Name: 奈梅亨止血测定：单孔中同时进行凝血酶和血浆生成的荧光测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-27T13:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 了解奈梅亨止血测定法，通过荧光底物在单孔中同时测量凝血酶和纤溶酶生成，用于评估凝血与纤溶平衡。该方法适用于研究凝血因子缺乏症、纤溶障碍及药物效应。

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本研究遵循欧洲血液网（EuroBloodNet）的目标开展。

所有涉及人血浆样本的操作均按照机构指南进行，并经阿纳姆-奈梅亨医学伦理委员会批准。在样本采集前，已从所有供体获得书面知情同意。
1. 缓冲液、试剂和血浆样本的制备
<ol>
	<li>配制缓冲液
	<ol>
		<li>称取 1.2 g Tris（分析纯），溶于 180 mL 0.9% NaCl 溶液中。</li>
		<li>用 HCl 调节 pH 至 7.4。</li>
		<li>用 0.9% NaCl 定容至 200 mL，得到 50 mM Tris-150 mM NaCl 缓冲液（TBS）。</li>
		<li>将 TBS 分装至两个 50 mL 离心管中。</li>
		<li>用剩余的 100 mL TBS 配制含钙缓冲液。将 7.34 g CaCl2·2H2O 溶于 100 mL TBS 中，得到 Tris-NaCl-CaCl2 缓冲液（TBS-Ca，pH 7.4）。</li>
		<li>将 TBS-Ca 分装至两个 50 mL 离心管中。</li>
		<li>将两种缓冲液均于 4 °C 保存，并在一周内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制荧光底物
	<ol>
		<li>将 53.2 mg 凝血酶底物（Bz-beta-Ala-Gly-Arg-AMC）溶于 4 mL Tris-NaCl 缓冲液中。 
		注：包装盒内附有分析证书说明书。加入的缓冲液体积取决于指定浓度，应调整至在 120 µL 试剂中加入 1 µL 人凝血酶后终浓度为 76 nmol/L。</li>
		<li>以每管 100 µL 分装至离心管中，于 −80 °C 保存。</li>
		<li>使用前于室温解冻凝血酶特异性荧光底物 10 分钟。涡旋混匀，并在实验过程中置于冰上保存。</li>
		<li>将一管纤溶酶底物（CBZ-L-Phe-Arg-rhodamine）内容物溶于 1,955 µL DMSO 中。 
		注：包装盒内附有分析证书说明书。加入的缓冲液体积取决于指定浓度，应调整至在 120 µL 试剂中加入 1 µL 人纤溶酶后终浓度为 200 nmol/L。</li>
		<li>以每管 60 µL 分装至离心管中，于 −80 °C 保存。</li>
		<li>使用前于室温解冻纤溶酶特异性荧光底物 10 分钟。涡旋混匀，并在实验过程中于室温保存。 
		注：该底物溶于二甲基亚砜（DMSO）中，不得冷却，以防沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制触发试剂
	<ol>
		<li>向冻干脑磷脂中加入 1 mL 蒸馏水进行重悬。充分涡旋至完全溶解。 
		注：脑磷脂重悬后提供磷脂，这是催化多种凝血反应所必需的，可在检测中实现生理相关的凝血过程。</li>
		<li>以每管 60 µL 分装至离心管中（足够用于 20 个孔），于 −20 °C 保存。</li>
		<li>使用前解冻一份分装样品，并置于冰上。移液前短暂涡旋。</li>
		<li>将一管重组人组织因子（TF）内容物溶于 4 mL 蒸馏水中。</li>
		<li>以每管 60 µL 分装至离心管中，于 −80 °C 保存。</li>
		<li>解冻一份 TF 分装样品，短暂涡旋。</li>
		<li>通过连续稀释法配制 1:500 的 TF 稀释液：
		<ol>
			<li>将 6 µL TF 加入 54 µL TBS 缓冲液中，涡旋混匀。</li>
			<li>取 6 µL 上述稀释液加入 54 µL TBS 中，涡旋混匀。</li>
			<li>取 20 µL 第二次稀释液加入 80 µL TBS 中，得到终浓度为 0.28 pM。涡旋混匀。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将一管（20 mg）组织型纤溶酶原激活物（tPA）内容物溶于 20 mL 蒸馏水中，得到终浓度为 580,000 IU/mL（需验证批次特异性浓度）。</li>
		<li>以每管 50 µL 分装至离心管中，于 −80 °C 保存。</li>
