胰头、胰颈和胰体的腹侧区域，且主要位于腺泡细胞与胰岛细胞之间的间质区域。与此同时，胰腺存在慢性低度炎症，但在这一阶段，内分泌和外分泌功能仍基本保持完整12,13。广泛的脂肪浸润进一步通过脂毒性损害胰腺β细胞功能，并抑制胰岛素活性。在此阶段，腺泡细胞逐渐被脂肪细胞取代，从而促进2型糖尿病（T2DM）的发展14,15。尽管糖尿病本身并非胰腺癌的独立危险因素，但有急性胰腺炎病史且合并糖尿病的患者，其发生胰腺癌的风险显著升高16。
大体解剖学分析可量化胰腺脂肪变性的严重程度及浸润模式，而免疫组织化学（IHC）在显微水平上的评估则可表征腺泡细胞形态、细胞核定位、空泡化频率以及细胞群体动态17。这种多模态方法涵盖了从宏观解剖观察到细胞分辨率的免疫组织化学分析，能够对疾病进展过程中胰腺病理变化进行全面分期。本研究详细描述了一项标准化方案，包括为期1周的适应性饲养、在成年大鼠中进行为期14周的肥胖诱导，以及优化的胰腺组织处理流程用于形态学分析，从而为研究脂肪变性相关的代谢紊乱建立了一个可靠的实验框架。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微型离心管</td><td>博奥森生物科技有限公司</td><td>BS-15-M</td><td>WB</td></tr><tr><td>2 ml 冻存管</td><td>LABSELECT</td><td>CV-002-200-EX</td><td>WB</td></tr><tr><td>2ml 研磨管</td><td>武汉赛维尔生物科技有限公司</td><td>HT-200-M</td><td>WB</td></tr><tr><td>3% H2O2</td><td>Booster Electronics Technology Co., Ltd.</td><td>20A23C</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>百奥舍生物工程有限公司</td><td>BL539A</td><td>灌注胰腺解剖手术</td></tr><tr><td>5% BSA 溶液</td><td>Biofroxx</td><td>4240GR100</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>50 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>博硕生物科技有限公司</td><td>BS-500-M</td><td>组织保存</td></tr><tr><td>AccuWest ECL Plus，Raegent A</td><td>南京基因易生物科技有限公司</td><td>Q201220</td><td>WB</td></tr><tr><td>AccuWest ECL Plus，Raegent B</td><td>南京基因易生物科技有限公司</td><td>Q201220</td><td>WB</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>上海 SCR-生物技术有限公司</td><td>10009257</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>抗兔 IgG，HRP 标记抗体</td><td>Cell Signaling Technology, Inc.</td><td>7074</td><td>WB</td></tr><tr><td>cOmplete蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏有限公司&amp;nbsp;</td><td>82256300</td><td>WB</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD</td><td>10212450C</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>DAB显色液</td><td>Booster Electronics Technology Co., Ltd.</td><td>AR2017-1</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>镊子</td><td>深圳瑞沃德生命科学有限公司</td><td>SP0007-M</td><td>SD大鼠解剖</td></tr><tr><td>载玻片&amp;nbsp;</td><td>CITOTEST LABWARE MANUFACTURING Co., LTD</td><td>188105</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>玻璃染色缸</td><td>上海碧云天生物技术有限公司</td><td>FG010</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>苏木精</td><td>上海碧云天生物技术有限公司</td><td>ST2067-20g</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>高脂饮食</td><td>苏州双实实验动物饲料科技有限公司</td><td>表1</td><td>实验动物饲喂</td></tr><tr><td>盐酸酒精</td><td>上海碧云天生物技术有限公司</td><td>C0163M</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>深圳瑞沃德生命科学有限公司</td><td>R510-22-10</td><td>麻醉的大鼠</td></tr><tr><td>甲醇&amp;nbsp;</td><td>Biofroxx</td><td>67-56-1</td><td>WB</td></tr><tr><td>MOPS 电泳缓冲液 液体 20&amp;times;</td><td>南京金斯瑞生物科技有限公司&amp;nbsp;</td><td>C36842504</td><td>WB</td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>北京索莱宝科技有限公司 &amp;科技有限公司</td><td>G8590</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>中性树脂</td><td>上海 SCR-生物技术有限公司</td><td>G8590</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>PBS 溶液</td><td>江苏凯基生物技术股份有限公司</td><td>KGL2206-500</td><td>组织保存</td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>ZB382867</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>ZB382867</td><td>WB</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏有限公司&amp;nbsp;</td><td>82256300</td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜（Immobilon-P Transfer Membrane，Millipore，0000380346）&amp;nbsp;</td><td>默克密理博</td><td>0000380346</td><td>WB</td></tr><tr><td>RIPA裂解缓冲液</td><td>百奥锐生物工程有限公司</td><td>BL504A, 70096436</td><td>WB</td></tr><tr><td>SABC</td><td>Booster Electronics Technology Co., Ltd.</td><td>20C03A</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>山西晟高动物药业有限公司&amp;nbsp;</td><td>270071460</td><td>组织保存</td></tr><tr><td>SD雄性大鼠</td><td>江苏集萃药康生物科技股份有限公司&amp;nbsp;</td><td>D000017</td><td>大鼠</td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>默克生命科学</td><td>S1804</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>标准维持饲料</td><td>苏州双实实验动物饲料科技有限公司</td><td>表2</td><td>实验动物喂养</td></tr><tr><td>eBlot L2 平衡浓缩液 5&amp;times;</td><td>南京金斯瑞生物科技有限公司&amp;nbsp;</td><td>C97212410&amp;nbsp;</td><td>WB</td></tr><tr><td>eBlot L2 转移浓缩液 5&amp;times;</td><td>南京金斯瑞生物科技有限公司&amp;nbsp;</td><td>C97211504</td><td>WB</td></tr><tr><td>Tris缓冲盐溶液，粉末&amp;nbsp;</td><td>百奥锐生物工程有限公司</td><td>BL602A</td><td>WB</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Biofroxx</td><td>EZ681A3EA8</td><td>WB</td></tr><tr><td>urethane</td><td>Sigma-Aldrich 公司</td><td>U2500-100G</td><td>麻醉大鼠</td></tr><tr><td>Vinculin 多克隆抗体</td><td>Proteintech Group, Inc</td><td>26520-1-AP</td><td>WB</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>南京试剂有限公司</td><td>C0430530223</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>Young PAGE，Bis-Tris，10&amp;times;8</td><td>南京金斯瑞生物科技有限公司&amp;nbsp;</td><td>C33152505</td><td>WB</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>深圳瑞沃德生命科学有限公司</td><td>Model R5805</td><td>麻醉的大鼠</td></tr><tr><td>球磨机&amp;nbsp;</td><td>Retsch Technology GmbH - Microtrac</td><td>MM400</td><td>WB</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf SE</td><td>5418R</td><td>WB</td></tr><tr><td>计算机化生物组织干燥仪</td><td>浙江金华科迪仪器有限公司</td><td>SC2013-G-KIT</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>增强型化学发光（ECL）试剂&amp;nbsp;</td><td>VILBER 生物成像</td><td>00170961</td><td>WB</td></tr><tr><td>切片机&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>HM325</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>微波</td><td>上海博迅实业有限公司&amp;nbsp;</td><td>97000</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 系统</td><td>伯乐生命科学公司</td><td>1658004</td><td>WB</td></tr><tr><td>烤箱</td><td>上海晶鸿科学有限公司</td><td>DNP-9082</td><td>免疫组织化学</td></tr><tr><td>纯水</td><td>四川优普超纯科技有限公司</td><td>ULUP-TEZ</td><td>免疫组织化学</td></tr></tbody></table>

