Name: 改进CAR T细胞中的CRISPR-Cas9筛选：文库制备的精细方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-02T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 了解CRISPR-Cas9筛选在CAR T细胞中的优化方法，通过酶切消化和选择性pulldown技术高效回收sgRNA，支持识别调控CAR T细胞功能的关键基因，为改进免疫治疗提供可靠方案。

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本研究由 MICIU/AEI /10.13039/501100011033 和 FEDER、欧盟资助的 PID2022-137914OB-I00 项目支持。本研究还得到卡洛斯三世健康研究所（Instituto de Salud Carlos III，ISCIII）通过先进疗法网络 TERAV 和 TERAV+（RD21/0017/0009 和 RD24/0014/0010）以及癌症生物医学研究中心网络 CIBERONC（CB16/12/00489）的支持。本研究同时获得纳瓦拉政府卫生部门（Gobierno de Navarra Salud，GN2023/08 和 GN2024/04）以及战略项目（DIAMANTE 0011-1411-2023-000105 和 0011-1411-2023-000074）的支持。图1B 和 图2A 使用 BioRender.com 制作。

本方案严格遵循纳瓦拉大学的指导原则进行。所有受试者均签署了书面知情同意书。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. T细胞的分离与激活
<ol>
	<li>外周血单个核细胞（PBMC）分离
	<ol>
		<li>使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管采集供体血液样本，转移至50 mL离心管中，并用PBS按1:1比例稀释血液样本。</li>
		<li>在50 mL离心管底部加入15 mL密度梯度介质（PBMC密度为1.07），然后小心地将25 mL稀释后的血液沿管壁缓慢加入密度梯度介质上方（使用移液器控制器最慢速度）。以800 × g 离心30分钟，不启用刹车。</li>
		<li>用巴斯德吸管收集位于密度梯度界面的PBMC环状层至另一50 mL离心管中，加入PBS至总体积50 mL进行洗涤。以650 × g 离心8分钟，弃去上清液。 
		注意：检查上清液是否澄清，确保无细胞残留。如有疑问，可将悬液分装至两倍数量的50 mL离心管中，每管加PBS至50 mL，再次离心。</li>
		<li>用50 mL PBS重悬细胞沉淀，使用吖啶橙-碘化丙啶（AOPI）染色在细胞计数仪中进行计数，随后以650 × g 离心8分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CD4和CD8磁珠分选
	<ol>
		<li>配制荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液：PBS中含2.5 µM EDTA和0.5% BSA，经0.2 µm滤膜过滤除菌。</li>
		<li>每10 × 106个细胞用80 µL无菌FACS缓冲液重悬，每10 × 106个细胞加入10 µL CD4微珠和10 µL CD8微珠。4 °C孵育20分钟。</li>
		<li>加入10 mL FACS缓冲液，以650 × g 离心8分钟，彻底弃去上清液。</li>
		<li>每1 × 108个细胞用500 µL FACS缓冲液重悬于15 mL离心管中。 
		注意：一次分选操作最多可处理200 × 106个细胞。</li>
		<li>使用AutoMacs（高速磁性细胞分选仪）的Possel程序进行分选。</li>
		<li>加入最多10 mL PBS，使用AOPI在荧光细胞计数仪中计数，随后以650 × g 离心8分钟。</li>
		<li>将细胞以1 × 106/mL密度重悬于T细胞生长培养基中，培养基含3%人&#160;血清（HS）、1%青霉素/链霉素（P/S）、625 IU/mL白细胞介素（IL）-7、85 IU/mL IL-15。每1 mL培养基中加入10 µL T细胞刺激试剂，充分混匀。每孔接种2 mL于24孔板（p24w）中，37 °C孵育24小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. CAR T 细胞制备与 CRISPR 筛选
<ol>
	<li>文库离心感染与CAR转导
	<ol>
		<li>根据滴定实验确定的相应量，加入慢病毒CRISPR文库（例如Brunello激酶组1文库，参见补充表1）以及8 µg/mL聚凝胺。</li>
		<li>在32 °C下以700 xg离心1小时30分钟进行离心感染。</li>
		<li>更换为新鲜T细胞生长培养基，其中含3%人血清（HS）、1%青霉素-链霉素（P/S）、625 IU/mL IL-7、85 IU/mL IL-15（终浓度[细胞]= 106 个细胞/mL）。</li>
		<li>6小时后，加入相应量的CAR慢病毒载体，使感染复数（MOI）为3，并继续培养4天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cas9电穿孔
	<ol>
		<li>收集CAR T细胞，用PBS洗涤一次，并使用AOPI在荧光细胞计数仪中计数细胞。</li>
