Name: 利用FACS进行单细胞测序，从小鼠皮层组织中分离周细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学习使用FACS技术从小鼠皮层组织中分离周细胞，通过CD13+/CD31-分选策略获得高纯度活细胞。该方法适用于单细胞测序，可深入研究周细胞异质性及其在神经血管疾病中的作用机制。

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本工作得到北京市自然科学基金（资助号：7242222）、河北省省级科技计划项目（资助号：203777110D）以及中国医学科学院微循环研究所的支持。&#160;中国医学科学院（项目编号：CAMS-IM-2023-02）

本研究使用了三只成年C57BL/6J小鼠（3月龄，20-25 g）。所有小鼠均饲养在12小时光照/12小时黑暗循环条件下，温度和湿度严格控制，实验前可自由获取食物和饮水。涉及实验动物的所有实验程序均经中国医学科学院微循环研究所和北京协和医学院实验动物福利与伦理委员会批准，并严格遵循相关动物福利指南进行。
1. 试剂准备
<ol>
	<li>30% (wt/vol) 葡萄糖溶液：将 15 g 葡萄糖溶解于 50 mL UltraPure 无 DNase/RNase 的 dH2O 中。为确保完全溶解，先将葡萄糖加入 20 mL UltraPure 无 DNase/RNase 的 dH2O 中并充分混匀，然后补加 UltraPure 无 DNase/RNase 的 dH2O 至终体积 50 mL。过滤溶液后于 4 °C 保存，可保存长达 6 个月。</li>
	<li>DNase I (10 mg/mL)：将 50 mg DNase I 溶解于 5 mL 无菌 ddH2O 中。该储备液可在 -20 °C 保存长达 2 个月。 
	注意：应严格避免反复冻融，以防酶活性丧失。为减少冻融影响，建议在初次冷冻前将溶液分装至无菌微量离心管中，每管 150 µL，实验时按需取出单次用量解冻使用。</li>
	<li>含 2% (vol/vol) 胎牛血清 (FBS) 的磷酸盐缓冲液 (PBS)：取 5 mL 10× PBS 与 45 mL UltraPure 无 DNase/RNase 的 dH2O 混合，配制 1× PBS。向 49 mL 1× PBS 中加入 1 mL FBS，充分混匀。 
	注意：该溶液应在步骤 2.1.2 中新鲜配制。每份组织样本分配 15 mL。</li>
	<li>胶原酶和分散酶 (CD) 酶储备液：分别将 100 mg Dispase 和 100 mg Collagenase 各自溶于 1 mL UltraPure 无 DNase/RNase 的 dH2O 中。将两种溶液混合，得到终体积为 2 mL 的溶液（酶浓度为 100 mg/mL）。 
	注意：将溶液分装至无菌微量离心管中，每管 500 µL，于 -20 °C 保存。使用前涡旋混匀，以避免因冻融循环导致活性损失。需注意，粉末状态可能引起严重皮肤/眼部刺激及呼吸系统不适。操作时务必在化学通风橱中进行，并佩戴腈类手套和 N95 口罩。如发生接触，应立即用大量清水冲洗受影响区域，并寻求医疗帮助。</li>
	<li>CD 酶工作液：将 1.5 mL CD 酶储备液与 43.5 mL PBS 中含 2% (vol/vol) FBS 的溶液（来自步骤 1.3）轻柔颠倒混匀。 
	注意：应在组织解离前立即配制（步骤 2.3.4）。该体积适用于三只小鼠；可根据需要按比例调整。</li>
	<li>22% (vol/vol) Percoll 溶液：将 11 mL Percoll、5 mL 10× PBS 和 34 mL UltraPure 无 DNase/RNase 的 dH2O 混合，配制成 50 mL 溶液。 
	注意：通过 0.22 µm PES 膜过滤除菌。可在 4 °C 保存一个月，稳定性无明显下降。</li>
	<li>机械解离缓冲液：向 10 mL PBS 中含 2% (vol/vol) FBS 的溶液（来自步骤 1.3）中加入 1 mL DNase I (10 mg/mL)，用移液器吹打混匀。</li>
	<li>BSA 溶液：分别配制 1%、20% 和 35% (wt/vol) 的 BSA 溶液，方法如下：
	<ol>
		<li>1% (wt/vol) BSA：将 0.15 g BSA 溶解于 15 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS) 中。</li>
		<li>20% (wt/vol) BSA：将 3 g BSA 溶解于 15 mL DPBS 中。</li>
		<li>35% (wt/vol) BSA：将 0.7 g BSA 溶解于 2 mL DPBS 中。 
		注意：使用前所有溶液均需经 0.22 µm PES 膜过滤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HBSS/BSA/葡萄糖缓冲液：向 50 mL HBSS 中加入 167 µL 30% (wt/vol) 葡萄糖溶液（来自步骤 1.1）和 1.4 mL 35% (wt/vol) BSA 溶液（来自步骤 1.8），轻柔混匀。 