建立典型脂肪胰腺肥胖大鼠模型的方法学开发与验证

Development and Validation of a Methodology for Establishing Obese Rat Models with Typical Fatty Pancreas

肥胖已成为全球主要的公共卫生流行问题，全球近一半人口被归类为超重或肥胖。肥胖个体的一个关键病理特征是脂质在非脂肪组织（包括胰腺）中的异位沉积，这种情况被称为胰腺脂肪变性或脂肪胰腺。在高脂饮食（HFD）诱导的啮齿类动物模型中，胰腺脂肪变性始终早于肝脏脂肪变性，突显了胰腺对脂质积聚的特殊易感性。这种早期受累使胰腺成为理解肥胖相关代谢紊乱的关键器官。尽管饮食诱导的肥胖（DIO）大鼠模型能够再现人类疾病进展的核心特征，但目前文献中仍缺乏对这一胰腺表型特征明确且可重复的动物模型。
在建立人类肥胖模型时，一个重要的方法学考虑因素是高脂饮食（HFD）引入的时间。许多现有模型在断奶期即开始给予HFD，这可能会引入混杂的发育期代谢编程效应，而这些效应并不能充分反映主要在发育完成后才发生的的人类肥胖。相比之下，本研究建立了一种标准化的实验方案，在断奶后才引入HFD。该方法更准确地模拟了人类成年后发生肥胖的常见轨迹，避免了生命早期的代谢适应，并导致更符合生理实际情况的胰腺脂肪变性进展过程。
本研究提供了一个详细且可重复的框架，用于构建以显著脂肪性胰腺病变为特征的肥胖大鼠模型。该方法包括1周的适应期、断奶后开始的14周高脂饮食诱导期，以及系统的组织采集。文中描述了两种组织处理途径：速冻处理用于分子分析（如蛋白质印迹），以及经多聚甲醛灌注固定用于形态学评估（如免疫组化、H&amp;#38;E染色）。该模型为深入研究与肥胖相关的胰腺代谢功能障碍机制提供了可靠的平台。