		<li>在电穿孔缓冲液中配制4 µM Cas9。</li>
		<li>将CAR T细胞重悬于每5 × 106&#160;细胞50 µL缓冲液中。混匀后小心地将50 µL细胞悬液加入多孔电穿孔板条的每个孔中，避免产生气泡。然后用移液器吸头去除任何可能的气泡，并沿孔边缘轻轻划过。 
		注意：若电穿孔板条中某一孔未加样品，需加入等体积的电穿孔缓冲液。此步骤至关重要：若仪器检测到气泡或体积差异，将报错。</li>
		<li>使用程序EXPAND T CELL 3 对CAR T细胞进行核转染。</li>
		<li>将细胞留在电穿孔杯中，于37 °C培养箱中静置40分钟。</li>
		<li>将转染后的细胞重悬于含3% HS、1% P/S、625 IU/mL IL-7、85 IU/mL IL-15的T细胞生长培养基中（终浓度[细胞]= 106 个细胞/mL），并在37 °C继续培养3天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>嘌呤霉素筛选
	<ol>
		<li>使用AOPI在荧光细胞计数仪中计数细胞。</li>
		<li>用含IL-7和IL-15的T细胞生长培养基调整细胞密度至1 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>向培养基中加入嘌呤霉素（2.5 µg/mL）。</li>
		<li>每2天计数一次细胞，持续6天，并用含3% HS、1% P/S、625 IU/mL IL-7、85 IU/mL IL-15及2.5 µg/mL嘌呤霉素的细胞生长培养基调整细胞密度至1 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>检测CAR阳性细胞百分比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分选CAR T细胞群体，并将样品（干燥细胞沉淀）于-80 °C保存。</li>
</ol>
3. 基因组DNA的提取
注意：在整个过程中避免任何细胞或基因组DNA（gDNA）的损失，因为这可能会影响sgRNA的代表性。目标是实现至少500倍的sgRNA覆盖深度。
<ol>
	<li>使用细胞和组织DNA提取试剂盒从样品中提取基因组DNA（gDNA）。进行两次洗脱以最大化gDNA回收率。 
	注意：为更高效地回收gDNA，每列中使用的细胞数量不得超过4 × 106个。</li>
	<li>使用双链DNA（dsDNA）定量试剂盒测定gDNA浓度。 
	注意：如果浓度过低，无法满足后续实验步骤的要求，可使用固相可逆固定（SPRI）磁珠纯化试剂对DNA进行浓缩。</li>
</ol>
4. sgRNA片段的富集（及基因组DNA残留的去除）
<ol>
	<li>限制性内切酶消化
	<ol>
		<li>在总体积为 50 µL 的反应体系中，使用最多 5 µg gDNA 和 20 U 的限制性内切酶（例如，针对 Brunello Kinome 1 文库的 lentiGuide-puro 载体骨架，可使用 NdeI 和 PspXI 的组合）进行消化。根据需要扩增反应数量，以获得理想的 sgRNA 代表性。 
		&#8203;注意：应选择在表达盒侧翼区域切割的限制性内切酶，但需注意部分 sgRNA 序列中可能含有该酶切位点。这些 sgRNA 将在此步骤中丢失，且不会在后续测序中检出。此类向导RNA的缺失可作为酶切效率的对照。 补充表 1 列出了可被 PspXI 和 NdeI 切割的 Kinome 1 sgRNA 列表。</li>
		<li>在热循环仪中于 37 °C 过夜孵育。</li>
		<li>进行两次 SPRI 纯化。
		<ol>
			<li>准备 10 mL 洗脱缓冲液（EB）&#160;（10 mM Tris-HCl，pH 8.0）和 50 mL 新配制的 70% 乙醇。</li>
			<li>充分涡旋磁珠，取 100 µL 加入酶切产物中。</li>
			<li>通过移液充分混匀，孵育 5 分钟，随后置于磁力架上静置 5 分钟。</li>
			<li>保持在磁力架上，加入 200 µL 70% 乙醇，避免扰动沉淀，等待 30 秒后弃去上清液。</li>
			<li>重复步骤 4.1.3.3，共洗涤两次。让磁珠干燥 2 分钟。</li>
			<li>从磁力架上取下，加入 40 µL 洗脱缓冲液，通过移液重悬磁珠，孵育 2 分钟。</li>
			<li>置于磁力架上 2 分钟，将上清液转移至新管。 
			注意：首次建立本实验流程时，应通过（毛细管）电泳验证酶切效果，确保观察到弥散条带。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>sgRNA 表达盒的富集。
	<ol>
		<li>链霉亲和素磁珠的准备。
		<ol>
			<li>配制 2× 洗涤/结合缓冲液：10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、2 M NaCl、1 mM EDTA。取其一半体积，用 H2O 稀释至 1×。</li>
			<li>涡旋磁珠 1 分钟。</li>
			<li>取所需体积的磁珠转移至离心管中（通常 1 mg 即可），加入等体积的 1× 洗涤/结合缓冲液，或至少 1 mL，并重悬。</li>
			<li>将离心管置于磁力架上 1 分钟，弃去上清液。</li>
			<li>从磁力架上取下，用与初始取用磁珠体积相等的 1× 洗涤/结合缓冲液重悬已洗涤的磁珠。</li>
			<li>重复上述步骤，共洗涤 3 次。</li>