	注意：该溶液应在步骤 2.1.2 中无菌条件下新鲜配制。配制后于 4 °C 保存至使用。</li>
	<li>组织收集缓冲液：向 12 mL HBSS/BSA/葡萄糖缓冲液（来自步骤 1.9）中加入 800 µL DNase I (10 mg/mL)。用于组织临时保存及移液管冲洗。 
	注意：该溶液应在步骤 2.1.2 中无菌条件下新鲜配制。</li>
	<li>1.25% (w/v) 三溴乙醇溶液：将 1.25 g 2,2,2-三溴乙醇溶解于 2.5 mL 2-甲基-2-丁醇中，然后将此混合液加入 97.5 mL 无菌 ddH2O 或生理盐水中，得到澄清的 1.25% 三溴乙醇溶液。 
	注意：每次使用前需新鲜配制。避光室温保存，并尽快使用。</li>
</ol>
2. 实验步骤（以三只小鼠为例）
<ol>
	<li>实验前准备（耗时：30 分钟）
	<ol>
		<li>高压灭菌所需耗材，并使用75%（vol/vol）乙醇对手术器械进行消毒。</li>
		<li>配制工作液：1× PBS（来自步骤1.3）、含2%（体积比）FBS的PBS（来自步骤1.3）、HBSS/BSA/葡萄糖溶液（来自步骤1.9）以及组织收集缓冲液（来自步骤1.10）。</li>
		<li>将10 mL 1× PBS倒入10 cm细胞培养皿中，并置于冰上。</li>
		<li>准备三个安瓿瓶，每个加入3 mL组织收集缓冲液，并置于冰上保存。</li>
		<li>准备三个15 mL离心管，每管加入10 mL含2%（体积/体积）FBS的PBS，置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠脑组织采集（耗时：30 分钟）
	<ol>
		<li>小鼠通过腹腔注射三溴乙醇（来自步骤1.11）进行深度麻醉，剂量为每10克体重0.2 mL。待足底反射消失后，采用颈椎脱位法实施安乐死。 
		注意：若小鼠在注射后5-10分钟内未达到手术麻醉平面（通过脚掌回缩反射消失来评估），则给予三溴乙醇腹腔追加剂量，为初始剂量的三分之一。</li>
		<li>用75%乙醇喷洒头部/颈部区域。从枕部至额部沿中线做头皮切口，暴露颅骨。在双侧眼眶前方做横向切口，随后沿小脑下缘做侧向切口，以分离颅底。最后，从后向前沿矢状缝纵向切开颅骨。掀开颅骨瓣，暴露由硬脑膜包裹的脑组织。用手术剪轻轻剪断视神经及延髓-脊髓连接处，同时轻柔抬起脑组织15将完整的大脑置于一个含有10 mL冰上预冷的1× PBS的10 cm培养皿中。 
		注意：操作组织时应轻柔，避免损伤。</li>
		<li>将脑组织转移至铝箔上。使用镊子从边缘提起硬脑膜，并沿中线沟切开并切除。完全去除硬脑膜后，暴露蛛网膜下腔。用HBSS溶液冲洗蛛网膜下腔，然后用钝针分离血管，并小心去除软脑膜。16用剃刀将脑组织冠状切为2-3 mm厚的切片。弃去嗅球和最尾端的脑片。沿胼胝体分离大脑皮层，并将皮层组织转移至含有3 mL冰上预冷的组织收集缓冲液的安瓿瓶中。11.</li>
		<li>本方案中的周细胞分离特异性针对大脑皮层。对于其他感兴趣区域：将冠状切片置于双孔载玻片上，每孔加入一滴含2%（体积/体积）胎牛血清的磷酸盐缓冲液。在解剖显微镜下识别目标区域，手动分离后，按相同的后续处理步骤进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织解离（用时：3–3.5 小时）
	<ol>
		<li>使用手术刀片在安瓿瓶中将组织切成约1 mm × 1 mm的碎片。 
		注意：为保持组织新鲜，需在5分钟内完成剪碎。</li>
		<li>用组织收集缓冲液预润洗移液器吸头。保持吸头垂直（尖端朝下），缓慢吸取剪碎的组织片段至吸头尖端。轻柔地将组织片段排入预冷的15 mL离心管中（步骤2.1.5中已准备）。 
		注意：避免将碎片吸入上部枪头内，以防其黏附在移液器管壁上。</li>
		<li>用含2%（体积比）FBS的PBS洗涤含有组织碎片的安瓿瓶（来自步骤2.3.1），并将洗涤液转移至离心管中。在300 x g条件下离心 g 4 °C 下孵育 5 分钟。</li>
		<li>离心后弃去上清液。每管中加入3 mL CD酶工作液（来自步骤1.5），重悬沉淀。将每份悬液等量分装至3个新管中（共9管，每管1 mL），然后每管补充4 mL CD酶工作液（终体积为5 mL/管）。</li>
		<li>在37 °C杂交炉中孵育试管，以100 x转速振荡孵育100分钟 g14.</li>
		<li>孵育期间，通过将1 mL DNase I溶液加入10 mL含2% (vol/vol) FBS的PBS溶液（来自步骤1.10）中，制备组织解离溶液。</li>
		<li>通过在 300 x g 条件下离心终止消化反应 g 4 °C 下孵育 5 分钟。 
		注意：使用10–20 µL等分试样在显微镜下评估消化效率。理想的终点表现为珠状血管片段；血管片段呈长条状提示消化不足，而以单个细胞为主则提示消化过度。</li>
		<li>将沉淀重悬于每管1 mL组织解离液中，通过移液器吹打100次进行机械解离11. 