		<li>解冻一份 tPA 分装样品，短暂涡旋。</li>
		<li>通过将 20 µL tPA 加入 980 µL Tris-NaCl 缓冲液中，配制 1:50 的 tPA 稀释液，终浓度为 11,600 IU/mL。涡旋混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备血浆样本
	<ol>
		<li>将静脉血采集至含 3.2% 枸橼酸钠的 3 mL 枸橼酸抗凝管中，确保采集量至少为 2.7 mL（90% 填充量）。</li>
		<li>静脉穿刺后的第一管血不得使用，应弃去，以避免组织因子激活。</li>
		<li>采集后立即上下颠倒混匀至少 10 次。</li>
		<li>在 2 小时内于室温离心，先以 2,500 × g 离心 5 分钟，再以 10,000 × g 离心 10 分钟。</li>
		<li>使用一次性移液器从细胞层上方吸取血浆。</li>
		<li>将血浆分装至标记好的冻存管中，液氮速冻后于 −80 °C 保存。 
		注：确保样本无凝块。仅使用新鲜或单次解冻的血浆。一管 CTAD 血足够进行双份分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 仪器准备和软件设置
<ol>
	<li>准备荧光酶标仪
	<ol>
		<li>打开酶标仪，并使其平衡至 37 °C。</li>
		<li>设置以下基本参数：
		<ol>
			<li>Greiner 96 孔，平底，黑色。</li>
			<li>常规设置：定位延迟：0.1 s；动力学检测窗口数：1。</li>
			<li>动力学窗口：循环次数：140；测量起始时间：0.0 s；每孔每循环闪光次数：10；循环时间：30 s。</li>
			<li>光学模式：顶部光学检测</li>
			<li>滤光片设置：单色光数量：2。激发滤光片：凝血酶检测使用 355 nm；纤溶酶检测使用 485 nm。发射滤光片：凝血酶检测使用 460 nm；纤溶酶检测使用 520 nm。增益：600。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>定义实验布局，每块板最多使用 20 个孔。</li>
		<li>进入 浓度/体积/振荡 设置界面，确认以下参数：泵 1 = 20 µL；泵 2 = 0 µL；流速 = 420 µL/s。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备进样系统
	<ol>
		<li>取下进样针，并在装有缓冲液的容器中冲洗。</li>
		<li>将冲洗体积设为 2,500 µL，并用 37 °C 的 Tris/NaCl 缓冲液冲洗泵。</li>
		<li>将冲洗体积重置为 500 µL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 微孔板格式中的检测设置
<ol>
	<li>微量板振荡器设置
	<ol>
		<li>将微量板振荡器设置为 37 °C，并在使用前确认温度准确。</li>
		<li>将振荡强度设置为 1100 rpm。</li>
		<li>在检测的所有混合步骤中均使用此振荡器，以确保试剂分布均匀且酶活性一致。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向孔中添加试剂
	<ol>
		<li>将患者血浆和正常混合血浆（NPP）在 37 °C 水浴中解冻，时间不超过 10 分钟。</li>
		<li>充分混匀并确认完全解冻（无冷沉淀物）。</li>
		<li>向预选的孔中加入 80 µL 患者血浆或 NPP。每个样本使用新的移液器吸头。 
		注意：每次检测运行中均需包含一个 NPP 样本，以校正不同运行之间的变异（详见步骤 5.6）。</li>
		<li>加入 2 µL 脑磷脂。</li>
		<li>加入 2 µL 组织因子（1:500 稀释）。使用板振荡器短暂混匀。</li>
		<li>加入 10 µL Tris-NaCl 缓冲液。使用板振荡器短暂混匀。</li>
		<li>加入 4 µL 凝血酶底物。</li>
		<li>加入 2 µL 纤溶酶底物。使用板振荡器短暂混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预孵育
	<ol>
		<li>将微量板插入酶标仪中。</li>
		<li>让板在 37 °C 下平衡数分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 起始试剂的配制与注射
<ol>
	<li>准备泵1的试剂
	<ol>
		<li>将672 µL Tris/NaCl缓冲液、192 µL Tris/NaCl/CaCl₂缓冲液和96 µL tPA（来自步骤1.2.5）混合，充分涡旋振荡。</li>