			<li>用 2× 洗涤/结合缓冲液重悬磁珠。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向步骤 4.1.3.6 所得纯化后的酶切产物中加入 5 µL 浓度为 10 µM 的富集引物（见 表 1）。</li>
		<li>在干式加热器中 96 °C 孵育 5 分钟，立即置于冰上冷却 5 分钟。</li>
		<li>加入 1 mg 预先洗涤过的链霉亲和素磁珠。 
		注意：生物素-链霉亲和素结合在 1 M NaCl 条件下效果最佳。确保磁珠与生物素化 DNA 的体积相等并充分混匀&#160;。</li>
		<li>孵育 20 分钟，期间每 4 分钟轻柔重悬混合物一次。</li>
		<li>置于磁力架上 5 分钟。</li>
		<li>用 1× 洗涤/结合缓冲液洗涤磁珠 3 次。</li>
		<li>用 50 µL EB 8.0 重悬磁珠。 
		注意：此处的 sgRNA 表达盒已结合在链霉亲和素磁珠上，切勿丢弃。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. sgRNA 文库制备
<ol>
	<li>PCR1
	<ol>
		<li>用20制备PCR1混合液 &#181;L Herculase 5x 缓冲液，1 &#181;L dNTP（100 mM），1 &#181;L DNA聚合酶，2.5 &#181;10 升 &#181;PCR1 正向与反向引物所列的 M 表1，和23 &#181;L 的 PCR 级水。用移液器混匀，并将 PCR1 混合液加入步骤 4.2.8 中的磁珠中。 
		注意： 表 1 列出为 Brunello Kinome Library 1 设计的 PCR1 引物。</li>
		<li>将试管放入热循环仪中，并运行PCR1程序，具体参数见下文描述 表 2. 
		注意：确保热循环仪能够容纳 100 &#181;L 反应。否则，分装至 50 &#181;L 反应。根据需要调整规模。</li>
		<li>将来自同一样本的所有PCR1产物合并至同一管中。</li>
		<li>使用150进行SPRI纯化PCR1 &#181;L（1.5倍体积）磁珠（按步骤4.1.3.3–4.1.3.7操作）。将每份PCR反应物重悬于100 &#181;L of EB 8.0 
		注意：如果首次建立本方案，可通过取2 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以验证PCR产物的大小和质量。 &#181;在毛细管电泳系统（例如 Agilent 的 TapeStation 系统）中检测 30 个 PCR 循环产物的 L。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR2
	<ol>
		<li>用10准备PCR2混合液 &#181;PCR1 产物的 L，10 &#181;升 5× 缓冲液，0.5 &#181;L dNTP（100 mM），1 &#181;L DNA聚合酶，1.25 &#181;10升 &#181;M PCR2 引物，正向与反向列于 表1 （为每个样本使用不同的 rP7-i7-BC 和 P5-i5-BC 组合），以及 26 &#181;L 的 PCR 级水，总体积为 50 &#181;L. 
		注意：为保持文库的代表性，每104 文库中的构建体。</li>
		<li>将试管放入热循环仪中，并运行PCR2程序，具体步骤见文中描述 表 2.</li>
		<li>SPRI 纯化 PCR2&#160;使用 75 &#181;L（1.5 倍体积）磁珠（按步骤 4.1.3.3–4.1.3.7 操作）。将每份 PCR 反应产物重悬于 50 &#181;L of EB 8.0</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定量 PCR2（即., 使用双链DNA定量试剂盒对sgRNA文库进行定量，并通过毛细管电泳（如TapeStation系统）验证扩增片段大小。合并样品。</li>
	<li>在Illumina仪器上进行测序。 
	注意：对于此处的3052条sgRNA Brunello激酶组1文库，每个样本通常需要100亿至200亿次测序读长的测序深度。</li>
</ol>
6. 分析
<ol>
	<li>使用 bcl2fastq 对样本进行解复用。</li>
	<li>使用 FastQC 检查生成的 fastq 文件的质量。</li>
	<li>以 sgRNA 两侧的载体序列以及向导序列长度（20 nt）为模式，提取 sgRNA 的序列。</li>
	<li>使用 Bowtie2 将提取的序列比对至文库参考序列，以检查假设的向导序列中有多少是文库中的真实 sgRNA。使用 samtools 将包含比对信息的 SAM 文件转换为 BAM 格式，并生成汇总文件。</li>
	<li>使用 MAGeCK 软件中的 count 函数，对编辑样本和对照样本中每个 sgRNA 的读段数进行计数和标准化。</li>
	<li>使用 MAGeCK 的 test 函数比较计数值，获得 RRA 评分及候选基因列表。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突。