		注意：避免吸取移液器最大容量的液体，以减少气泡产生并保持细胞活性。</li>
		<li>将所有悬浮液（来自共9个消化管，代表3只小鼠的脑组织）汇集至一个50 mL离心管中。用2 mL含2%（体积/体积）FBS的PBS冲洗每个消化管，并将冲洗液合并。在300 x g 4 °C 下孵育 5 分钟。</li>
		<li>离心后可见明显的分层。小心弃去最上层（含有杂质和细小细胞碎片），保留中间层（由密度较低的细胞或细胞团组成）以及底层（完整细胞和部分未完全消化的组织碎片）。加入12.5 mL的20% BSA溶液，轻轻倒置离心管以重悬沉淀。再次于1000 × g 4 °C 下孵育 20 分钟。</li>
		<li>收集底部沉淀物（富含完整性细胞，纯度较高），将上清液（主要含有髓鞘碎片、脂质及少量细胞）转移至新的50 mL离心管中。轻轻倒置混悬，再次于1,000 x g 4 °C 下孵育 20 分钟。</li>
		<li>将两次离心步骤（步骤 2.3.10 和步骤 2.3.11）获得的每份沉淀分别重悬于 2 mL 含 2% (vol/vol) FBS 的 PBS 中（最终总体积：4 mL）。 
		注意：重悬过程中避免接触管壁，以尽量减少碎片污染。</li>
		<li>将上一步得到的两种重悬液合并至一个15 mL离心管中。在300 × g，4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液（含 BSA、细胞碎片及可能微量残留髓鞘脂质的废液缓冲液）。将沉淀物（最终纯化并洗涤后的高纯度完整靶细胞）重悬于 2 mL 含 2% FBS 的 PBS 溶液中。 
		注意：此步骤旨在将细胞转移至洁净且适合的悬浮缓冲液中，以用于后续实验操作。</li>
		<li>准备四个15 mL离心管，每管中加入4 mL 22% Percoll溶液。将重悬液轻轻铺加到Percoll梯度液上，每管0.5 mL，共四份，以最大化细胞得率。在560 x g 4 °C 下孵育 10 分钟。 
		注意：将离心机设置为 &#34;无刹车&#34; 为避免涡流破坏密度梯度，确保髓鞘碎片稳定存在于上清液中。</li>
		<li>小心吸除上清液。每管中加入 1 mL HBSS/BSA/葡萄糖缓冲液重悬沉淀。将悬液汇集至一个新的 15 mL 离心管中。用 2 mL HBSS/BSA/葡萄糖缓冲液冲洗 Percoll 管，并将洗涤液合并。300 × g 离心 g 4 °C 下孵育 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术分选准备与数据采集（用时：50 分钟）
	<ol>
		<li>小心吸除上清液。将细胞沉淀重悬于1 mL HBSS/BSA/葡萄糖缓冲液中。</li>
		<li>加入5 µL Fc受体（FcR）阻断试剂至细胞悬液中，4 °C孵育5分钟。</li>
		<li>向细胞悬液中加入以下荧光标记抗体，体积如下（适用于3只小鼠组织来源的样本）：CD45-PE 5 µL；CD41-PE 5 µL；CD31-APC 20 µL；CD13-FITC 15 µL。</li>
		<li>将细胞置于冰上避光孵育20分钟。 
		注意：避光。避免搅拌。</li>
		<li>加入6 mL HBSS/BSA/葡萄糖缓冲液洗涤细胞。300 x g离心 g 4 °C 下孵育 5 分钟。</li>
		<li>吸弃上清液。用1 mL HBSS/BSA/葡萄糖缓冲液重悬细胞沉淀。加入200 µL 7-氨基放线菌素D（7-AAD）溶液（用于排除死细胞），冰上孵育10分钟。随后用HBSS/BSA/葡萄糖缓冲液定容至2 mL。 
		注意：避光保存。</li>
		<li>向分选收集管（15 mL 圆锥形管）中加入 1% BSA 溶液，轻轻旋转以润洗管内表面。吸除多余溶液，每管中恰好留下 1 mL 1% BSA 溶液用于接收分选后的细胞。暂时置于冰上保存。</li>
		<li>分选前立即用40 µm滤网过滤染色后的细胞悬液。</li>
		<li>根据前向散射（FSC-A）和侧向散射（SSC-A）参数设置初始门控，排除FSC-A/SSC-A信号较低的细胞碎片。</li>
		<li>通过CD45和CD41的双阴性门控实现造血系细胞的耗竭，有效去除了白细胞、免疫细胞和血小板的污染。</li>
		<li>通过CD13阳性筛选从血管壁细胞中捕获潜在的周细胞。</li>
		<li>评估膜完整性 通过 7-AAD 荧光探针；通过 7-AAD⁻ 门控排除凋亡细胞。 
		注意：通过CD31阴性筛选获取高纯度CD31⁻/CD13⁺周细胞。将分选后的周细胞直接收集至含有1% BSA（来自步骤2.4.7）的离心管中，并置于冰上。立即制备单细胞悬液用于计数。随后直接上样进行测序，无需任何中间培养步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单细胞RNA测序与分析（用时：3-4天）
	<ol>
		<li>按照10x Genomics的方案制备分选后的周细胞单细胞悬液 &#34;GEM-X Universal 3' 基因表达 v4 4-重试剂盒用户指南&#34; (CG000731)17,18用于上样的细胞悬液活率 &#62; 90%，并稀释至推荐浓度范围300-2000个细胞/µL内。</li>
		<li>将单细胞悬液与条形码凝胶珠及酶混合，然后分区形成凝胶珠乳液（GEMs） 通过 微流控液滴包封19执行 原位 细胞裂解、逆转录和条形码-cDNA连接</li>
		<li>裂解GEMs以回收产物。使用以下程序通过PCR扩增cDNA：98 °C初始变性4 s；随后进行循环扩增（13个循环，每个循环包括98 °C变性20 s，53 °C退火30 s，72 °C延伸1 min）；最后72 °C延伸5 min。 &#60;500个目标细胞，501-6000个目标细胞为12个循环），每个循环包括9 °C变性2秒、9 °C退火3秒、7 °C延伸6秒；最后在72 °C延伸1分钟，随后保持在&#160;4 °C。验证扩增产物的片段大小（200–300 bp）和产量。 
		注意：扩增产物可在4 °C下保存最多72小时，或在-2 °C下保存一周，也可直接进行下一步处理。</li>
		<li>对于合格的cDNA：进行片段化、末端修复、连接P7接头，并使用带索引的引物进行扩增。通过片段大小筛选构建测序文库。</li>