我们描述了一种可重复的实验方案，用于建立一种能够稳定呈现脂肪性胰腺的简单肥胖模型（图1）。从动物喂养、组织采集到后续分子验证的整个流程在图1中以示意图形式进行了总结。记录了模型组（n = 5）和对照组（n = 5）的每周体重变化，在高脂饮食（HFD）喂养前，两组之间的体重无显著差异。而在喂食HFD后的相同时间段内，模型组的体重显著高于对照组，自第13周起体重增加超过20%（图2A）。请注意，图2中的W0表示适应性喂养结束后的起始时间点，W14则代表不同饮食喂养持续14周的时间段。如图所示，在初次分组后的0W时，两组间体重无统计学意义上的差异（P = 0.7318）。然而，在14W时，模型组的体重显著高于正常组，差异具有统计学意义（P &lt; 0.0001），证实了模型建立成功（图2B）。我们主要以体重作为评估肥胖程度的标准。高脂血症和高血压...

本研究提供了一种可重复且标准化的方法，用于建立表现为单纯性肥胖（通常伴有脂肪性胰腺）的肥胖大鼠模型。同时包括胰腺组织取样和免疫组织化学的详细实验方案。

肥胖已成为全球主要的公共卫生问题，目前全球近一半人口被归类为超重或肥胖。一个关键的……

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Medicine

医学

建立典型脂肪胰腺肥胖大鼠模型的方法的开发和验证

本文描述了一种在大鼠中进行葡萄糖和脂肪乳剂慢性输注的实验方案。该模型可用于研究营养过剩对器官功能及生理参数的影响。...

大鼠慢性营养素输注模型

肥胖的发病率不断上升，并增加慢性肺部疾病的风险。为了阐明其潜在机制并制定预防策略，需要建立明确的动物模型。本文提供了三种方法（葡萄糖耐量试验、体容积描记法和肺组织固定）用于研究肥胖对小鼠肺部功能的影响。...

腹腔内葡萄糖耐量试验、肺功能测定及肺组织固定以研究肥胖与代谢障碍对肺部结局的影响

我们描述了一种利用高脂高蔗糖饮食建立兔饮食诱导代谢综合征（MetS）实验模型的方法。动物出现了中心性肥胖、轻度高血压、糖尿病前期状态和血脂异常，从而再现了人类MetS的主要组分。该慢性模型将有助于深入了解疾病进展的潜在机制。...

一种兔饮食诱导代谢综合征的实验模型：方法学考量、建立与评估

本文介绍了一种简单且可靠的非酒精性脂肪性肝炎（NASH）饮食诱导啮齿类动物模型，通过非SPF级动物饲养环境并给予特定高脂饮食实现。我们描述了在暴露于环境微生物的小鼠中鉴定肝脏和脂肪组织免疫细胞亚群的方法，以模拟人类的免疫学状态。...

一种与2型糖尿病相关的非酒精性脂肪性肝炎高级小鼠模型

本方案描述了使用一种适口性极高的西式自助饮食来建立啮齿类动物暴食和肥胖模型的方法。本文详细介绍了食物的选择、制备和测量步骤，并解释了有助于产生稳定且可重复表型的方法学因素。...

适口性西方风格自助饮食作为建立啮齿类动物饮食诱导肥胖模型的可靠方法

Roux-en-Y 胃旁路术（RYGB）用于治疗肥胖症和糖尿病。然而，RYGB 疗效的潜在机制尚未完全明确，且由于技术难度较高，动物模型研究常因高死亡率而受限。本文提供了在大鼠中实施 RYGB...

使用线性吻合器进行大鼠Roux-en-Y胃旁路术的操作方案

本文介绍了在饮食诱导肥胖的Sprague-Dawley大鼠模型中，高强度间歇训练（HIIT）方案的形态测量学反应及训练效果。该方案的目的是最大化运动强度，并确定瘦型和肥胖型大鼠对HIIT的生理反应。...

一种通过高强度间歇训练与饮食诱导肥胖的慢性模型以最大化大鼠运动努力并诱导生理变化

本方案概述了一种通过高脂饮食喂养联合链脲佐菌素注射诱导糖尿病心肌病的方法。该方法旨在为糖尿病心肌病的科学研究提供一个可靠的框架，并探索潜在的临床治疗应用途径。...

小鼠糖尿病心肌病模型的建立与评估

一个 离体 高脂饮食诱导脂肪组织炎症的小鼠模型

本视频展示了一种将人胰腺处理成多种储存格式的解剖操作流程。在整个胰腺各区域中均保持解剖学方向，以便明确不同区域的胰岛组成与密度。...

人类胰腺采集方案

了解建立典型脂肪胰腺肥胖大鼠模型的标准化方法，包括胰腺组织采样和免疫组织化学技术。该方案为肥胖机制研究提供了可重复的动物实验基础。

建立典型脂肪胰腺肥胖大鼠模型的方法学开发与验证

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