		<li>在试剂管盖上打两个孔。</li>
		<li>将泵管从其中一个孔插入，直至管底。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动泵并开始检测
	<ol>
		<li>使用软件以500 µL试剂对泵进行预灌注。</li>
		<li>将进样针重新插入指定位置。</li>
		<li>立即开始荧光检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测的手动启动 
	注意：此手动启动程序可替代步骤2.2、4.1和4.2中描述的自动进样工作流程。
	<ol>
		<li>在使用前立即按照4.1.1所述方法配制起始试剂。</li>
		<li>从酶标仪中取出微孔板，使用校准过的单通道或多通道移液器快速向每孔手动加入20 µL起始试剂，以加快操作速度。</li>
		<li>立即将微孔板放回酶标仪，并立即开始荧光检测。 
		注意：尽量缩短加样与开始检测之间的时间（&lt;每行10秒），以减少实验变异性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动力学读数
	<ol>
		<li>每30秒记录一次荧光信号，持续70分钟。</li>
		<li>检测期间保持微孔板温度为37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>准备数据分析
	<ol>
		<li>将酶标仪的荧光动力学数据导出为表格形式，包含各孔的时间点和对应的荧光值。</li>
		<li>使用 Excel 或其他程序计算一阶导数，将原始荧光数据转换为酶生成曲线。</li>
		<li>绘制每个孔的酶生成曲线以可视化酶促反应。 
		注：这些曲线表示凝血酶或纤溶酶随时间的生成速率，对应图中所示的图形输出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析凝血酶生成曲线
	<ol>
		<li>从凝血酶生成曲线中识别以下参数（见 图1）：
		<ol>
			<li>延迟时间（Lag time）：凝血酶生成曲线开始持续上升并达到凝血酶峰值高度8%的时间点。</li>
			<li>凝血酶峰值高度：y轴上的最大信号值（即最大凝血酶生成速率）。</li>
			<li>凝血酶达峰时间（Thrombin Peak time）：从实验开始到达到凝血酶峰值高度的时间。</li>
			<li>凝血酶潜力（Thrombin potential，凝血酶生成曲线下面积）：从延迟时间开始至凝血酶信号恢复至基线水平之间的曲线下面积。 
			注：凝血酶潜力反映了样本在实验条件下总的凝血酶生成能力。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析纤溶酶生成曲线
	<ol>
		<li>从纤溶酶生成曲线中识别以下参数（见 图2）：
		<ol>
			<li>纤维蛋白溶解时间：从纤溶酶生成起始（即纤溶酶生成曲线开始持续上升并达到纤溶酶峰值高度8%的时间点）至达到纤溶酶峰值的时间。</li>
			<li>纤溶酶峰值高度：曲线上第一个明显的最大值，对应于纤溶酶生成的初始爆发期，该点定义为纤溶酶生成曲线的二阶导数（基于三分钟滑动平均）在纤溶酶生成起始后首次达到零的时刻。</li>
			<li>纤溶酶潜力（Plasmin potential，纤溶酶生成曲线下面积）：从纤溶酶生成起始至纤溶酶峰值时间之间的曲线下面积。 
			注：在初始纤溶酶峰值之后可能出现信号波动，这些波动不纳入纤溶酶生成参数的分析中。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手动或使用自定义软件提取参数
	<ol>
		<li>使用 Microsoft Excel、GraphPad Prism 或自定义脚本（例如 Python 或 R 编写的脚本）提取动力学参数。</li>
		<li>以结构化格式保存原始数据、绘制的曲线和计算得到的参数，用于归档和后续参考。 
		注：若使用宏程序，请在依赖自动输出前通过视觉检查和手动核对所有参数的准确性。我们的数据转换宏文件可根据要求提供。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标准化与归一化
	<ol>
		<li>通过平行测定40份健康供体样本以及用于归一化的正常混合血浆（NPP）样本，建立生理参考范围。每批 NPP 需执行一次此步骤。</li>
		<li>计算健康供体样本凝血酶和纤溶酶生成参数的平均值，并确定其与同批次实验中获得的 NPP 值的比值。</li>
		<li>对于每一批次中的每个患者样本，首先将其凝血酶或纤溶酶生成参数归一化为该批次中测得的 NPP 值。</li>