		<li>在Illumina NovaSeq平台上进行质控验证后的序列文库构建。</li>
		<li>对测序数据进行解复用，以提取细胞条形码、唯一分子标识符（UMIs）和RNA序列。将读段比对至参考基因组。</li>
		<li>量化UMI计数，估算有效细胞数量，并生成基因-条形码表达矩阵20.</li>
		<li>使用 R 中的 DoubletFinder 软件包（v2.0.6）去除双细胞；基于人工最近邻识别进行预测，以确保数据质量。</li>
		<li>使用 Seurat（v5.0）进行主成分分析（PCA）和统一流形近似与投影（UMAP）降维，识别细胞簇，并可视化周细胞特异性标记基因以验证细胞身份。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nat Commun. 8 (1), 14049(2017).</li>
<li>Song, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+comparison+of+human+and+mouse+brain+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels.</a> Sci Rep. 10 (1), 12358(2020).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+brain+mural+cell+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Analysis of the brain mural cell transcriptome.</a> Sci Rep. 6, 35108(2016).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+pericyte-like+cells+induce+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived brain pericyte-like cells induce blood-brain barrier properties.</a> Sci Adv. 5 (3), eaau7375(2019).</li>
<li>Crouch, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+stage-specific+effects+of+prospectively+purified+vascular+cells+on+the+adult+V-SVZ+neural+stem+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regional and stage-specific effects of prospectively purified vascular cells on the adult V-SVZ neural stem cell lineage.</a> J Neurosci. 35 (11), 4528-4539 (2015).</li>
<li>Ruan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+identification+of+muscle+pericyte+selective+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Screening and identification of muscle pericyte selective markers.</a> Sci Rep. 15 (1), 28874(2025).</li>
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<li>Grant, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizational+hierarchy+and+structural+diversity+of+microvascular+pericytes+in+adult+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Organizational hierarchy and structural diversity of microvascular pericytes in adult mouse cortex.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 39 (3), 411-425 (2019).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究描述了一种基于CD13⁺/CD31⁻多色标记、经过系统优化和验证的FACS策略，可用于高效分离小鼠脑血管壁周细胞24。流式细胞术及后续的单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析证实，该方法能够精确区分周细胞与内皮细胞，并获得始终满足scRNA-seq各项关键质控指标的细胞，包括细胞活力、聚集率、活细胞浓度和有核细胞比例。该已建立的方法为未来利用单细胞转录组学深入研究周细胞在多种脑部疾病中的功能提供了可靠的技术基础。
本研究的关键技术进步在于对既有的 CD13⁺/CD31⁻ 分选策略进行了关键性优化，特别提升了其适用于单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）的性能。首先，考虑到细胞分选过程耗时较长，我们在组织解离后额外引入了一个关键步骤，即用 20% BSA 溶液重悬细胞，同时在解离液和缓冲液中也使用 BSA。该优化主要作用是中和细胞表面电荷、减少细胞黏附与聚集、抑制残留酶活性并维持细胞膜完整性，从而共同提供更稳定的微环境，显著降低操作过程中的细胞损伤，有效保持细胞活力。其次，我们优化并延长了组织孵育时间，以满足成年小鼠脑组织...

