Name: 点印分析用于检测全局N6-甲基腺苷RNA修饰水平 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学习使用点印分析法检测全局N6-甲基腺苷RNA修饰水平，通过143B细胞培养、RNA提取及抗体检测实现半定量评估。该方法为表观遗传学研究提供快速经济的筛选方案。

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本工作获得了国家自然科学基金（82174408、82374477 和 82474535）资助。图1使用BioRender.com制作。

注意：本实验方案分为三个部分：RNA 制备、点印迹分析和定量。 材料表 汇总了所需的材料，补充表 1 详细列出了试剂配方，图 1 展示了实验流程。
1. RNA 提取
<ol>
	<li>细胞准备
	<ol>
		<li>从 37 °C 培养箱中取出稳定敲低 SNHG21 的 143B 细胞（shSNHG21）、阴性对照细胞（shCtrl）以及用 3-脱氮腺苷（3-DAA；[100 µM，24 h]）和甲氯芬那酸（MA；[100 µM，24 h]）处理的细胞。</li>
		<li>在显微镜下确认细胞融合度约为 80–90%，且细胞状态良好。</li>
		<li>吸除培养基，然后用 1 mL PBS 洗涤细胞两次。</li>
		<li>吸除 PBS，每 6 cm 培养皿加入 1 mL 胰蛋白酶溶液。</li>
		<li>轻轻晃动以使胰蛋白酶均匀分布，孵育 1 分钟。</li>
		<li>吸除胰蛋白酶，加入含 10% FBS 的 1 mL 培养基以终止消化。</li>
		<li>反复吹打数次，使细胞充分悬浮分散。</li>
		<li>将细胞悬液转移至 1.5 mL 无 RNase 的微量离心管中。 
		注意：使用前请标记试管。步骤 1.1.3 至 1.1.8 必须在无菌条件下操作。</li>
		<li>以 1000 × g 离心 3 分钟，然后完全吸除上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 提取 
	注意：RNA 提取使用 EZ-press RNA 纯化试剂盒。
	<ol>
		<li>向细胞沉淀中加入 600 µL 裂解缓冲液（RNA 纯化试剂盒提供），充分涡旋以彻底裂解细胞，室温静置 5 分钟。 
		注意：RNA 分离约使用 2 × 106 个细胞。</li>
		<li>加入等体积的 100% 乙醇，充分涡旋混匀。</li>
		<li>将 600 µL 混合液加入已装配至收集管的离心柱中。 
		注意：使用前请组装离心柱与收集管，并标记收集管。</li>
		<li>以 12,000 × g 离心 1 分钟，弃去收集管中的液体。 
		注意：避免离心柱底部接触液体或操作者。</li>
		<li>对剩余混合液重复步骤 1.2.3–1.2.4。</li>
		<li>向每个离心柱中加入 500 µL 洗涤缓冲液（RNA 纯化试剂盒提供），室温静置 1 分钟。</li>
		<li>以 12,000 × g 离心 1 分钟，弃去收集管中的液体。</li>
		<li>将空柱再次以 12,000 × g 离心 1 分钟，以去除残留液体。</li>
		<li>将离心柱转移至新的 1.5 mL 无 RNase 离心管中，打开管盖，室温晾干 2 分钟。 
		注意：使用前请标记离心管。</li>
		<li>向离心柱膜中央加入 25–50 µL 洗脱缓冲液（无酶水）。</li>
		<li>室温孵育 2 分钟。</li>
		<li>以 12,000 × g 离心 1 分钟，洗脱 RNA。</li>
		<li>弃去离心柱，将 RNA 置于冰上。 
		注意：RNA 可于 -80 °C 保存至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 稀释
	<ol>
		<li>使用 DS-11 分光光度计测定 143B shSNHG21 细胞、143B shCtrl 细胞以及经 3-DAA 和 MA 处理的细胞的 RNA 浓度。</li>
		<li>从每种细胞系中准备 1 µg 总 RNA。</li>
		<li>用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水将 RNA 连续稀释至 400 ng、200 ng 和 100 ng。 
		注意：可根据需要调整浓度梯度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA 变性
	<ol>
		<li>将稀释后的 RNA 样品在 95 °C 加热 3 分钟。</li>
		<li>立即转移至冰上冷却。 
		注意：变性后的 RNA 可在 4 °C 保存最多 1 周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 点印迹
<ol>
	<li>RNA点样
	<ol>
		<li>将带正电荷的尼龙膜裁剪至所需尺寸。</li>
		<li>在膜上绘制参考线，并用样本名称进行标记。</li>
		<li>通过轻柔涡旋振荡或移液操作充分混匀RNA。</li>
		<li>将每种RNA样本1–2 µL点样至膜上的指定位置。 
		注意：始终使用无RNase的移液器吸头。避免移液器吸头直接接触膜表面。让RNA在膜上自然扩散。每个样本使用新的吸头。每点体积不得超过2 µL，以防扩散不规则。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA交联
	<ol>
		<li>将膜在空气中干燥3分钟。</li>
		<li>使用紫外交联仪在254 nm波长、120 mJ/cm²剂量下对膜进行RNA交联。 
		注意：也可选择将膜在37 °C孵育30分钟作为替代方法。</li>
		<li>在摇床上用10 mL 1× TBST洗涤膜5分钟，以去除未结合的RNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>膜封闭
	<ol>
		<li>配制5% BSA溶液。 
		注意：使用前新鲜配制该溶液。</li>
		<li>将膜在封闭液中室温孵育2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体孵育
	<ol>
		<li>将膜与抗-m⁶A抗体在4 °C孵育过夜。 
		注意：使用前用5% BSA溶液按1:1000比例稀释抗体。将膜置于摇床上，轻柔振荡（50 rpm）孵育。</li>
		<li>在摇床上用10 mL 1× TBST洗涤膜三次，每次10分钟。</li>
		<li>将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗在室温孵育1小时。 
		注意：使用前用5% BSA溶液按1:1000比例稀释抗体。</li>
		<li>在摇床上用10 mL 1× TBST洗涤膜三次，每次10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化学发光检测
	<ol>
		<li>将化学发光HRP底物均匀地逐滴加至膜表面。 
		注意：在室温下轻轻摇动孵育1分钟。</li>
		<li>使用化学发光成像系统检测信号。</li>
		<li>在化学发光成像系统中使用自动曝光功能进行初始预扫描。 
		注意：仅当最亮信号饱和度低于65%时接受自动曝光时间；否则将曝光时间减半并重新采集，直至峰值信号落在30–60%范围内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亚甲蓝（MB）染色
	<ol>
		<li>将膜在MB染色液中孵育1分钟。</li>
		<li>在摇床上用10 mL 1× TBST洗涤膜三次，每次5分钟，然后成像作为上样对照。 
		注意：使用同一张用于化学发光检测的膜进行染色。避免扰动染色液中的沉淀。由于亚甲蓝难以清除，操作时应穿戴防护服和口罩。</li>
		<li>成像后，在摇床上用含1% SDS的溶液对MB染色的膜进行脱色处理15分钟，以便后续记录或可能的重新探针检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 定量分析
<ol>
	<li>灰度值测量
	<ol>
		<li>将图像导入 ImageJ 软件。</li>
		<li>使用 Image &#62; Type &#62; 8-bit 将图像转换为 8 位格式。</li>
		<li>通过 Process &#62; Subtract Background 去除背景。 
		注：半径设为 50.0 像素，勾选 Light background。</li>
		<li>使用 Rectangle 工具选择分析区域。</li>
		<li>依次定义泳道：Analyze &#62; Gels &#62; Select First Lane。</li>
		<li>使用 Analyze &#62; Gels &#62; Plot Lanes 生成强度分布图并测量峰面积。</li>
		<li>分别测量 m⁶A 和 MB 的灰度值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将数据复制到表格中进行分析。</li>
	<li>比较信号强度以评估整体 m⁶A 修饰水平。</li>
</ol>

