Name: 在非炎症条件下，使用小鼠 pks+大肠杆 菌定植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-10T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 了解在非炎症条件下使用pks+大肠杆菌定植小鼠的实验方法，通过口服灌胃和菊粉饮食干预研究宿主-微生物群相互作用。该方法适用于结直肠癌相关研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由加拿大卫生研究院（CIHR，资助号 CSV-198232）提供的资助支持。我们感谢CRCHUM动物实验中心的支持。图示使用BioRender.com制作。

所有操作均在蒙特利尔大学医院研究中心（CRCHUM）机构动物护理委员会批准后，依照加拿大动物护理委员会的指南进行。实验所用七周龄小鼠购自商业来源，并在实验开始前适应环境一周。本方法的示意图见图1。本研究中使用的动物、试剂和设备的详细信息列于材料表中。
<img alt="E. coli experiment timeline, diagram of antibiotic treatment, culture preparation, oral gavage procedure." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70204/70204fig1.jpg" data-altupdatedat="1781582408000" data-alt="Figure 1"> 
图1示意图 pks+ 大肠杆菌 制备与定植 第4天（D-4）：灌胃前4天开始给小鼠服用抗生素。第1天（D-1）：灌胃前24小时撤除抗生素。准备 pks+ E. coli 过夜培养。D0：准备 pks+ 大肠杆菌 细菌接种物。给予 pks+ 大肠杆菌 或向小鼠给予溶剂对照（生理盐水） 通过 接种物制备后应尽快通过口服灌胃给予。D7+ 收集小鼠粪便，用于检测和定量分析 pks+ 大肠杆菌 定植 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70204/70204fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
1. 抗生素处理
<ol>
	<li>将氨苄青霉素、多粘菌素和链霉素溶于无菌饮水中，使其终浓度分别为氨苄青霉素 1 mg/mL、多粘菌素 1 mg/mL 和链霉素 5 mg/mL。</li>
	<li>允许 随意摄取 连续3天在饮水中给予抗生素。</li>
	<li>移除抗生素，并在灌胃前恢复无菌水供应，进行为期24小时的洗脱期 E. coli NC101 接种物 
	注意：抗生素溶液应每次实验前新鲜配制。应监测抗生素溶液的摄入量。如有必要，可向水中添加甜味剂。</li>
</ol>
2. 准备 E. coli NC101 接种物（最多 n = 12 只小鼠）
注意：步骤 2.1-2.8 应采用无菌技术操作。
<ol>
	<li>制备并高压灭菌溶菌肉汤（Lysogeny Broth, LB）。</li>
	<li>使用无菌接种环将甘油保存的 E. coli NC101 菌种划线接种至 LB 琼脂平板上。37 °C 培养过夜。</li>
	<li>用接种环挑取 LB 琼脂平板上的单菌落，接种于装有 5 mL 无菌 LB 液体培养基的培养管中。在台式恒温摇床中 37 °C、150 rpm 条件下培养过夜。</li>
	<li>在室温下以 1500 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>小心移除并弃去上清液，避免扰动管底呈乳白色沉淀状的细菌菌体沉淀。</li>
	<li>用 5 mL 0.9% 无菌生理盐水重悬细菌菌体沉淀。</li>
	<li>重复步骤 4 至 6 进行洗涤。</li>
	<li>使用细胞密度计测定 600 nm 处的光密度（OD600），并用无菌生理盐水将 OD600 调整至 0.625（约 1 × 108 CFU/只小鼠）。 
	注意：为确保步骤 3 中培养基无细菌污染，可另取 2–3 mL 无菌 LB 液体培养基于单独的培养管中过夜培养。若无菌状态良好，该培养基应保持澄清，无浑浊。若初始 OD600 小于 0.625，应重复步骤 4 至 6，并使用较小体积的生理盐水重悬菌体沉淀。为确保给予小鼠的 E. coli NC101 剂量准确，应对灌胃液进行系列稀释，涂布平板并过夜培养。根据各稀释度的菌落数，可推算出细菌悬液中的初始 CFU 数量。</li>
</ol>
3. 口服灌胃 E. coli NC101
<ol>
	<li>轻轻振荡细菌接种液，以确保细菌分布均匀。</li>
	<li>将灌胃针安装到1 mL注射器上，并吸取0.2 mL细菌接种液，排除所有气泡。</li>
	<li>将小鼠从笼中取出，用拇指指腹和食指侧面轻轻但牢固地抓握小鼠耳后至肩胛之间的皮肤以固定其头部。用同一只手的中指或无名指固定尾巴。</li>
	<li>将小鼠保持直立姿势，从口腔侧方插入灌胃针。将灌胃针尖端沿上颚滑入食道并进入胃部，同时轻轻向后推动小鼠头部以伸展颈部。若感到阻力，应立即退出灌胃针。必要时重新抓握固定小鼠后再尝试。</li>
	<li>缓慢注入细菌接种液（0.2 mL），然后沿插入时的相同角度撤出针头。</li>
	<li>将小鼠放回笼中，并对剩余小鼠进行相同操作。 
	注意：细菌接种液应在配制后尽快给予。对照组小鼠应给予0.2 mL的0.9%无菌生理盐水（载体）。灌胃针的合适长度、规格和球部直径应根据每项实验中小鼠的平均体重确定。操作后5分钟及离开动物设施前，应检查小鼠的呼吸模式和活动状态。若观察到呼吸困难或呼吸窘迫，应按照批准的方案实施安乐死。口服灌胃操作仅可由经过培训的研究人员执行。操作不当可能导致食道穿孔或将灌胃液注入肺部，从而引发严重并发症甚至死亡。由经验丰富的研究人员操作时，本程序不应导致动物死亡。本实验所用小鼠应在SPF条件下饲养。为防止笼间污染，应使用独立通风笼具，并在生物安全柜内操作小鼠。打开每个笼子前，应用适当的消毒剂（如加速过氧化氢）擦拭双手和笼盖外部。本方案中操作小鼠所需的个人防护装备（PPE）包括实验服（一次性或可重复使用）和手套。宿主动物设施可能要求额外的个人防护装备。所有涉及对照组小鼠的操作应优先进行。</li>
</ol>
4. 粪便样本的采集
<ol>
	<li>按照步骤 3.3 所述方法抓起小鼠，从每只小鼠收集一粒粪便于 1.5 mL 微量离心管中。小鼠应立即排便。或者，将小鼠放入干净的空笼中，等待最多 30 分钟以使其排便。</li>
	<li>将试管置于液氮中快速冷冻样品。将样品储存于 -80 °C，直至进一步分析。 
	注意：应在实验开始前通过实时 PCR 检测粪便中 clbA 的存在或对 clbP 进行定量，以确认小鼠未被 pks+ E. coli 定植。为了维持超过一周的定植状态，可能需要在不预先给予抗生素（步骤 2.1–3.6）的情况下重复进行细菌灌胃，具体取决于实验条件。首次实施本方案时，应至少每周通过菌落形成单位（CFU）回收法或实时 PCR 对粪便中的 E. coli NC101 进行定量，以优化给药频率。</li>
</ol>
5. 粪便细菌DNA提取
<ol>
	<li>使用DNA提取试剂盒，按照制造商说明书从收集的粪便样本中提取细菌DNA。</li>
	<li>使用分光光度计测定DNA浓度，并将DNA浓度调整至5 ng/µL。</li>
</ol>
6. 通过检测clbA和E. coli 16S基因确认定植
<ol>
	<li>使用适当的PCR预混液和仪器，按照制造商说明书，通过PCR同时扩增clbA基因和E. coli 16S核糖体RNA（rRNA）基因（补充表1）。</li>