		<li>将上述结果除以该 NPP 批次先前建立的健康供体与 NPP 的比值（见步骤 5.6.2），从而得到相对于平均健康个体的相对值，并利用 NPP 对不同批次间的变异进行标准化。</li>
		<li>将参数值表示为相对于健康个体平均值的百分比（定义为100%），并据此呈现患者样本的结果。 
		注：每个患者样本的相对参数值按以下公式计算，其中 run a 指患者样本的检测批次，run b 指健康供体样本与同批 NPP 平行检测的参考批次。包含数据归一化计算的 Excel 文件可根据要求提供。 
		<img alt="相对值计算公式；患者样本分析分数形式；数学公式。" src="/files/ftp_upload/69701/69701eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1778558422000" data-alt="公式1"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 标准曲线的生成
<ol>
	<li>制备凝血酶标准曲线
	<ol>
		<li>根据制造商说明书中的指示，将冻干的人α-凝血酶溶解。 
		注意：例如，若说明书规定用100 µL水溶解以获得3.34 mg/mL浓度，则相当于100 µL中含有0.334 mg。</li>
		<li>用Tris/NaCl缓冲液将复溶后的凝血酶按1:10比例稀释。 
		注意：基于分子量为36,700 g/mol，此操作可得到约9.1 nmol/mL（0.0091 nmol/µL）的储备浓度。</li>
		<li>在Tris/NaCl缓冲液中配制一系列稀释液，使检测中最终凝血酶浓度范围为0至152 nmol/L。</li>
		<li>将凝血酶移液至已含有缓冲液的选定孔中，使每孔总体积达到100 µL。</li>
		<li>通过将300 µL Tris/NaCl缓冲液与200 µL来自步骤1.2.2的凝血酶底物混合，制备泵1的底物溶液。</li>
		<li>将400 µL上述混合液与360 µL Tris/NaCl缓冲液混合，进一步稀释该溶液。</li>
		<li>向每个校准孔中加入20 µL该底物混合液，使总检测体积达到120 µL。</li>
		<li>轻轻混匀微孔板并将其插入酶标仪。使用第2节所述相同的荧光设置运行动力学检测，共25个循环。</li>
		<li>导出原始荧光数据，并使用GraphPad Prism或等效软件确定每个凝血酶浓度下的初始斜率（每个循环荧光增加速率）。</li>
		<li>通过绘制初始斜率与凝血酶浓度的关系图生成标准曲线。 
		注意：确保所有缓冲液预热至37 °C，并将酶置于冰上操作。始终现配新鲜稀释液并充分混匀。所得标准曲线用于通过第5节所述宏程序计算未知样品中的相对凝血酶活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纤溶酶标准曲线的制备
	<ol>
		<li>根据制造商说明，用蒸馏水（例如0.543 mL）溶解冻干纤溶酶。 
		注意：纤溶酶的分子量为75,400 g/mol。假设1 mg溶于0.543 mL，则所得储备液浓度约为24.3 nmol/mL（0.024 nmol/µL）。</li>
		<li>在Tris/NaCl缓冲液中配制一系列稀释液，使检测中最终纤溶酶浓度范围为66至532 nmol/L。</li>
		<li>将纤溶酶移液至含有Tris/NaCl缓冲液的孔中，使每孔最终体积为100 µL。</li>
		<li>通过将680 µL Tris/NaCl缓冲液与80 µL来自步骤1.2.5的纤溶酶/罗丹明底物（如需，预先按1:1稀释）混合，制备泵1的底物溶液。</li>
		<li>向每个校准孔中加入20 µL该底物溶液，使总体积达到120 µL。</li>
		<li>轻轻混匀微孔板并将其插入酶标仪。使用第2节所述相同的荧光设置运行动力学检测，共25个循环。</li>
		<li>导出原始荧光数据，并使用GraphPad Prism或等效软件对动力学曲线的线性阶段进行线性回归分析，确定每个纤溶酶浓度下荧光增加的初始斜率。</li>
		<li>通过绘制初始斜率与纤溶酶浓度的关系图生成标准曲线。 
		注意：由于不同批次纤溶酶活性存在差异，每次使用新批次时均应重复校准。若观察到异常高的活性，建议在配制校准系列前对储备液进行1:2稀释。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用标准曲线进行定量
	<ol>
		<li>使用第6节生成的标准曲线将荧光斜率值转换为相对酶活性。</li>
		<li>仅使用标准曲线的线性部分对未知样品进行插值计算。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