<ol><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-dependent+regulation+of+messenger+RNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-dependent regulation of messenger RNA stability.</a> Nature. 505 (7481), 117-120 (2014).</li>
<li>Zhang, Z., Wei, W., Wang, H., Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine-sculpted+regulatory+landscape+of+noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine-sculpted regulatory landscape of noncoding RNA.</a> Front Oncol. 11 (1), 743990(2021).</li>
<li>Hsu, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+FMRP+facilitates+the+nuclear+export+of+N6-methyladenosine-containing+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein FMRP facilitates the nuclear export of N6-methyladenosine-containing mRNAs.</a> J Biol Chem. 294 (52), 19889-19895 (2019).</li>
<li>Chen, X. -Y., Zhang, J., Zhu, J. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+m6A+RNA+methylation+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of m6A RNA methylation in human cancer.</a> Mol Cancer. 18 (1), 103(2019).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+and+clinical+relevance+of+m6A+regulators+across+33+cancer+types%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization and clinical relevance of m6A regulators across 33 cancer types.</a> Mol Cancer. 18 (1), 137(2019).</li>
<li>Hu, Y., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+m6A+in+osteoporosis%2C+arthritis+and+osteosarcoma+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Role of m6A in osteoporosis, arthritis and osteosarcoma (review).</a> Exp Ther Med. 22 (3), 926(2021).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N6-methyladenosine+%28m6A%29+modification+in+osteosarcoma%3A+expression%2C+function+and+interaction+with+noncoding+RNAs-an+updated+review%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">N6-methyladenosine (m6A) modification in osteosarcoma: expression, function and interaction with noncoding RNAs-an updated review.</a> Epigenetics. 18 (1), 2260213(2023).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+N6methyladenosine+modification+residues+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of N6methyladenosine modification residues (review).</a> Int J Mol Med. 43 (6), 2267-2278 (2019).</li>
<li>Wang, Y., Jia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+methods+of+epitranscriptomic+mark+N6-methyladenosine%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection methods of epitranscriptomic mark N6-methyladenosine.</a> Essays Biochem. 64 (6), 967-979 (2020).</li>
<li>Stejskal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+by+LC-MS%2FMS+of+N6-methyladenosine+and+inosine+in+mRNA+reveal+complex+incidence%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Global analysis by LC-MS/MS of N6-methyladenosine and inosine in mRNA reveal complex incidence.</a> RNA. 31 (4), 514-528 (2025).</li>
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<li>Zhang, M., Li, Q., Xie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+hierarchical+model+for+analyzing+methylated+RNA+immunoprecipitation+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Quant+Biol+%28Beijing%29%22%5BJournal%5D)">A Bayesian hierarchical model for analyzing methylated RNA immunoprecipitation sequencing data.</a> Quant Biol (Beijing). 6 (3), 275-286 (2018).</li>
<li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+the+human+and+mouse+m6A+RNA+methylomes+revealed+by+m6A-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq.</a> Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).</li>
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<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METTL16+promotes+lipid+metabolic+reprogramming+and+colorectal+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">METTL16 promotes lipid metabolic reprogramming and colorectal cancer progression.</a> Int J Biol Sci. 21 (11), 4782-4797 (2025).</li>
<li>Ren, F., Cai, Y., Song, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OTUD7B+stabilization+by+METTL14-mediated+m6A+methylation+drives+HIF-1%CE%B1+expression+in+esophageal+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Res%22%5BJournal%5D)">OTUD7B stabilization by METTL14-mediated m6A methylation drives HIF-1α expression in esophageal squamous cell carcinoma.</a> Oncol Res. 33 (8), 2055-2074 (2025).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WTAP+facilitates+progression+of+hepatocellular+carcinoma+via+m6A-HuR-dependent+epigenetic+silencing+of+ETS1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">WTAP facilitates progression of hepatocellular carcinoma via m6A-HuR-dependent epigenetic silencing of ETS1.</a> Mol Cancer. 18 (1), 127(2019).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+circGDI2+inhibits+tumorigenesis+by+stabilizing+the+expression+of+RNA+m6A+demethylase+FTO+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Noncoding+RNA+Res%22%5BJournal%5D)">Upregulation of circGDI2 inhibits tumorigenesis by stabilizing the expression of RNA m6A demethylase FTO in oral squamous cell carcinoma.</a> Noncoding RNA Res. 10 (1), 140-152 (2025).</li>
<li>Ura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dot+blot+analyses+of+blood-group-related+antigens+in+paired+normal+and+malignant+human+breast+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Quantitative dot blot analyses of blood-group-related antigens in paired normal and malignant human breast tissues.</a> Int J Cancer. 50 (1), 57-63 (1992).</li>
<li>Reed, K. C., Mann, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transfer+of+DNA+from+agarose+gels+to+nylon+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon membranes.</a> Nucleic Acids Res. 13 (20), 7207-7221 (1985).</li>
<li>Herrin, D. L., Schmidt, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+reversible+staining+of+northern+blots+prior+to+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid, reversible staining of northern blots prior to hybridization.</a> Biotechniques. 6 (3), 196-200 (1988).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22RNA%3A+A+Laboratory+Manual%22">RNA: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2010).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (2001).</li>
<li>Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+RNA+modifications+in+the+epitranscriptome%3A+Predict+and+validate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: Predict and validate.</a> Nat Rev Genet. 18 (5), 275-291 (2017).</li>
<li>Meyer, K. D., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+epitranscriptome%3A+N6-methyladenosine+and+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic epitranscriptome: N6-methyladenosine and gene expression control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 313-326 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究中，在成骨肉瘤143B细胞中敲低SNHG21导致m⁶A信号强度降低，表明该检测方法在评估基因修饰是否影响RNA甲基化方面具有重要价值。此外，该检测方法还可用于多种应用，包括：1）功能研究与机制验证：可用于快速初步筛选，以确定整体m⁶A水平是否与特定生物学过程（如细胞分化、应激反应或肿瘤进展）相关16；也可用于评估m⁶A调控因子（“书写蛋白”、“擦除蛋白”和“阅读蛋白”）的功能作用，通过检测其调控是否引起整体甲基化丰度的可测量变化来实现17,18。2）特定RNA群体的分析：该方法能够检测定义RNA亚群（如mRNA、lncRNA或rRNA）中的m⁶A富集情况，从而揭示不同RNA类别特异性的甲基化模式19。3）临床与转化应用：为临床样本中整体m⁶A水平的比较提供了实用方法，例如肿瘤组织与相邻正常组织之间的比较，有助于生物标志物的开发及疾病关联研究20。4）作为高分辨率技术的补充：...