	<li>通过琼脂糖凝胶电泳检测定植了E. coli NC101的小鼠体内clbA和E. coli 16S基因的存在，方法如先前所述19。未定植小鼠应无clbA条带。</li>
</ol>
7. 定量分析 E. coli NC101 通过菌落形成单位回收率
注意：使用无菌技术执行步骤 7.1-7.7。
<ol>
	<li>称量一个空的 1.5 mL 微量离心管。</li>
	<li>向该 1.5 mL 微量离心管中加入约 20 mg 粪便样本，并记录加入样本后管子的总重量。</li>
	<li>向每根管中加入 200 µL 0.9% 无菌生理盐水。</li>
	<li>室温下静置 10–15 分钟使粪便软化，然后以最大速度涡旋振荡每根管 5 分钟，以获得均一的悬液。未消化的食物残渣形成的细小颗粒仍可能可见。</li>
	<li>将每种悬液中的 100 µL 转移至麦康凯琼脂平板中，使用 L 形涂布棒将悬液均匀涂布。</li>
	<li>将平板在 37 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>计数粉红色菌落的数量，并根据每个粪便样本的重量和涂布体积进行标准化。 
	注意：麦康凯琼脂用于选择革兰氏阴性菌。此外，能够发酵乳糖的细菌（如 E. coli）会形成粉红色菌落，而不能发酵乳糖的细菌则形成无色或黄色菌落。本实验方案仅需计数粉红色菌落。若菌落数过多难以计数，可使用 0.9% 无菌生理盐水对初始匀浆液进行系列稀释。计算每份样本的菌落数时，需考虑稀释倍数。 
	粪便样本重量 = 含粪便样本的微量离心管重量 − 空微量离心管重量。</li>
</ol>
8. clbP 基因的定量分析
<ol>
	<li>使用适当的预混液和实时荧光定量PCR仪器，按照制造商说明书，通过定量PCR扩增clbP基因和通用16S rRNA基因（补充表1）。</li>
</ol>
9. 定量分析 肠杆菌科
<ol>
	<li>使用适当的实时荧光定量PCR预混液和仪器，通过定量PCR扩增肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和通用16S RNA基因（补充内容）。</li>
</ol>

<ol><li>Hou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiota+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Microbiota in health and diseases.</a> Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 135(2022).</li>
<li>Martin, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Escherichia+coli+adherence+and+invasion+in+Crohn%27s+disease+and+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Enhanced Escherichia coli adherence and invasion in Crohn's disease and colon cancer.</a> Gastroenterology. 127 (1), 80-93 (2004).</li>
<li>Arthur, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+Inflammation+targets+cancer-inducing+activity+of+the+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Intestinal Inflammation targets cancer-inducing activity of the microbiota.</a> Science. 338 (6103), 120-123 (2012).</li>
<li>Nougayrède, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Induces+DNA+double-strand+breaks+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Induces DNA double-strand breaks in eukaryotic cells.</a> Science. 313 (5788), 848-851 (2006).</li>
<li>Dziubańska-Kusibab, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colibactin+DNA-damage+signature+indicates+mutational+impact+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Colibactin DNA-damage signature indicates mutational impact in colorectal cancer.</a> Nat Med. 26 (7), 1063-1069 (2020).</li>
<li>Iftekhar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+aberrations+after+short-term+exposure+to+colibactin-producing+E.+coli+transform+primary+colon+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Genomic aberrations after short-term exposure to colibactin-producing E. coli transform primary colon epithelial cells.</a> Nature Commun. 12 (1), 1003(2021).</li>
<li>Yang, Y., Gharaibeh, R. Z., Newsome, R. C., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amending+microbiota+by+targeting+intestinal+inflammation+with+TNF+blockade+attenuates+development+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cancer%22%5BJournal%5D)">Amending microbiota by targeting intestinal inflammation with TNF blockade attenuates development of colorectal cancer.</a> Nat Cancer. 1 (7), 723-734 (2020).</li>
<li>Rosendahl Huber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+colibactin-induced+mutations+by+genotoxic+E.+coli+in+organoids+and+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Improved detection of colibactin-induced mutations by genotoxic E. coli in organoids and colorectal cancer.</a> Cancer Cell. 42 (3), 487-496.e6 (2024).</li>