W.L. van Heerde 是 Enzyre BV 的创始人及员工，同时也是 Enzyre 股东 Van Heerde Holding BV 的共同所有人。Enzyre 已从武田制药（Takeda）和诺和诺德（Novo Nordisk）获得合同研究资金。W.L. van Heerde 还曾获得瑞典奥克特制药公司（SOBI）和 CAF-DCF 提供的差旅资助。其余作者声明不存在竞争性财务利益。

Nijmegen止血检测（NHA）是一种双酶荧光检测法，可同时、实时地测量乏血小板血浆中凝血酶和纤溶酶的生成。通过在单个孔中捕获这两个过程，该方法有助于对继发性止血和纤溶过程进行高分辨率的动力学分析。这种双重读数相较于传统检测方法具有显著的方法学优势，已成功应用于凝血因子缺乏、纤溶亢进状态以及其他止血平衡紊乱疾病的研究。
NHA 的可靠性和可重复性取决于多个技术环节。这些环节包括准确的移液操作、试剂制备的一致性，以及在加入底物和激活剂后立即开始荧光检测。在整个检测过程中，将温度控制在 37 °C 对维持酶活性并确保获得有效的动力学读数至关重要。如先前在其他全局性检测中所证实的那样，标准化这些分析前变量并保持试剂操作的一致性，对于最大限度地减少技术变异极为关键34,35,36。此外，通过健康对照样本进行归一化处理，并使用混合正常血浆校正不同检测批次间的变异，可进一步提高不同实验批次及不同实验室之间的...

