用于组织工程应用的人类皮肤细胞中隧道纳米管的标准化检测方法

我们开发了可靠的方法，用于检测和分析人皮肤细胞之间的隧道纳米管，并研究其在皮肤再生中的潜在作用。本方案适用于固定样品或原代人皮肤细胞，在皮肤生物学及组织再生相关研究中具有重要应用价值。

首先，在含有适当生长培养基的60毫米培养皿中解冻并培养人表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞。在复苏过程中，向角质形成细胞培养基中添加Y-27632，使其终浓度为5 µM。将所有细胞培养物置于37°C湿化培养箱中培养，直至细胞融合度达到约80%。

然后从培养皿中移除培养基。用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）短暂冲洗细胞，以在洗涤过程中维持生理 pH 值和渗透压。彻底吸除 PBS。

加入1毫升0.05%胰蛋白酶EDTA，并均匀覆盖细胞表面。将培养皿置于37摄氏度孵育1.5至2.5分钟。通过移液上下轻柔重悬细胞。

加入2 mL培养基以中和胰蛋白酶。将细胞悬液转移至15 mL离心管中，在室温下以200 ×g离心5分钟。离心结束后，弃去离心管中的上清液。

将细胞沉淀重悬于一到两毫升培养基中，并使用自动细胞计数仪进行细胞计数。随后，将12,000个真皮成纤维细胞或20,000个角质形成细胞接种至八孔细胞培养板的每个孔中，终体积为400 µL。接种后，轻轻晃动培养板以使细胞均匀分布，并将细胞置于37 °C培养箱中孵育约24小时。

孵育后，在显微镜下确认细胞融合度是否约为80%。当细胞培养达到80%融合度时，轻轻将数滴固定液直接加入培养腔室中，以对细胞进行预固定。室温孵育4分钟，确保固定液均匀覆盖，同时避免扰动细胞。

然后吸去孔中的预固定液，加入140微升新鲜的固定液一，确保完全覆盖孔的表面。将玻片在37摄氏度下孵育15分钟。接着，移除腔室孔中的固定液，并加入140微升100毫摩尔的氯化铵以淬灭残留的醛类。

将载玻片在室温下孵育10至30分钟。在室温下用PBS冲洗样品三次，每次30秒。每次冲洗时，沿腔室壁轻轻吹打缓冲液，避免冲走细胞或损伤隧道纳米管。

将细胞与140微升体积比为1:300的小麦胚芽凝集素Alexa Fluor偶联物PBS溶液在避光、室温条件下孵育20分钟，以标记质膜糖蛋白，便于观察膜源性隧道纳米管。随后用PBS洗涤细胞三次，每次30秒。

然后在避光、室温条件下，将细胞与140微升用1% BSA稀释250倍的鬼笔环肽偶联物孵育30分钟。用PBS洗涤细胞三次后，在避光、室温条件下，加入140微升DAPI溶液孵育5分钟。最后，向每个孔中加入2至3滴封片介质，在室温下孵育20分钟。

将载玻片置于 4°C 避光保存至少 20 分钟，直至成像。在真皮成纤维细胞培养物中，观察到隧道纳米管为细长的突起，连接相邻细胞，其膜由麦芽凝集素（wheat germ agglutinin）染色，F-肌动蛋白由鬼笔环肽（phalloidin）标记。在表皮角质形成细胞培养物中，也观察到具有特征性 F-肌动蛋白阳性突起的隧道纳米管连接邻近细胞。

在真皮成纤维细胞与表皮角质形成细胞的共培养体系中，通过细胞膜和细胞角蛋白5染色可 consistently 观察到真皮成纤维细胞与表皮角质形成细胞之间存在穿孔纳米管。共培养体系中的穿孔纳米管表现出多样化的细胞骨架结构，部分实例仅含有F-肌动蛋白，部分同时含有F-肌动蛋白和α-微管蛋白，或含有F-肌动蛋白并伴有部分α-微管蛋白，亦或α-微管蛋白水平较低。目前最主要的技术挑战在于如何保持穿孔纳米管的完整结构。

这需要温和的固定、适当的时间控制以及使用新鲜配制的固定添加剂。通过我们的方案，可以在不同细胞条件下测量隧道纳米管的长度，以探究其潜在功能。未来，我们将对线粒体进行荧光标记，以研究其通过隧道纳米管的转移过程。