<li>Díaz-Gay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+and+age+variations+in+mutational+processes+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Geographic and age variations in mutational processes in colorectal cancer.</a> Nature. 643 (8070), 230-240 (2025).</li>
<li>Arthur, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+genomic+analysis+reveals+the+essential+role+of+inflammation+in+bacteria-induced+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microbial genomic analysis reveals the essential role of inflammation in bacteria-induced colorectal cancer.</a> Nat Commun. 5 (1), 4724(2014).</li>
<li>Tronnet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+iron+supply+inhibits+the+synthesis+of+the+genotoxin+colibactin+by+pathogenic+Escherichia+coli+through+a+non-canonical+Fur%2FRyhB-mediated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Pathog+Dis%22%5BJournal%5D)">High iron supply inhibits the synthesis of the genotoxin colibactin by pathogenic Escherichia coli through a non-canonical Fur/RyhB-mediated pathway.</a> Pathog Dis. 75 (5), ftx066(2017).</li>
<li>Arima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western-style+diet%2C+pks+Island-carrying+Escherichia+coli%2C+and+colorectal+cancer%3A+Analyses+from+two+large+prospective+cohort+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Western-style diet, pks Island-carrying Escherichia coli, and colorectal cancer: Analyses from two large prospective cohort studies.</a> Gastroenterology. 163 (4), 862-874 (2022).</li>
<li>Oliero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligosaccharides+increase+the+genotoxic+effect+of+colibactin+produced+by+pks%2B+Escherichia+coli+strains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Oligosaccharides increase the genotoxic effect of colibactin produced by pks+ Escherichia coli strains.</a> BMC Cancer. 21 (1), 172(2021).</li>
<li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+fibre+counters+the+oncogenic+potential+of+colibactin-producing+Escherichia+coli+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dietary fibre counters the oncogenic potential of colibactin-producing Escherichia coli in colorectal cancer.</a> Nat Microbiol. 10 (4), 855-870 (2025).</li>
<li>Oliero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inulin+impacts+tumorigenesis+promotion+by+colibactin-producing+Escherichia+coli+in+ApcMin%2F%2B+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inulin impacts tumorigenesis promotion by colibactin-producing Escherichia coli in ApcMin/+ mice.</a> Front Microbiol. 14, 067505(2023).</li>
<li>Jans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colibactin-driven+colon+cancer+requires+adhesin-mediated+epithelial+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Colibactin-driven colon cancer requires adhesin-mediated epithelial binding.</a> Nature. 635 (8038), 472-480 (2024).</li>
<li>Devaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-serine+promotes+pro-carcinogenic+effects+of+colibactin-producing+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">L-serine promotes pro-carcinogenic effects of colibactin-producing E. coli.</a> Gut Microbes. 17 (1), 2515480(2025).</li>