CRISPR筛选依赖于单导向扰动原理，即每个细胞中应仅整合一条sgRNA。为实现这一点，sgRNA通常通过慢病毒载体递送，且感染复数（MOI）必须严格控制。MOI应为 约 0.3 通常为推荐值，可使 25% 至 30% 的细胞被单个病毒颗粒转导6因此，准确的滴定对于确定所需病毒颗粒体积至关重要。另一个关键步骤是实验过程中单导向RNA（sgRNA）覆盖度的丢失。细胞收获过程中的细胞损失、基因组DNA（gDNA）提取效率低下（如柱过载或DNA洗脱不完全）以及PCR扩增时模板过量，均可能导致sgRNA覆盖度下降，从而影响sgRNA分析结果的准确性。关于生物素标记的寡核苷酸，建议采用高效液相色谱（HPLC）纯化，以避免合成过程中残留的游离生物素饱和链霉亲和素磁珠。此外，强烈建议在寡核苷酸3'端引入氨基修饰，以防止后续PCR中生物素化引物的非特异性扩增。在设计这些寡核苷酸时，应避免其序列与PCR1引物发生重叠，以防扩增过程中产生竞争。此外，生物信息学分析需格外谨慎：sgRNA提取模式依赖于质粒骨架（如lentiGuide-puro或lentiCRISPR v2），比对严格性可从完全匹配到允许一定错配容忍度不等。另外，由于本方案包含酶切步骤，部分含有限制性酶切位点的sgRNA可能丢失，需相应调整参考文库。
本研究提出了一种优化的CRISPR筛选文库制备方案，通过酶切，更重要的是通过富集步骤，富集含有sgRNA的片段。此前已有研究建议使用限制性内切酶消化来减少基因组DNA（gDNA）投入量并富集sgRNA表达盒27。类似地，生物素标记的探针已在分子生物学中被广泛用于捕获特定核酸或蛋白质-核酸复合物28,29,30,31。
本方案基于这些原则，并将其改进应用于原代CAR T细胞中的CRISPR筛选，但需承认存在若干局限性。首先，原代CAR T细胞对筛选规模存在限制，因其扩增能力有限。为维持足够的覆盖深度和sgRNA代表性，需要大量起始细胞。当此条件不可行时，可使用较小的定制文库12，但这会降低遗传筛选的广度。生物学变异性是另一项挑战；不同供体之间的差异不可避免，且显著筛选结果的重叠程度通常较低17。其次，富集策略依赖于限制性内切酶切割位点的存在及其位置。在极少数情况下，这些位点可能出现在sgRNA序列内部，对于冗余度较低的小型文库而言，这一问题更为突出。然而，大多数文库（尤其是全基因组设计的文库）针对每个靶点包含多个sgRNA，从而最大限度地降低了向导序列丢失的整体影响。最后，在限制性内切酶消化不适用的情况下，基于片段化的替代富集策略（如超声破碎联合探针捕获24）可能提供一定的灵活性。
总体而言，在CRISPR编辑的细胞中，sgRNA片段仅占总基因组DNA的极小部分，因此高效的富集对于成功的文库构建至关重要。与标准方案相比，我们优化的工作流程减少了基因组DNA（gDNA）的残留，并更有利于目标sgRNA的PCR扩增。尽管将gDNA片段化与生物素标记探针结合链霉亲和素磁珠进行富集的技术在概念上并非全新，但将其整合到CRISPR筛选中可避免常见的PCR偏差，提高CRISPR筛选的可重复性。此外，在每个关键步骤引入标准化的质量控制指标（例如分选后T细胞纯度、嘌呤霉素抗性细胞比例、gDNA完整性以及CAR转导效率），将进一步增强该工作流程的稳健性和可重复性。总之，尽管该方案是在原代CAR T细胞背景下开发的，且仅使用了两位供体（尽管每位供体使用了多个样本，这可能仍存在一定局限性），但此优化后的实验流程可能广泛适用于其他CRISPR筛选及存在大量gDNA残留的NGS工作流程。

免疫疗法彻底改变了癌症治疗，提供了利用和调节免疫系统的新策略。其中，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已成为最具变革性的方法之一。该疗法涉及对患者T细胞的基因工程改造 离体 通过设计用于识别特定肿瘤抗原的合成受体，从而增强抗肿瘤活性1CAR T细胞在血液系统恶性肿瘤中已显示出显著疗效，接受靶向CD19或BCMA治疗的患者中，疗效范围从短暂缓解到长期无病生存，且毒性反应轻微。2迄今为止，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准七种CAR T细胞产品用于血液系统肿瘤的治疗3尽管取得了这些进展，仍存在显著的局限性。问题可能源于CAR T细胞产品本身，通常受到制备工艺或患者T细胞功能状态的影响，而后者可能因疾病进展、既往治疗或年龄因素而受损。肿瘤内在的耐药机制，例如抗原下调，也可能削弱治疗效果。4此外，免疫抑制性的肿瘤微环境构成了另一重障碍，严重限制了CAR T细胞的存续时间与功能，尤其是在实体瘤患者中。5因此，迫切需要提高CAR T细胞疗法的初始疗效和长期有效性。
CRISPR-Cas9 基因编辑技术的出现，为通过大规模筛选方法解析基因功能提供了强有力的工具。在这些实验中，细胞被转导单导向 RNA（sgRNA）文库，通常由慢病毒载体递送，确保每个细胞仅含一个 sgRNA 并实现稳定的基因组整合。在 Cas9 介导的编辑及转导细胞筛选完成后，提取基因组 DNA（gDNA），并通过 PCR 扩增 sgRNA 串联序列以构建文库。随后的高通量测序可定量分析不同表型中 sgRNA 的分布情况，从而鉴定出对所研究过程起正向或负向调控作用的基因6。
CRISPR筛选已被广泛应用于探索T细胞生物学，最近还被用于增强CAR T细胞的功能。全基因组筛选已鉴定出调控T细胞基本过程的因子，包括活化、增殖和分化。例如，FAM49B被鉴定为T细胞受体信号通路的调控因子7，而SOCS1、TCEB2、RASA2和CBLB被证明在刺激后对增殖至关重要8。除了这些核心通路外，CRISPR筛选还揭示了参与T细胞记忆和耗竭的基因。体内研究发现Fli1是一个可增强效应反应但不破坏记忆或耗竭前体的候选因子9，而染色质重塑因子Arid1a的缺失可减少T细胞耗竭10。利用该方法还表征了调控辅助性T细胞2型（Th2）分化的因子11。通过使用靶向25种激酶的定制sgRNA文库，发现p38可促进扩增、记忆形成以及对氧化应激和基因组应激的防护12。类似地，在CD8+ T细胞中敲除REGNASE-1可赋予其长效效应表型，从而在黑色素瘤和白血病模型中改善肿瘤控制13。其他全基因组筛选鉴定出Dhx37为调控T细胞活化和细胞毒性的因子14，同时验证了LTBR及其他基因在CAR T细胞和γδ T细胞中作为T细胞功能增强因子的作用15。最近，CRISPR筛选已直接应用于CAR T细胞，揭示了新的靶点，例如PRODH2——一种参与脯氨酸代谢并增强CAR T抗肿瘤活性的酶16，以及TLE4和IKZF2，其失活在胶质母细胞瘤模型中提高了CAR T的疗效17。