止血是凝血与纤溶之间动态平衡的结果。凝血酶和纤溶酶是驱动这两个过程的关键酶：凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，而纤溶酶则降解纤维蛋白以溶解血凝块。这种平衡的破坏可能导致出血或血栓事件1,2。然而，临床上用于评估止血功能的实验室检测通常仅关注凝血或纤溶的孤立步骤，难以全面反映整体的止血平衡状态。对于疑似有出血倾向的患者，常规筛查试验如凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（aPTT）常用于筛查凝血因子缺乏。然而，这些检测仅测量初始纤维蛋白形成所需的时间，无法捕捉到凝血启动后发生的、具有重要生理意义的凝血酶生成过程1,2,3。因此，在存在轻度凝血因子缺乏的患者中，这些检测结果可能仍显示正常3,4,5,6,7,8。为了识别这些特定的缺乏状态，需采用凝血因子活性检测。尽管这类检测对诊断具有参考价值，但其仅单独评估个别蛋白质，无法反映整体的止血平衡。因此，在轻度缺乏的患者中，凝血因子水平往往与出血表型的相关性较差9,10。这给临床风险评估以及患者管理的优化带来了困难，包括治疗时机与剂量的确定，以及对血栓或严重出血事件的干预措施。这些局限性凸显了对能够更全面、动态地反映止血过程的检测方法的需求，此类检测有望弥合实验室结果与临床表现之间的差距。
Nijmegen止血分析法（NHA）旨在克服上述局限性，通过在乏血小板血浆中实现凝血酶和纤溶酶生成的同步、时间分辨测量8,9。该方法采用两种具有不同激发和发射光谱的合成荧光底物，在同一微孔板孔中定量检测两种酶，且无交叉反应。酶生成曲线可用于推导出反映继发性凝血和纤溶动态过程的定量参数，包括滞后时间、凝血酶峰值高度、纤维蛋白溶解时间和纤溶酶峰值高度。与现有的凝血酶生成检测方法（如校准自动化凝血图谱法（CAT）、Ceveron s100和ST Genesia）相比，NHA具有多项优势，后者虽能提供有关凝血酶动态的重要信息，但无法评估纤溶活性10,11,12,13。而凝块溶解检测虽能反映部分纤溶过程，却缺乏关于凝血酶生成的信息14。这限制了其在评估决定整体止血平衡的复杂相互作用方面的应用价值。尽管一些实验室自建方法已将凝血酶和纤溶酶生成检测结合，但通常需要使用独立的孔或平行实验，从而限制了时间同步性和通量15。血栓弹力图（TEG）和旋转血栓弹力测定法（ROTEM）等全局性检测方法通过整合初级止血、继发性凝血和纤溶过程提供互补信息16,17。流动腔系统则代表了另一种正在发展中的实验性方法，可在流动条件下评估总体止血功能18。尽管这些全局性检测方法提供了更广泛的生理背景，但其对轻度出血性疾病的敏感性通常较低19,20,21。NHA通过在同一反应孔中同步测量凝血酶和纤溶酶的生成，将传统凝血酶生成分析（TGA）的高敏感性与全局检测方法的整体视角相结合，从而能够直接评估继发性止血、纤溶过程及其相互作用。
凝血酶生成检测在转化医学应用方面已展现出巨大潜力，例如用于个体化的出血和血栓风险评估以及治疗监测22,23,24,25。在临床研究中，NHA 已显示血友病 A、血友病 B 及罕见凝血因子缺乏症患者的凝血酶生成减少，同时在纤溶亢进状态（如 α2-抗纤溶酶缺乏症）中纤溶酶生成升高26,27,28,29。在低纤维蛋白原血症患者中，这两条通路的变化也已被观察到，该疾病与出血倾向及血栓风险增加均有关联。在此类人群中，较低的纤维蛋白原水平与纤溶酶生成减少相关，可能归因于纤溶酶原结合位点的缺失；而有血栓病史的患者则表现出凝血酶生成增加30。此外，该检测还能识别治疗药物的作用效果，包括抗凝剂、促凝剂和抗纤溶药物8。在先前的一项研究中，我们提出了一种标准化和归一化方法，以提高实验结果的可重复性，并实现不同实验批次和实验室间数据的比较，这是迈向临床应用的关键步骤28。本方案详细描述了 NHA 在临床研究或转化医学环境中实施所需的完整操作流程和分析方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙二水合物（CaCl₂·2H₂O）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;·2H₂O</td><td>默克</td><td>1.02382</td><td></td></tr><tr><td>脑磷脂（C.K. Prest 5 APTT 试剂盒）</td><td>Stago</td><td>00847</td><td>-20℃下可稳定保存6个月 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td></td><td></td><td>记录开启日期。首次开启后1天内使用。</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>默克</td><td>1.02950.0500</td><td></td></tr><tr><td>人α-凝血酶</td><td>酶学研究实验室</td><td>HT 1002a</td><td>盒内含有一份带有分析证书的小册子。所需添加的缓冲液体积取决于指定浓度，应调整至1 &amp;micro;添加的人凝血酶体积（L）为120 &amp;micro;L试剂产生的终浓度为76 nmol/L。</td></tr><tr><td>人血浆素</td><td>酶学研究实验室</td><td>HPlas</td><td>盒内含有一份带有分析证书的小册子。所需添加的缓冲液体积取决于指定浓度，应调整至1 &amp;micro;添加的人源纤溶酶的量为120 L &amp;micro;L试剂的结果为终浓度200 nmol/L。</td></tr><tr><td>正常混合血浆</td><td>内部制备</td><td>不适用</td><td>置于冰上可于解冻后保持稳定3小时。</td></tr><tr><td>患者血浆</td><td>不适用</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Plasmin 底物（CBZ-L-苯丙氨酰-L-精氨酸酰胺）-罗丹明-吗啉基脲</td><td>Symeres</td><td></td><td>在 -80 ℃ 下可稳定保存 6 个月 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>重组人组织因子（TF）：Innovin</td><td>Dade Behring</td><td>B4212</td><td>在 -80℃ 下可稳定保存 6 个月 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>重组组织型纤溶酶原激活剂（tPA）：阿替普酶/Actilyse</td><td>勃林格殷格翰</td><td></td><td>-80℃下可稳定保存12个月 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;NC(CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;OH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>默克</td><td>1.08382.2500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-NaCl 缓冲液，pH 7.4（TBS）</td><td>内部制备</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Tris-NaCl-CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 缓冲液，pH 7.4（TBS-Ca）</td><td>内部制备</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>Bz-β-Ala-Gly-Arg-7-氨基-4-甲基香豆素（凝血酶底物）</td><td>Symeres</td><td></td><td>在 -80 下可稳定保存 6 个月 &amp;deg;C.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluostar Optima 荧光计/酶标仪，配备温度控制和试剂注入器</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔微孔板，聚苯乙烯材质，平底，黑色，中等结合表面（相当于Microlon）</td><td>Greiner BIO-ONE</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>分析天平（上皿式天平）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓝色移液器吸头（适用于 100-1000 μL） &amp;micro;L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 mL 枸橼酸钠抗凝采血管（3.2% 枸橼酸钠）</td><td>BD Vacutainer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰桶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>制冰机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱/微孔板摇床</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型离心管架</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>可封闭微型离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 0.1-10 &amp;micro;L，非无菌</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器（2、10、20、100 和 1000） &amp;micro;L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>螺丝刀（用作探针）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>试管混匀器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>黄色移液器吸头（适用于 20-200 &amp;micro;L</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