周细胞是一种重要的细胞类型，位于微血管周围，通常嵌入毛细血管基膜内并包绕内皮细胞1在脑内，周细胞与内皮细胞、星形胶质细胞及其他细胞类型共同构成神经血管单元，是血脑屏障（BBB）结构与功能的重要组成部分。周细胞在脑血流调节、血管重塑以及血管稳态维持中发挥关键作用。它们通过与邻近细胞的紧密物理接触和旁分泌信号传导，维持血脑屏障的完整性。2；动态调节跨内皮转运 通过 内吞作用及特定转运蛋白的表达；并通过收缩和舒张活动维持脑部血流动力学的稳定3周细胞功能障碍及其覆盖率或密度的改变可导致血管调节失常和神经功能缺损，最终引发多种神经系统疾病相关的病理变化。4然而，周细胞固有的异质性为其进一步的机制研究带来了重大挑战。
随着单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的发展，越来越多的研究利用scRNA-seq探索细胞异质性，并鉴定疾病发生与进展过程中的关键靶点。常用的周细胞标志物包括血小板源性生长因子受体-β（PDGFR-β）5、神经胶质抗原2（NG2）以及α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。然而，这些标志物的特异性相对较低6，因为它们可同时标记其他血管细胞（如平滑肌细胞）以及少突胶质前体细胞等神经前体细胞，从而难以将周细胞与其他脑细胞区分开来。为了寻找更可靠的替代标志物，我们转向了CD13（氨基肽酶N，APN）。在既往研究中，CD13被广泛认为在脑血管周细胞中具有强而稳定的表达7,8,9,10。在本研究中，我们对脑组织切片进行了免疫荧光染色，结果证实周细胞表达CD13，且该标志物可有效区分周细胞与内皮细胞，因为CD13信号仅存在于血管周围细胞，而在CD31⁺内皮细胞中未见表达。（图1A）。然而需要注意的是，CD13的表达并非完全局限于周细胞；在微动脉和微静脉的平滑肌细胞中也可检测到一定水平的表达（图1B、C）。
<img alt="α-SMA、CD13、CD31 的细胞荧光显微镜图像；DAPI 染色的细胞核；细胞标志物研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69749/69749fig1.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图 1"> 
图 1：免疫荧光染色显示脑血管壁细胞和血管平滑肌细胞表达 CD13，而内皮细胞中未检测到信号。（A）脑微血管中微动脉-毛细血管过渡区的代表性免疫荧光图像。合并图像显示 CD13⁺ 周细胞（绿色）包绕 CD31⁺ 内皮细胞（红色）。α-SMA+ 平滑肌细胞（青色）定位于微动脉区域，在毛细血管中缺失。（B）微动脉横切面。图像显示 CD13⁺ 周细胞（绿色）与 α-SMA+ 平滑肌细胞（青色）在周围平滑肌层中明显共定位，证实微动脉平滑肌细胞表达 CD13。（C）微静脉横切面。同样，可在微静脉管壁的 α-SMA 阳性平滑肌细胞中检测到 CD13（绿色，箭头所示）。比例尺：20 µm（A–C）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69749/69749fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了获得符合单细胞RNA测序（scRNA-seq）要求的小鼠大脑皮层血管壁周细胞，我们采用CD13⁺/CD31⁻抗体标记方法，通过荧光激活细胞分选（FACS）进行周细胞分离11。首先，利用CD45和CD41标记物排除脑组织悬液中的造血细胞12。随后，通过筛选CD13+细胞富集周细胞，并通过设门排除CD31-细胞群以进一步去除内皮细胞，从而分离出目标周细胞群体13。
我们认识到，CD13阳性筛选步骤会同时捕获来自微动脉和微静脉的表达CD13的平滑肌细胞。为了满足单细胞RNA测序（scRNA-seq）的关键要求并最大化周细胞的保留，我们在分选阶段战略性地选择了该标志物组合，以优先提高周细胞的得率。尽管该方法会导致少量平滑肌细胞被共同分离，但在初步富集阶段可有效最大化所有潜在周细胞的回收。这种分步设门策略显著减少了初始细胞的损失。此外，为了最大化周细胞的存活率和得率，我们还在解离后采用20% BSA溶液进行细胞重悬和过滤，有效去除了碎片，同时保持了分选细胞的存活率和纯度14。
利用该方法，我们成功地将脑血管周细胞与其他细胞类型区分开来，获得了高纯度、高活性的周细胞样本，满足单细胞RNA测序（scRNA-seq）的严格要求。该技术为后续深入研究周细胞在多种疾病环境中的作用提供了坚实的基础。