CRISPR 筛选中的一个关键步骤是从极大量的基因组 DNA（gDNA）中精确地选择性扩增 sgRNA 表达盒，这一挑战在 CRISPR 筛选实验中因使用大量细胞而难以避免。从如此大量的 DNA 中进行 PCR 扩增会带来多项技术难题，包括分子拥挤效应限制了 DNA 和聚合酶分子的物理扩散、引物与聚合酶在基因组 DNA 背景上的瞬时非特异性结合、非靶标扩增导致引物耗竭，以及 DNA 磷酸骨架对 Mg2+ 的螯合作用等其他问题18,19,20,21。这些问题常导致 PCR 失败和/或扩增偏差。为缓解上述问题，已提出多种策略，包括将 sgRNA 扩增与接头添加分为两个独立的 PCR 步骤22，使用生物素标记的寡核苷酸进行靶标富集并结合磁珠捕获23,24，或设计在 sgRNA 表达盒两侧含有限制性酶切位点的质粒以实现片段富集25。
本研究中，我们介绍了一种针对原代人源CAR T细胞优化的CRISPR-Cas9基因敲除筛选方案。所使用的CRISPR文库为Brunello Kinome 1，该文库包含3052条独特的20nt长度的sgRNA，靶向763个人类激酶基因（每个靶点4条sgRNA）。T细胞通过磁珠阳性分选法从健康供体血液样本中富集的外周血单个核细胞（PBMC）组分中分离获得，分选标记为CD4+和CD8+。经抗CD3和抗CD28抗体激活后，T细胞通过离心转导（spinfected）方式导入CRISPR筛选文库，随后转导CAR慢病毒。细胞扩增后，通过核转染（nucleofection）方式导入Cas9蛋白。携带CRISPR的细胞使用嘌呤霉素进行筛选，并分选获得CAR阳性的T细胞。提取基因组DNA后，使用限制性内切酶（RE）进行消化，含有sgRNA的片段通过生物素探针-链霉亲和素捕获法富集。随后，通过两轮连续PCR选择性扩增并添加索引，对所得文库进行测序。通过引入中间步骤以减少基因组DNA残留，我们能够选择性地回收并扩增目标sgRNA，从而研究激酶在CAR T细胞中的功能作用。

<table><tbody><tr><td>4200 TapeStation</td><td>Agilent</td><td>G2991A</td><td></td></tr><tr><td>吖啶橙</td><td>Invitrogen</td><td>A1301</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS NEO 分离仪</td><td>Miltenyi</td><td>130-120-327</td><td>高速磁性细胞分选仪</td></tr><tr><td>生物素化寡核苷酸</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer K2 荧光细胞计数仪</td><td>Revvity</td><td>CMT-K2-MX-150</td><td>荧光细胞计数仪</td></tr><tr><td>CHT4 计数室</td><td>Revvity</td><td>CHT4-SD100-002</td><td></td></tr><tr><td>CytoSinct CD4 纳米磁珠</td><td>GenScript</td><td>L00863-1</td><td></td></tr><tr><td>CytoSinct CD8 纳米磁珠</td><td>GenScript</td><td>L00864-1</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Agilent</td><td>200418-51</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 链霉亲和素磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>11206D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>1,00,98,31,000</td><td></td></tr><tr><td>ExPERT Atx 电穿孔仪</td><td>MaxCyte</td><td>ExPERT ATx</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Cytiva</td><td>17544203</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2 &amp;micro;m</td><td>Sarstedt</td><td>83,18,26,001</td><td></td></tr><tr><td>GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-Research</td><td>GenScript</td><td>Z03621-1</td><td></td></tr><tr><td>Herculase Buffer 5X</td><td>Agilent</td><td>600675-52</td><td>5X 