奈梅亨止血测定：单孔中同时进行凝血酶和血浆生成的荧光测量

我的研究重点是测量继发止血和纤溶作用，以测量整体止血平衡。目前大多数检测方法评估凝血或纤维蛋白溶解的孤立成分。该测定在一次检测中同时测量两个过程。

首先，打开荧光板读取器，使其平衡到37摄氏度。在软件中配置滤波器设置，将波长对数设置为两。将激发波长设置为凝血酶的355纳米，等离子体的激发波长为485纳米。

然后将发射波长设置为凝血酶的460纳米，等离子体的发射波长为525纳米。接下来，将板型设置为96孔Greiner平底黑色微板。导航到阅读区，使用每块板最多20孔定义板式布局。

通过将PMT增益设置为200伏，每次读数为六次，来配置PMT和光学设置。然后进入计时确认计时设置，总时长为一小时九分三十秒，间隔为30秒。在第一次读取前三秒内进入Shake确认摇晃。

进入“更多设置”，确保阅读顺序设置为列。通过将化合物转移次数设置为1，初始体积为120微升来配置读取前转移化合物。请确认移液器高度为130微升，体积为20微升，速率为每秒1微升，时间点为14秒。

在“化合物源”中，确认96孔复合板格式，特别选择Beckman 96 2.3毫升选项。通过选择正确的柱来确认移液器尖端布局设置。现在进入复合提示栏，选择正确的栏目。

将微板摇床温度设为37摄氏度，并在使用前验证温度。然后将震动强度设置为每分钟1,100转。接下来，将患者血浆和正常血浆在37摄氏度的水浴中解冻，浸泡最长10分钟。

彻底混合血浆样本，确认完全解冻且无可见的冷沉降。使用移液器，向预选的孔中加入80微升患者血浆或普通汇聚血浆，每个样本使用新的移液器尖端。然后将48微升头孢烷与48微升组织因子混合，制备底物混合物。

在此基础上加入240微升三氯化钠缓冲液，然后移液器注入96微升的凝血酶底物和48微升的血浆素底物。将20微升的底物混合物移入每个孔。之后握手。

现在将微板插入荧光板读取器，使其在37摄氏度下保持平衡几分钟。结合三氯化钠缓冲液、三氯化钙氯化钙缓冲液和组织纤溶酶原激活剂，制备起始试剂。彻底搅拌漩涡。

在化合物柱的所有行中移液起始试剂混合物。将装有起始试剂混合物的板放入源抽屉，开始荧光测量。每30秒记录一次荧光信号，持续70分钟。

在整个测量过程中，保持板材温度在37摄氏度。数据分析时，将动力学荧光数据导出为包含时间点和每井荧光值的表格。计算一阶导数，绘制每个孔的酶生成曲线，以可视化凝血酶或血浆素的生成随时间变化。

止血测定实现了同时、时间分辨的凝血酶和血浆素生成测量，从而综合评估凝血和纤溶作用。从凝血酶素生成曲线中可以推导出多个参数，包括滞后时间、峰值高度和凝血酶素电位。较长的滞后时间、较低的峰值高度和凝血酶电位降低表明凝血酶的生成受损。

等离子蛋白生成曲线还提供了多种参数，包括纤维蛋白裂解时间和血浆蛋白峰值高度。更短的纤维蛋白裂解时间和更高的峰值高度反映了血浆生成的增强。三名健康对照组及正常混合血浆的凝血酶和血浆生成曲线显示可重复的峰值高度结束时间，作为正常止血功能的参考档案。

在V因子活性为3%的患者中，凝血酶生成完全缺失。然而，等离子体的产生略有增加。V因子活性为44%的患者血栓生成减少，延迟较长，峰值高度降低，血浆生成仍处于正常范围内。

在α-2-抗溶素缺乏中，血浆生成随着α-2-抗溶素活性的降低而增加。活度为23%的纯合患者表现出血浆素生成早期、纤维蛋白溶解时间缩短及血浆峰值较高。这些变化在异合子患者中也观察到，活度为73%，但表现不明显。

止血方法非常适合研究罕见凝血因子缺乏、溶纤疾病及止血药物效应。主要挑战是技术标准化以及结果规范化，以提升不同房间和实验室间的可比性。未来工作可能聚焦于自动化检测并开发适应性，以适应全血或富板血浆。