N6-甲基腺苷（m⁶A）是真核生物信使RNA（mRNA）中最常见的内部修饰，其在转录后调控中发挥关键作用，包括RNA稳定性、剪接、降解、翻译和出核运输1,2,3。m⁶A修饰的失调已被证实参与多种生理和病理过程，包括肿瘤的发生、进展和转移4,5。在骨肉瘤中，细胞系和组织样本中均观察到m⁶A水平升高，提示异常的RNA甲基化在该疾病生物学中具有重要作用6,7。因此，系统评估骨肉瘤相关转录本及调控通路中全局m⁶A丰度及其变化，对于阐明RNA甲基化在骨肉瘤中的生物学机制和临床意义至关重要。
目前有多种分析方法可用于研究m⁶A修饰8,9。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）10和基于酶联免疫吸附试验（ELISA）的检测方法11均可用于测定整体m⁶A水平。前者具有高灵敏度，但需要专门的设备和技术 expertise；而后者仅能提供相对m6A水平，且成本高于点杂交检测。MeRIP-qPCR可用于特定转录本的靶向评估，但其结果受免疫沉淀效率影响较大12。MeRIP-seq13、m⁶A-seq14和m⁶A-SAC-seq15是基于测序的技术，能够精确定位m⁶A甲基化位点；然而，这些方法成本较高，且需要进行大量的生物信息学分析。
m⁶A 点印迹实验为检测RNA中的全局m⁶A修饰水平提供了一种简单、快速且经济有效的方法。作为一种半定量免疫检测技术，其主要优势在于无需专用设备或复杂的生物信息学分析，即可获得m⁶A丰度的整体情况。这使得m⁶A点印迹实验成为常规筛选、初步功能验证和临床研究中的有力工具，也可作为高通量测序和质谱分析等先进方法的实用补充。本实验方案提供了详细的分步操作流程，确保检测结果的可重复性和广泛适用性。