缓冲液</td></tr><tr><td>Herculase II 融合酶</td><td>Agilent</td><td>600679-51</td><td>DNA 聚合酶</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-765</td><td></td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-362</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler X50a</td><td>Eppendorf</td><td>6313HG006059</td><td></td></tr><tr><td>MaxCyte 电穿孔缓冲液</td><td>Cytiva</td><td>EPB1</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin 组织提取试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>74,09,52,250</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Merck</td><td>TR-1003-6</td><td></td></tr><tr><td>引物</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>PspXI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0656S</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 荧光计</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit HS DNA 检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>R-50x3 无菌孔板处理组件</td><td>MaxCyte</td><td>LM243882</td><td></td></tr><tr><td>T Cell TransAct 人源</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-160</td><td>T 细胞刺激试剂</td></tr><tr><td>Tape Station HSD1000</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>TEXMACS</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-196</td><td>T 细胞生长培养基</td></tr><tr><td>Tris 缓冲液，1.0 M，pH 8.0，分子生物学级</td><td>EMD Milipore</td><td>648314</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水，无 DNA 酶、RNA 酶和蛋白酶</td><td>ThermoScientific</td><td>327390010</td><td></td></tr></tbody></table>

改进car t细胞中crispr-cas9筛选：一种优化的文库构建方法

Improving CRISPR-Cas9 Screens in CAR T Cells: A Refined Method for Library Preparation

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在多种血液系统恶性肿瘤中已显示出显著疗效，但在实体瘤中的应用尚未取得同等成功。此外，即使在血液系统肿瘤中，CAR T细胞输注后仍存在复发问题，影响长期治疗效果。这些挑战凸显了迫切需要开发能够增强CAR T细胞疗效、持久性，并克服肿瘤及其微环境介导的耐药性的策略。基于成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9的筛选平台为系统性鉴定调控CAR T细胞功能的基因提供了有力手段。通过将遗传扰动与表型结果相联系，这类检测方法能够发现调控T细胞活化、增殖、记忆形成及细胞毒性的关键通路。标准操作流程通常包括：使用单导向RNA（sgRNA）文库转导大量细胞、Cas9介导的基因编辑、筛选已编辑细胞，以及在测序前从基因组DNA（gDNA）中通过PCR扩增sgRNA片段。然而，使用大量gDNA进行PCR扩增面临显著技术挑战，常常难以选择性地有效扩增和回收sgRNA。本文中，我们描述了一种经过优化的CRISPR-Cas9基因敲除筛选方案，并已在原代人源CAR T细胞中进行了验证。该方法在sgRNA文库制备过程中引入了一个中间步骤，通过酶消化和对sgRNA片段的选择性富集，减少gDNA残留，从而提高首轮PCR扩增的效率。这一改进使我们能够在CAR T细胞筛选实验中成功回收sgRNA信息，而此前采用传统的一步法和两步法PCR扩增方案均未能实现。综上所述，该优化的工作流程有助于在具有挑战性的样本中完成CRISPR筛选文库的制备，推动识别可用于提升治疗效果的关键遗传决定因素。