奈梅亨止血检测：在单个孔中同时进行凝血酶和纤溶酶生成的荧光测定

The Nijmegen Hemostasis Assay: Simultaneous Fluorogenic Measurement of Thrombin and Plasmin Generation in a Single Well

凝血酶和纤溶酶在止血过程中均发挥核心作用，分别调控凝血和纤溶。传统的止血检测通常仅关注止血过程的孤立组分或有限阶段；例如，活化部分凝血活酶时间（APTT）和凝血酶原时间（PT）仅评估纤维蛋白形成的启动阶段，而凝血因子活性检测则用于评估单个凝血因子的功能。尽管这些检测具有重要价值，但它们无法全面反映继发性止血和纤溶随时间动态发展的整体过程。奈梅亨止血检测（Nijmegen Hemostasis Assay, NHA）通过在单个微孔板孔中实现凝血酶和纤溶酶生成的同步、时间分辨测量，弥补了这一局限。该检测采用两种具有不同激发和发射光谱且无交叉反应的合成荧光底物，可并行准确量化两种酶的活性。在乏血小板血浆中加入组织因子、钙离子和组织型纤溶酶原激活物以启动止血过程，并在37 °C条件下每30秒记录一次荧光信号，持续70分钟。通过校准标准品生成酶活性曲线，并从中提取滞后时间、凝血酶生成潜力、纤维蛋白溶解时间及纤溶酶峰值高度等参数。&#160;该检测能够可靠地同步捕捉凝血酶和纤溶酶的生成，具有良好的板内和板间重复性，并可检测肝素、活化蛋白C和ε-氨基己酸等效应物对凝血和纤溶的调节作用。在临床样本中，凝血因子缺乏患者的凝血酶生成显著降低，而纤溶障碍患者的纤溶酶生成谱则升高。通过整合凝血酶和纤溶酶生成的测量，NHA提供了超越传统检测的止血平衡全面视角。这种整合方法在科研与临床应用中具有广阔前景，可用于止血表型的表征、出血与血栓风险的评估，以及靶向治疗干预的监测。本方案阐述了NHA的操作流程，旨在增进对止血平衡的理解与评估。

使用奈梅亨止血分析法（NHA）获得的代表性凝血酶和纤溶酶生成曲线如图3所示。每条曲线的信号强度以相对于同批测定的正常混合血浆（NPP）样本的百分比表示。每次实验均包含一份含有NPP的样本，作为内部对照，用于验证检测的有效性并确保不同批次间的可比性。
图3A、B展示了来自三名健康对照者和正常混合血浆（NPP）的实验结果，显示出具有预期峰高和峰时的可重复凝血酶和纤溶酶曲线。这些曲线可作为正常止血功能的参考图谱，并表明检测性能良好。
图3C、D展示了V因子缺乏症患者的实验数据。纯合子患者（FV活性为3%）未检测到凝血酶生成，这与严重的促凝功能缺陷一致。由于凝血酶是凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）的重要激活剂，在此情况下预期纤溶酶的生成会增加31</su...

本方案描述了奈梅亨止血检测法，该方法能够同时、实时地测量凝血酶和纤溶酶的生成，从而对凝血和纤溶过程进行综合评估。该检测旨在超越传统止血检测的局限，进一步提升在科研和临床环境中对止血平衡状态的表征能力。