<table><tbody><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibicol</td><td>A5669701</td><td>分装并储存在 -20&amp;deg;C；可在 4℃ 下保存&amp;deg;解冻后可在 4°C 保存最多一周</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液(10&amp;times;PBS，pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td>使用前稀释以用于细胞洗涤</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td>用于制备细胞能量缓冲液</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1933-25g</td><td>保护细胞并防止黏附</td></tr><tr><td>杜尔贝科的&amp;nbsp; 磷酸盐缓冲液（DPBS,1&amp;times;)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液（HBSS,1&amp;times;)</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td>用于细胞洗涤和重悬</td></tr><tr><td>UltraPure 无 DNase/RNase 灭菌蒸馏水</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>用于制备无核酸酶的反应体系</td></tr><tr><td>胶原酶/分散酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11097113001-100mg</td><td>用于组织消化和细胞解离；分装后于 -20 保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>DNase I（无RNase）</td><td>TIANGEN</td><td>RT411-1500U</td><td>防止DNA聚集；分装后于-20℃保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644-100ML</td><td>用于细胞分离；4℃保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>FITC 标记大鼠抗小鼠 CD13</td><td>BD 生物科学</td><td>558744</td><td>荧光偶联物；4℃避光保存&amp;deg;C，最长可保存1个月</td></tr><tr><td>APC 标记的抗小鼠 CD31 大鼠抗体</td><td>BD 生物科学</td><td>551262</td><td>避光保存于4&amp;deg;数月内保持在 C</td></tr><tr><td>PE 大鼠抗小鼠 CD41</td><td>BD 生物科学</td><td>558040</td><td>避光保存于 4&amp;deg;数月内保持在 C</td></tr><tr><td>PE 大鼠抗小鼠 CD45</td><td>BD 生物科学</td><td>553081</td><td>避光保存于4&amp;deg;数月内保持在 C</td></tr><tr><td>FITC 大鼠 IgG1， &amp;kappa; 同型对照</td><td>BD Biosciences</td><td>552916</td><td>荧光对照；4℃避光保存&amp;deg;C</td></tr><tr><td>APC 标记的大鼠 IgG2a &amp;kappa; 同型对照</td><td>BD 生物科学</td><td>553932</td><td>避光保存于4&amp;deg;数月之久</td></tr><tr><td>PE 大鼠 IgG2b， &amp;kappa; 同型对照</td><td>BD 生物科学</td><td>553989</td><td>避光保存于 4&amp;deg;数月</td></tr><tr><td>RNase AWAY 去污试剂</td><td>Ambion</td><td>10328011</td><td>用于消除RNase污染</td></tr><tr><td>纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32（小鼠 BD Fc 封闭剂）</td><td>BD Pharmingen</td><td>553141</td><td>防止非特异性抗体结合</td></tr><tr><td>7-氨基放线菌素D（7-AAD）</td><td>BD Pharmingen</td><td>559925</td><td>用于排除死细胞。