如方案部分所述，CAR T细胞的制备遵循我们既定的方案26。对于CRISPR筛选，我们采用了Wang等人17开发的工作流程（图1A）。简言之，分别从两位独立供体中分离T细胞并激活24小时，随后依次转导CRISPR sgRNA文库和CAR慢病毒载体，在第5天时CAR阳性细胞比例分别达到67%和72%。部分细胞通过核转染导入Cas9蛋白以诱导基因敲除，其余细胞则作为sgRNA表达水平的基线对照。转导后的细胞通过抗生素筛选，并根据所研究的表型对不同细胞群进行分选。在整个筛选过程中，通过基于AOPI的细胞计数监测CAR T细胞的增殖情况，并以倍数变化表示（图1B）。在第8、10和12天加入嘌呤霉素后，我们证实了两位供体中转导了CRISPR文库的CAR T细胞均成功富集，表现为持续存活和增殖。未转导T细胞（UTD）以及未转导CRISPR文库的CAR T细胞作为抗生素筛选的对照。
基因组DNA提取后，通过PCR扩增制备sgRNA文库。为解决gDNA过度残留带来的问题，我们采用了一种结合限制性内切酶消化和sgRNA片段的生物素-链霉亲和素富集的方案（图2A，B）。使用限制性内切酶NdeI和PspXI对gDNA进行消化，这两种酶的识别位点位于sgRNA片段两侧（图2C）。设计了可结合在PCR1引物结合位点上游的生物素标记寡核苷酸，用于捕获包含sgRNA的片段，随后通过链霉亲和素磁珠进行富集，以去除残留的gDNA。随后选择性扩增含有sgRNA的片段（图2D），并通过两轮连续PCR进行加标签（indexing）。
使用下一代测序技术（NGS）对每个样本的文库进行测序。在完成去卷积、质量控制和sgRNA鉴定后，利用MAGeCK分析流程对数据进行分析。首先，通过count命令对对照组（基础状态）和Cas9编辑样本中的sgRNA读数进行量化和标准化（图3A、B）。Pearson和Spearman相关性分析表明，在实验过程中sgRNA的代表性在供体基因组DNA中得以保持，与质粒文库相比具有良好的一致性（图3C）。接着，使用test命令比较两种条件，为每个基因分配稳健秩聚合（RRA）评分（图3D）。采用显著性阈值p &lt; 0.05 和对数倍数变化（LFC）&gt; 0.5 来识别显著富集或耗竭的基因（图3E）。最后，利用Metascape对候选基因进行通路富集分析，揭示与所鉴定调控因子相关的主要基因本体（Gene Ontology）术语（图3F）。
<img alt="CRISPR 基因编辑流程图、T 细胞修饰时间线、表型变异图、倍数变化图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69721/69721fig1.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="图 1"> 
图 1：CAR T 细胞中的 CRISPR 筛选。（A）CAR T 细胞中 CRISPR 筛选的示意图。（B）使用嘌呤霉素（P）筛选转导细胞。质粒文库包含嘌呤霉素抗性基因用于阳性筛选。在第 8 天向未转导（UTD）样本、CAR T 细胞以及转导的 CAR T 细胞培养基中加入抗生素。未添加嘌呤霉素的样本用作增殖对照。数据显示了两个独立供体的结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69721/69721fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑过程；A：消化→下拉→PCR，B：gRNA 示意图，C/D：电泳结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69721/69721fig2.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于 sgRNA 富集分析的文库制备。（A）文库制备流程示意图。（B）限制性内切酶切割位点（剪刀图标）与 PCR1 引物（箭头）及生物素化引物（带绿色圆点的箭头）结合区域相对位置的示意图。（C）基因组 DNA 在限制性内切酶消化前后的电泳结果。（D）PCR1 后 sgRNA 盒式结构的特异性富集。结果显示了两种表型的基底样本和 Cas9 样本中两个独立供体的数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69721/69721fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达比较分析：表格、图表、相关性图、对数倍数变化、显著性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69721/69721fig3.jpg" data-altupdatedat="1780372819000" data-alt="图 3"> 
图 3：使用 MAGeCK 进行引导序列富集分析。（A）MAGeCK count 功能输出结果的汇总。（B）读段计数的分布情况。（C）供体质粒 gDNA 与质粒文库计数之间相关性的 Pearson 和 Spearman 相关系数。（D）通过改进的稳健排序整合方法（RRA 评分）排序的潜在富集/耗竭基因。（E）火山图显示显著差异基因（p 值 &lt; 0.05，LFC &gt; 0.5），以红色标出。（F）对富集的显著基因进行 Metascape 通路分析后得到的前导 Gene Ontology（GO）条目。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69721/69721fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：引物序列。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69721/Table%201.xls" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：PCR条件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69721/TABLE%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 1：激酶组 1 文库中的 sgRNA 列表以及在 NdeI 和 PspXI 消化过程中丢失的 sgRNA <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69721/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

