多重免疫荧光检测法用于衰老标志物的空间评估 体内

衰老细胞的空间分析对于理解其在衰老、癌症、免疫以及正常组织稳态等过程中的作用具有重要意义。衰老细胞的检测依赖于多种生物标志物的分析。多重免疫荧光成像技术能够在单个组织切片中高通量地分析这些标志物。

首先，确认厚度为5微米、经福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）的组织切片，其最大尺寸为4 × 2厘米，已居中贴附于带正电荷的显微镜载玻片上，并且在无盖玻片载片架的观察窗口内清晰可见。样本制备步骤可使用脱蜡室手动操作，或使用自动染色机自动完成。将制备好的载玻片放入无盖玻片载片架中。

将载玻片的上边缘和右边缘与金属限位块对齐。用双手同时转动塑料凸轮，将其锁定在闭合的挂锁位置。确认载玻片完全平整地卡入位置，且在持片架内无晃动。

将ClickWell插件室放置在载玻片上方，用双手捏住侧边栏以控制压力，防止破损。通过进样口向ClickWell中加入2毫升封片介质，该介质含有50%甘油的磷酸盐缓冲液。在载玻片左侧任意方向贴上条形码标签，然后进行成像。

进行区域选择和自发荧光分析时，打开 Mx Workflow 版本 4204 多重成像采集软件。点击“工具”以选择“协议发布器”。在弹出的多重协议发布器窗口中，输入协议名称。

单击“创建设置轮次”，然后单击“添加下一轮方案”以创建多轮生物标志物标记。单击“发布”，然后在弹出窗口中选择“确定”。采集Cy3通道以获得虚拟H&E图像。

单击“载玻片”，然后选择“创建新批次”。选择实验方案名称后，输入载玻片编号。单击“添加载玻片”，然后选择“创建批次”以建立多重实验工作流程。打开 Cell DIVE 采集软件。

单击“加载”以将载玻片载入显微镜。在“工具”下拉菜单中，单击网格图标以定义所需区域，并使用“移动”工具重新定位已定义的区域。接下来，使用“绘制”工具取消选择任何不需要的区域，确保每个视野至少有两个相邻的视野，以避免拼接问题，然后单击“保存区域”。

在 Mx 工作流程窗口中，单击“Viewer QC”以打开 Cell DIVE 查看器页面，并以 10 倍放大倍数查看组织图像。单击图像校正图标以调整图像亮度，然后单击“Submit QC”，在弹出窗口中选择“Pass”和“Reload Slide”。图像重新加载后，单击“Add ROI”以绘制并调整感兴趣区域。

选择所需的视野并重复添加感兴趣区域（ROI）。然后，点击发送至实验室。加载玻片以开始20倍自体荧光图像采集。

在“成像质控”菜单下，选择与特定载片编号（Slide ID）对应的复选框，然后点击“查看器质控”。放大加载的图像，以检查是否存在失焦区域或伪影。检查每个通道的背景图像，这些背景图像将从最终的生物标志物信号中扣除。点击“提交质控”，然后选择“通过”并退出，以生成背景图像。

在进行连续生物标志物染色之前，将抗体在室温下以13,000 G离心一分钟，以减少人为假象。用含0.3%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）将抗体溶液按1:200的比例稀释。通过移液从ClickWell孔中吸出封片介质。

用含有0.01% Tween 20的2毫升PBS缓冲液（即PBST）清洗三次，每次5分钟。向孔中加入350微升抗体溶液，确保染色腔内的样本完全覆盖。室温孵育1小时。

接着，从 ClickWell 孔中用移液器吸出抗体溶液，并用 2 毫升 PBST 洗涤三次，每次 5 分钟。加入 2 毫升封片介质。

将 ClickWell 持载器插入显微镜并加载玻片，开始 20 倍生物标志物成像。使用混合编辑器和图像校正选项进行图像质量控制，并提交图像质量评估。用移液器从 ClickWell 孔中吸出封片介质，并用 2 毫升 PBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

使用前新鲜配制染料失活溶液。移除PBST后，每张载玻片加入2毫升染料失活溶液。在载玻片架中孵育15分钟。

用移液器将ClickWell孔中的染料失活溶液吸出，加入2毫升PBST洗涤5分钟。加入2毫升封片介质，将ClickWell支架插入显微镜中，启动针对各轮次的20倍自动荧光成像。待完成后，根据屏幕提示通过各项质控步骤以推进工作流程。

根据需要重复进行连续染色、染料失活和多重成像操作，直至完成所有标记。使用 HALO 软件选择不同通道，以观察组织核心不同区域中标志物的定位情况。点击“Analyze”（分析），选择“Entire Image”（整幅图像），以分析各标志物的定量指标。

单击“结果”以查看所分析组织芯中细胞的总数以及表达特定标志物的细胞亚群。与基于自动切片染色仪的方法相比，基于手动脱蜡室的方法导致更高的组织伪影发生率，具体表现为组织脱落以及组织芯丢失或移位。通过对代表性胰腺组织进行数字病理学软件定量分析发现，p16阳性细胞与较低的LB1水平相关，反之亦然，表明其特征与衰老相关标志物的表达模式一致。

经Z分数标准化的热图展示了p16阳性而lamin-B1阴性的衰老表型在多种组织中的分布情况，显示肺、肾上腺和垂体中衰老细胞高度富集，对应p16水平升高而LB1水平降低。相反，阑尾、淋巴结和脾脏表现出较低的细胞衰老水平，维持较高的LB1和较低的p16表达。该实验方案允许在单张显微镜切片上同时检测衰老相关标志物、结构标志物和免疫标志物的组合表达。

通过在单个样本中联合多种标记物，可对组织结构和衰老细胞的分布进行空间分析。未来应用包括跨多种组织类型的大规模衰老生物标志物分析，以及与空间组学技术的整合，以更精确地解析细胞异质性。