</td></tr><tr><td>2,2,2-三溴乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25g</td><td>用于配制1.25% (w/v) 三溴乙醇溶液</td></tr><tr><td>2-甲基-2-丁醇</td><td>普赛通</td><td>M20008-500mL</td><td>用于配制1.25%（w/v）三溴乙醇溶液</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>江苏华创信诺医药科技有限公司</td><td>SYXK（苏）2020-0041</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>康宁</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>康宁</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 100 mm&amp;times;20 mm</td><td>康宁</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger</td><td></td><td>3.1.0/4.0.0</td><td>单细胞测序数据分析软件</td></tr><tr><td>Loupe Cell Browser</td><td></td><td>4.1</td><td>细胞浏览器</td></tr><tr><td>STAR</td><td></td><td>2.5.1b</td><td>RNA 比对</td></tr><tr><td>irlbpy</td><td></td><td>-</td><td>主成分分析</td></tr><tr><td>t-SNE</td><td></td><td>0.15</td><td>Barnes-Hut t-SNE（t-分布随机邻域嵌入）分析</td></tr><tr><td>k均值</td><td></td><td>0.17</td><td>K-均值聚类</td></tr><tr><td>基于图的聚类</td><td></td><td>0.17</td><td>基于图的聚类</td></tr><tr><td>FastQC</td><td></td><td>v0.11.2</td><td>数据质量控制（QC）</td></tr></tbody></table>

使用facs从鼠脑皮层组织中分离周细胞用于单细胞测序

Isolation of Pericytes from Mouse Cortical Tissue Using FACS for Single-cell Sequencing

周细胞作为神经血管单元的核心组分，在通过调节微血管张力维持血脑屏障完整性和脑血流动力学稳态方面发挥着关键作用。周细胞功能障碍已被证实与多种神经系统疾病相关。为了在单细胞分辨率下研究周细胞的异质性，并阐明其在神经血管疾病中的作用机制，我们建立了一种优化且可重复的小鼠脑周细胞分离方案，适用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）。该方法基于已有的CD13+/CD31-分选策略，但针对scRNA-seq应用进行了关键性优化。简言之，从小鼠品系C57BL/6的三只成年小鼠中获取脑组织。脑组织经机械解离后进行酶消化，以获得单细胞悬液。经过连续离心处理后，最终的细胞沉淀重悬于20%牛血清白蛋白（BSA）溶液中，这是我们引入的关键步骤，旨在减少细胞应激和聚集，从而最大限度地提高细胞活力和测序所需的RNA质量。这一优化的基于FACS的方法能够高效分离出高活性的小鼠脑周细胞，满足scRNA-seq的严格要求，为解析周细胞异质性及其在神经血管疾病中的病理作用提供了有力工具。

为实现脑周细胞的精确分离，将从脑组织中解离的细胞用PE Texas Red标记的抗小鼠CD41/CD45抗体、FITC标记的抗小鼠CD13抗体以及APC标记的抗小鼠CD31抗体进行染色，建立了一种结合表面标志物与活率检测的多步分选策略（图2). 基于前向散射（FSC-A）和侧向散射（SSC-A）参数的初步设门可有效排除细胞碎片图2，左上象限）。随后的CD45⁺/CD41⁺双阳性细胞去除步骤清除了造血细胞和血小板污染物（图2右上象限）。在CD13⁺血管壁细胞富集过程中，加入7-AAD荧光探针用于阴性门控以排除凋亡细胞，并根据CD31阴性筛选特异性收集周细胞。图2，左下象限）。分选结果显示，有核细胞占所有事件的59.8%，CD13阳性细胞占所有事件的1%，最终获得的周细胞群体 通过 CD31⁻ 阴性筛选占所有事件的0.7%（图2...

为获得满足单细胞RNA测序（scRNA-seq）要求的小鼠脑皮层周细胞，我们提出了一种基于CD13⁺/CD31⁻筛选的 critically 优化的流式细胞分选（FACS）方案。我们的关键改进显著提高了细胞活力和RNA完整性，从而实现可靠的转录组分析。

使用FACS从鼠脑皮层组织中分离周细胞用于单细胞测序

周细胞作为神经血管单元的核心组成部分，在维持血脑屏障完整性和调节...方面发挥着至关重要的作用