我们开发了一种针对原代CAR T细胞的优化CRISPR-Cas9基因敲除筛选方案。通过酶消化减少基因组DNA残留，并结合sgRNA表达盒的富集，该方法可最大限度地降低PCR假象，确保sgRNA的准确检测以及功能基因靶点的可靠鉴定。

改进CAR T细胞中CRISPR-Cas9筛选：一种优化的文库构建方法

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在多种血液系统恶性肿瘤中已显示出显著疗效，然而其在实体瘤中的成功尚未实现……

我们的研究重点是利用CRISPR筛选方法来鉴定靶点并提高CAR T细胞疗法的有效性。目前实验面临的挑战包括在CRISPR筛选方法中实现可重复的实验操作。首先，将预定量的Lentiviral CRISPR文库加入含有T细胞的24孔板中。加入多聚脑（poly brain），终浓度为每毫升8微克。轻轻混匀以确保均匀分布。在32摄氏度下以700 ×g离心90分钟，进行旋转感染（spin-fection）。离心后，小心地从离心机中取出培养板。更换为新鲜的T细胞生长培养基。六小时后，以感染复数为3的剂量加入CAR慢病毒载体。将细胞在 37 摄氏度下孵育四天。孵育结束后，收集 CAR T 细胞，用 PBS 洗涤一次。然后使用碘化丙啶-丫啶橙对细胞进行染色，并在荧光细胞计数器中计数。在电穿孔缓冲液中配制4 µM的Cas9溶液。将5 × 10⁶个CAR T细胞重悬于50 µL Cas9溶液中，重复五次。然后将50微升细胞悬液移液至多孔比色皿条的每个孔中，避免产生气泡。若存在可见气泡，可用移液枪头轻轻沿孔壁划过以去除。使用expand T-cell three程序对CAR T细胞进行核转染。将比色皿置于37摄氏度的培养箱中孵育40分钟。用T细胞生长培养基重悬核转染后的细胞，然后于37摄氏度再次孵育三天。使用荧光细胞计数仪结合吖啶橙-碘化丙啶染色对细胞进行计数。将细胞密度调整至每毫升10的6次方个细胞后，加入嘌呤霉素，使其终浓度为2.5微克/毫升。孵育六天后，采用流式细胞术评估CAR阳性细胞的百分比。然后分选CAR T细胞群体，并将干燥的细胞沉淀在-80摄氏度下保存。采用细胞和组织DNA提取方法从样品中提取基因组DNA。使用双链DNA定量试剂盒测定基因组DNA浓度。接下来，在50微升的总体积中，用20单位所选的限制性内切酶消化最多五微克的基因组DNA。在37摄氏度的热循环仪中孵育过夜。第二天，准备10毫升洗脱缓冲液（含10毫摩尔Tris HCl）和50毫升新鲜的70%乙醇。将100微升消化产物用移液器加入含有涡旋混匀的磁珠的离心管中。用移液器充分混匀悬浮液，室温孵育5分钟，然后置于磁力架上5分钟。在磁力架上时，弃去上清液，用移液器加入200微升70%乙醇溶液，注意不要扰动沉淀物。30秒后，弃去上清液，再进行两次酒精洗涤。两次洗涤后，让磁珠干燥两分钟，然后将其从磁铁上取下。加入40 µL洗脱缓冲液，用移液器吹打重悬磁珠。将悬浮液磁力分离两分钟，然后将上清液转移至新管中。向含有1毫克涡旋链霉亲和素磁珠的管中加入1×洗涤结合缓冲液。用移液器吹打使磁珠在缓冲液中重悬。然后将悬液置于磁力架上1分钟，弃去上清液，并再进行两次洗涤。第三次洗涤后，将磁珠重悬于两倍体积的洗涤结合缓冲液中。随后，向纯化的消化产物中加入5 µL 10 µmol/L的生物素标记下拉引物。将混合物在96摄氏度的干浴中孵育5分钟，随后立即在冰上冷却5分钟。向反应体系中加入1毫克预先洗涤过的链霉亲和素磁珠，确保反应液与链霉亲和素磁珠的体积相等。室温孵育20分钟，每隔4分钟重新悬浮一次。将磁珠磁力吸附5分钟，然后用1×洗涤结合缓冲液清洗三次。最后，将含有结合sgRNA片段的磁珠重悬于50 µL洗脱缓冲液中。制备并扩增sgRNA文库，然后进行测序。经过抗生素筛选后，用CRISPR文库转导的CAR T细胞在嘌呤霉素处理后，来自两个供体的细胞均表现出持续的存活和增殖。未转导的T细胞以及未转导CRISPR文库的CAR T细胞在抗生素筛选下未表现出类似的增殖，作为阴性对照。使用NDEL和PSPXI限制性内切酶消化可使基因组DNA片段化，同时保留单链向导RNA表达盒以进行富集。随后选择性扩增了含有sgRNA的片段。Pearson和Spearman相关性分析表明，与质粒文库相比，供体基因组DNA样本中的单导向RNA读数数量和文库复杂性均得以保持。稳健秩聚合分析鉴定了在两个供体中经Cas9编辑后显著富集或耗竭的基因。通路富集分析揭示了与已鉴定的遗传调控因子相关的主要基因本体论术语。本方案为利用CRISPR筛选方法的现有实验技术提供了一种可靠的替代方案。我们的研究结果将通过支持更可重复且更稳健的CRISPR筛选方案的开发，推动该领域的发展。我们的研究结果为鉴定基因奠定了基础，并可通过调控来增强CAR T细胞的表型与功能。

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