<table><tbody><tr><td>3-脱氮腺苷 (3-DAA)</td><td>MCE</td><td>HY-W013332A</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>抗 m6A 单克隆抗体</td><td>Proteintech</td><td>68055-1-Ig</td><td>50 &amp;mu;L</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA, 第五组分)</td><td>BioFroxx</td><td>4240GR100&amp;nbsp;</td><td>100 g</td></tr><tr><td>ChemiDoc MP 成像系统</td><td>BIO RAD</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>WISENT</td><td>319-005-CL</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>DS-11 分光光度计</td><td>DeNOVIX</td><td>DS-11</td><td></td></tr><tr><td>EZ-press RNA 提取纯化试剂盒</td><td>EZB&amp;nbsp;</td><td>B0004DP</td><td>100 次</td></tr><tr><td>优质胎牛血清 (FBS)</td><td>WISENT</td><td>086-150</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>HRP 标记山羊抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Beyotime</td><td>A0216</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Immobilon Western 化学发光 HRP 底物&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td>2 &amp;times; 250 mL</td></tr><tr><td>甲氯芬那酸 (MA)</td><td>MCE</td><td>HY-117275</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>亚甲蓝染色液</td><td>Solarbio</td><td>G1300</td><td>0.1%，100 mL</td></tr><tr><td>尼龙转印膜</td><td>LABSELECT</td><td>TM-NY-XS-45</td><td>7.4 &amp;times; 8.5 cm，0.45 &amp;mu;m，10 片/袋</td></tr><tr><td>PBS 缓冲液（即用型干粉）</td><td>biosharp</td><td>BL601A</td><td>pH: 7.2–7.4，2 L/袋</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L5750-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>TBS 缓冲液预混干粉</td><td>Sangon</td><td>&amp;nbsp;A510025-0001</td><td>1 个（243.9 g 粉末）</td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>1&amp;times;，500 mL</td></tr><tr><td>吐温-20 (Tween-20)</td><td>Sangon</td><td>A600560-0500</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>紫外交联仪</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