凝血酶和纤溶酶在止血过程中均发挥核心作用，分别调控凝血和纤溶。传统的止血检测方法通常……

我的研究重点是通过同时测量继发性止血和纤溶作用来评估整体止血平衡。目前大多数检测方法仅评估凝血或纤溶的孤立组分，而该检测方法可在一次实验中同时测量这两个过程。首先，打开荧光酶标仪，使其平衡至 37 摄氏度。在软件中配置滤光片设置，将波长对数量设为两对。凝血酶的激发波长设为 355 纳米，纤溶酶的激发波长设为 485 纳米。然后将发射波长设置为凝血酶 460 纳米，纤溶酶 525 纳米。接下来，将板类型设置为 96 孔 Greiner 平底黑板。进入读取区域，并使用每板最多 20 个孔定义板布局。通过将PMT增益设置为200伏特，每次读数闪光次数设置为六次，来配置PMT和光学参数。然后进入时间设置，确认总运行时间为1小时9分钟30秒，间隔时间为30秒。进入振荡设置，确认在第一次读数前有3秒的振荡。导航至更多设置，确保读取顺序设置为按列。在读取前配置化合物转移参数：将化合物转移次数设为1次，初始体积设为120 µL。检查确认移液高度为130 µL，体积为20 µL，速率为1 µL/s，时间点为14秒。在化合物来源中，确认选择 96 孔化合物板格式，并具体选择 Beckman 96 2.3 毫升选项。通过选择正确的列来确认移液器吸头布局设置。现在进入化合物吸头列，选择正确的列。将微孔板摇床温度设置为 37 摄氏度，并在使用前确认温度。然后将振荡强度设置为 1，即每分钟 100 转。接下来，在 37 摄氏度水浴中解冻患者血浆和正常混合血浆，时间不超过 10 分钟。充分混匀血浆样本，并确认已完全解冻，无可见的冷沉淀物。使用移液器，将80 µL患者血浆或正常混合血浆加入预先选定的孔中，每个样本使用新的移液器吸头。然后通过将48 µL脑磷脂与48 µL组织因子混合，制备底物混合液。向其中加入 240 微升三钠氯化物缓冲液，然后用移液器加入 96 微升凝血酶底物和 48 微升纤溶酶底物。再将 20 微升底物混合物移取至每个孔中。随后震荡。现在将微孔板插入荧光酶标仪中，并在37摄氏度下平衡数分钟。混合氯化钠三钠缓冲液、氯化钠三钠氯化钙缓冲液和组织型纤溶酶原激活剂，以配制起始试剂。充分涡旋混匀。将起始试剂混合物移液至化合物列的所有行中。将含有起始试剂混合物的板插入源板架，并开始荧光检测。每30秒记录一次荧光信号，持续70分钟。在整个检测过程中，将培养板保持在 37 摄氏度。进行数据分析时，将动力学荧光数据导出为表格，表格中包含每个孔的时间点及对应的荧光值。计算一阶导数，并绘制每个孔的酶生成曲线，以可视化凝血酶或纤溶酶随时间的生成情况。止血检测能够同时、实时地测量凝血酶和纤溶酶的生成，从而对凝血和纤溶过程进行整体评估。从凝血酶生成曲线中可获得多个参数，包括滞后时间、峰值高度和凝血酶潜在值。较长的滞后时间、较低的峰值高度以及降低的凝血酶潜在值表明凝血酶生成受损。纤溶酶生成曲线还可提供多个参数，包括纤维蛋白溶解时间以及纤溶酶峰值高度。较短的纤维蛋白溶解时间和较高的峰值高度反映了增强的血浆生成能力。来自三名健康对照者和正常混合血浆的凝血酶和血浆生成曲线显示出可重复的峰值高度及终点时间，可作为正常止血功能的参考曲线。因子V活性为3%的患者完全无法生成凝血酶，但血浆生成仅略有增加。因子V活性为44%的患者凝血酶生成减少，表现为延迟时间延长、峰值高度降低，而血浆生成仍处于正常范围内。在α-2-抗纤溶酶缺乏症中，随着α-2-抗纤溶酶活性的降低，血浆纤溶酶的生成增加。具有23%活性的纯合子患者表现出纤溶酶生成的早期启动、更短的纤维蛋白溶解时间以及更高的血浆峰值。在具有73%活性的杂合子患者中也观察到这些改变，但程度较轻。止血检测非常适用于研究罕见的凝血因子缺乏症、纤溶障碍以及止血药物的作用。主要挑战在于技术的标准化和结果的归一化，以提高不同实验环境和实验室之间的可比性。未来的研究可能集中在实现该检测的自动化，并开发适用于全血或富血小板血浆的改进方法。

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奈梅亨止血测定：单孔中同时进行凝血酶和血浆生成的荧光测量

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快速床旁检测全血中依诺肝素抗凝效果的分析方法

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一种基于荧光的体外检测方法用于测量细胞质膜修复效率

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微流控流动腔, 血小板输注, 止血, 血小板沉积, 纤维蛋白形成, 实时监测, 血栓形成, 凝血功能评估, 体外模型, 血液动力学

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微流控技术在血小板功能评估中的应用

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血栓特征分析检测：一种基于微流控技术的生物力学血栓形成全面表征平台

了解奈梅亨止血测定法，通过荧光底物在单孔中同时测量凝血酶和纤溶酶生成，用于评估凝血与纤溶平衡。该方法适用于研究凝血因子缺乏症、纤溶障碍及药物效应。

奈梅亨止血检测：在单个孔中同时进行凝血酶和纤溶酶生成的荧光测定

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