我们的研究聚焦于脑部寄生虫，重点关注其在神经血管单元中的血管功能及其相互作用，以理解大脑功能。通过低成像和空间FACS技术对肠道过程进行图谱绘制，或揭示寄生虫在脑血管系统中的功能，从而发现特定位置的作用机制及治疗靶点。首先，用75%乙醇喷洒已实施安乐死的小鼠的头部和颈部区域。使用手术刀，从枕部至额部做一条正中头皮切口，以暴露颅骨。在双侧眼眶前方做一横向切口，随后沿小脑下缘做两侧切口，以分离颅底。从后向前沿矢状缝纵向切开颅骨。将颅骨瓣与硬脑膜一同抬起，以暴露脑组织。使用手术剪轻轻抬起脑组织，同时切断视神经和延髓与脊髓的连接。将完整的脑组织轻柔地放入含有10毫升冰冻PBS的10厘米培养皿中，避免造成任何损伤。将脑组织转移至铝箔上。暴露蛛网膜下腔。用镊子去除硬脑膜后，用Hank's平衡盐溶液冲洗。将组织转移至滤纸上，通过滚动去除软脑膜。用剃刀片切去并弃除嗅球及最尾端的部分，将脑组织冠状切片为厚度两到三毫米的切片。沿胼胝体分离大脑皮层。将皮质组织转移至含有3 mL冰上预冷的组织收集缓冲液的安瓿瓶中。使用外科手术刀片将组织和安瓿瓶中的组织切碎成约1 mm × 1 mm大小的碎片，并在5分钟内完成切碎操作以保持组织的新鲜度。移液器吸头使用前需用组织收集缓冲液预润洗。然后将移液管垂直放置，缓慢吸取剪碎的组织碎片至吸头尖端。轻柔地将碎片排入预冷的15毫升离心管中。用含2%FBS的PBS缓冲液清洗原始安瓿瓶。将洗涤液转移至相同的离心管中，在4°C条件下以300G离心5分钟。离心后弃去上清液。将每个沉淀重悬于3 mL CD酶工作液中。将悬液等分至三个试管中，每管加入适量的额外酶溶液，使每管终体积达到5毫升。将试管置于杂交炉中，37摄氏度、100G轨道振荡条件下孵育100分钟。孵育期间，向10毫升含2% FBS的PBS溶液中加入1毫升DNase I溶液。在4°C条件下以300G离心5分钟以终止消化反应。然后将每个沉淀重悬于1毫升组织解离溶液中。用移液器吹打溶液100次，以促进机械解离。接下来，将所有悬浮液合并至一个50毫升离心管中。用2毫升缓冲液冲洗每个管子，并将洗涤液合并。在4°C、300×g条件下离心5分钟，弃去最上层液体后，加入12.5毫升20% BSA，颠倒混匀。在4°C条件下以1000 G离心20分钟。收集底部沉淀，并将上清液转移至新的50毫升离心管中。再次离心前需轻轻重悬沉淀。将每个沉淀重悬于2毫升含2% FBS的PBS中。然后将两种悬液合并至同一管中。在4°C条件下，以300 × g离心5分钟。弃去上清液后，将最终沉淀物重悬于含有2% FBS的2毫升PBS中。准备四个15毫升离心管，每管中含有4毫升22% percoll溶液。将0.5毫升细胞悬液轻柔地分层加至各梯度溶液上，于4°C下以560 × g离心10分钟。吸去上清液后，将每个沉淀物重悬于1毫升HBSS BSA葡萄糖缓冲液中。然后将悬液转移至新的15毫升离心管中。用2毫升缓冲液冲洗Percoll管，并将洗涤液合并，于4°C、300×g离心5分钟。进行流式细胞术时，吸除上清液后，将沉淀物重悬于1毫升HBSS BSA葡萄糖缓冲液中。加入5 µL Fc受体阻断试剂，在4°C孵育5分钟。然后向悬液中加入荧光标记的抗体，再进行孵育。用六毫升 HBSS BSA 葡萄糖缓冲液洗涤细胞。然后在 4°C 条件下以 300 × g 离心五分钟。吸除上清液后，将沉淀物重悬于一毫升缓冲液中。加入200微升七氨基放线菌素D溶液，冰上孵育10分钟。然后用添加了BSA和葡萄糖的HBSS缓冲液将终体积调至2毫升。用1% BSA溶液冲洗分选收集管的内表面。吸出多余的溶液，每管中恰好留下一毫升溶液。将试管置于冰上，以接收分选的细胞。从脑组织中解离的细胞在流式分选过程中，依次根据前向散射面积和侧向散射面积进行设门，以排除细胞碎片。排除CD45阳性与CD41阳性的双阳性事件，以去除造血细胞和血小板污染。富集CD13阳性的血管壁细胞。并通过七氨基放线菌素D阴性设门排除凋亡细胞，随后通过CD31阴性筛选分离寄生虫。流式细胞术分选结果显示，有核细胞占所有事件的59.8%。CD13阳性细胞占所有事件的1%。最终的CD13阳性CD31阴性寄生细胞群体占所有事件的0.7%。对分选细胞进行UMAP降维分析揭示了六个明显的主要簇群，表明分离细胞群体中存在细胞异质性。经Z分数标准化的热图分析显示，寄生虫标志基因在第0至第3簇群中高度且主要表达。簇群比例分析表明，第0至第3簇群占总群体的87.1%。平滑肌细胞标志物在第四群集中富集，比例为10.14%，成纤维细胞标志物在第五群集中富集，比例为2.77%。本方案可使研究人员分离出高纯度的可穿戴寄生虫，适用于后续的单细胞测序和功能分析。主要挑战在于缺乏高度特异性的寄生虫标志物、分离过程复杂，以及污染风险增加。未来的研究可聚焦于鉴定寄生虫特异性标志物，从而实现更优的分离、更深入的功能表征以及靶向治疗研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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通过FACS分离小鼠皮肤成纤维细胞

人类心脏组织中含有多种具有多向分化潜能的血管周围前体细胞群体，这些细胞可能适用于心肌再生。本文所述技术可同时分离和纯化两种与天然血管相关的多能间充质细胞群体， 即 CD146+CD34- 周细胞和CD34+CD146-...

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