检测rna整体n6-甲基腺苷修饰水平的点杂交实验

Dot Blot Assay for Detecting Global N6-Methyladenosine RNA Modification Levels

N6-甲基腺苷（m⁶A）是真核生物信使RNA（mRNA）中最丰富的内部修饰，作为转录后基因表达的关键调控因子。针对m⁶A的研究方法可在多个分辨率水平上应用，包括整体定量、特异性核苷酸检测以及特定目标转录本的分析。其中，点杂交（dot blot）检测法为全局m⁶A修饰水平的半定量评估提供了一种简便、快速且经济有效的方法。在该实验中，首先处理细胞以提取总RNA，随后对RNA进行稀释和变性。将RNA样品点样至尼龙膜上，用抗m⁶A抗体进行杂交，并通过化学发光法显影，信号强度反映甲基化修饰的相对丰度。最后，使用ImageJ软件测量灰度值，对信号强度进行定量和比较。与测序或质谱分析等方法相比，点杂交所需的仪器设备和专业技术要求较低，因此特别适用于常规筛选、初步功能研究以及比较分析。本实验方案提供了在基础研究和转化应用中实施m⁶A点杂交检测的详细且可重复的操作流程。

为严格验证点印迹杂交法的性能，并探究 SNHG21 在调控全局 m6A 水平中的作用，对 143B 细胞进行了药理学干预处理，以抑制或增强 m6A 甲基化，并在两个方向上监测 m6A 的丰度。
点印迹法定量检测整体 m6A 水平 
我们首先评估了该检测方法在抑制 m6A 甲基化后检测 m6A 水平降低的能力（图 2）。如 图 2A 所示，使用甲基转移酶抑制剂 3-DAA（100 µM，24 小时）处理后，整体 m6A 信号显著降低。单独敲低 SNHG21 即可引起基础 m6A 水平的类似程度下降，而在 shSNHG21 细胞中追加 3-DAA 处理后，信号进一步减弱。这些结果表明，该检测方法能够可靠地检测整体 m6A 水平的逐步降低（<strong class="...

本文介绍了一种利用点杂交法对整体m⁶A水平进行半定量检测的实验方案。首先提取总RNA，经变性后点样于尼龙膜上，使用抗m⁶A抗体进行杂交，再通过化学发光法显影。利用ImageJ软件进行灰度分析，量化信号强度，从而反映相对甲基化水平，为相关研究提供一种可重复的实验流程。

检测RNA整体N6-甲基腺苷修饰水平的点杂交实验

N6-甲基腺苷（m⁶A）是真核生物信使RNA（mRNA）中最丰富的内部修饰，可作为……的关键调控因子

本方案可利用微量血液实现对整体 m6A 水平的定量评估。该方案适用于 m6A 的常规筛查及初步功能验证。首先，从设定为 37 °C 的培养箱中取出含有稳定敲低 SNHG21 的阴性对照细胞以及经 3-脱氮腺苷和甲氯芬酸处理的 143B 细胞的细胞培养皿。在显微镜下确认细胞融合度约为80%至90%。移除培养基后，用1 ml PBS洗涤细胞两次。每6 cm培养皿中用1 ml胰蛋白酶替换PBS。轻轻摇晃培养皿，使胰蛋白酶均匀分布，并在室温下孵育1分钟。接着，用1 mL含有10% FBS的培养基替换胰蛋白酶溶液，以终止消化反应。用移液器反复吹打细胞悬液数次，以分散细胞。将细胞悬液转移至1.5 ml无RNase的微量离心管中。以1000 G离心3分钟，用移液器吸除上清液。进行RNA提取时，向细胞沉淀中加入RNA纯化试剂盒中的600 µL裂解缓冲液。充分涡旋以裂解细胞，并让溶液静置5分钟。5分钟后，向裂解液中加入等体积的100%乙醇，并充分涡旋。然后将600微升该混合液用移液器转移至已装配收集管的离心柱中。将离心柱在12,000 G下离心1分钟。弃去收集管中的液体。离心剩余混合物后，向旋转柱中加入500微升RNA纯化试剂盒中的洗涤缓冲液，在室温下孵育1分钟。然后在12,000 G条件下离心柱子1分钟。弃去收集管中的液体，再次离心空柱以去除残留液体。现在将离心柱转移至一个新的1.5毫升无核糖核酸酶的离心管中。打开管盖，室温晾干两分钟。向离心柱中心加入25至50 µL无酶水。室温孵育两分钟后，在12,000 ×g条件下离心一分钟，以洗脱RNA。弃去离心柱，将洗脱出的 RNA 置于冰上。接下来，使用分光光度计测定对照组和基因敲低组样品的 RNA 浓度。从每种细胞系中分别准备 1 µg 总 RNA。然后使用焦碳酸二乙酯处理水将RNA连续稀释至400纳克、200纳克和100纳克。将稀释后的RNA样本在95摄氏度下加热3分钟。立即转移至冰上冷却。进行点印迹实验时，首先在带正电荷的尼龙膜上画出参考线。用样品名称标记膜。然后，通过轻轻涡旋或移液将每个RNA样品充分混匀。然后取每种RNA样品1至2微升，点样于膜上的指定位置。将膜置于波长254纳米、能量为120毫焦耳/平方厘米的紫外交联仪中照射，以实现RNA交联。随后将膜转移至含有10 ml含吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液的培养皿中，在摇床上孵育5分钟。接下来，在使用前新鲜配制 5% 牛血清白蛋白封闭液，并将膜在室温下于封闭液中孵育 2 小时。然后将膜置于 4 摄氏度、转速为每分钟 50 转的摇床中，与抗 m6A 抗体共同孵育过夜。次日，在摇床上用 10 ml 含 Tween 20 的 Tris 缓冲盐水溶液洗涤膜 3 次，每次 10 分钟。然后在室温下用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育膜1小时。再次洗涤膜三次后，将化学发光辣根过氧化物酶底物均匀地滴加到膜上，在室温下轻轻振荡孵育1分钟。使用化学发光成像系统检测信号。使用自动曝光功能进行初步预扫描。对于亚甲蓝染色，将膜在亚甲蓝染色液中孵育1分钟。用10 ml含吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水洗涤膜三次，每次5分钟。使用图像作为上样对照。将膜置于含有1%十二烷基硫酸钠的溶液中，在摇床上脱色15分钟。然后，将获取的图像导入Image J软件并调整格式。通过选择“Process”并点击“Subtract Background”来减去背景。将半径设置为50.0像素，并启用亮背景。使用矩形工具选择分析区域。然后依次选择“分析”、“凝胶”，并选择“选择第一条泳道”来逐个定义泳道。接着依次点击“分析”、“凝胶”、“绘制泳道”，然后测量峰以生成强度分布图。测量N6-甲基腺苷和亚甲蓝信号的灰度值。将定量数据复制到表格中进行分析。通过比较信号强度来评估整体 N6-甲基腺苷修饰水平。使用甲基转移酶抑制剂 3-脱氮腺苷处理后，143B 细胞中的整体 N6-甲基腺苷信号显著降低。敲低SNHG21导致基础状态下全局N6-甲基腺苷水平出现相似程度的降低。在SHSNHG21细胞中额外加入3-脱氮腺苷处理可进一步降低全局N6-甲基腺苷信号。使用去甲基化酶抑制剂甲氯芬那酸处理可显著提高143B细胞中的全局N6-甲基腺苷水平。尽管SHSNHG 21细胞的基础N6-甲基腺苷水平较低，但在甲氯芬酸处理后，其N6-甲基腺苷水平显著升高。最重要的挑战包括膜的选择、RNA的精确稀释以及大小的均一性。通过测序实现特定状态的精确定性识别，并应用质谱特征实现全面的全局定量分析。未来的研究可探讨 m6A 机制在疾病发生和进展中的作用。

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学习使用点印分析法检测全局N6-甲基腺苷RNA修饰水平，通过143B细胞培养、RNA提取及抗体检测实现半定量评估。该方法为表观遗传学研究提供快速经济的筛选方案。

检测RNA整体N⁶-甲基腺苷修饰水平的点杂交实验

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