<li>Li, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inulin+with+different+degrees+of+polymerization+protects+against+diet-induced+endotoxemia+and+inflammation+in+association+with+gut+microbiota+regulation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Inulin with different degrees of polymerization protects against diet-induced endotoxemia and inflammation in association with gut microbiota regulation in mice.</a> Sci Rep. 10 (1), 978(2020).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Oliero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putrescine+supplementation+limits+the+expansion+of+pks%2B+Escherichia+coli+and+tumor+development+in+the+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Putrescine supplementation limits the expansion of pks+ Escherichia coli and tumor development in the colon.</a> Cancer Res Commun. 4 (7), 1777-1792 (2024).</li>
<li>Jans, M., Vereecke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+drivers+of+pks%2B+E.+coli+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological drivers of pks+ E. coli in colorectal cancer.</a> Trends Microbiol. , (2025).</li>
<li>Lavelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baseline+microbiota+composition+modulates+antibiotic-mediated+effects+on+the+gut+microbiota+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Baseline microbiota composition modulates antibiotic-mediated effects on the gut microbiota and host.</a> Microbiome. 7 (1), 111(2019).</li>
<li>Russell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+housing+density+improves+statistical+power+of+murine+gut+microbiota+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Reduced housing density improves statistical power of murine gut microbiota studies.</a> Cell Rep. 39 (6), 110783(2022).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+Routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li>Harnack, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+mucosal+disruption+enables+colibactin-producing+E.+coli+to+cause+long-term+perturbation+of+colonic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Short-term mucosal disruption enables colibactin-producing E. coli to cause long-term perturbation of colonic homeostasis.</a> Gut Microbes. 15 (1), 2233689(2023).</li>
<li>Gurbatri, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tumor-colonizing+E.+coli+Nissle+1917+for+detection+and+treatment+of+colorectal+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Engineering tumor-colonizing E. coli Nissle 1917 for detection and treatment of colorectal neoplasia.</a> Nat Commun. 15 (1), 646(2024).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+expression+of+antitoxin+on+engineered+bacteria+neutralizes+genotoxic+colibactin+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surface expression of antitoxin on engineered bacteria neutralizes genotoxic colibactin in the gut.</a> Nat Microbiol. 11 (1), 53-66 (2026).</li>
<li>Tronnet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genotoxin+colibactin+shapes+gut+microbiota+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">The Genotoxin colibactin shapes gut microbiota in mice.</a> mSphere. 5 (4), (2020).</li>
<li>Condamine, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+phylogroup+and+environmental+constraints+shape+Escherichia+coli+dynamics+and+diversity+over+a+20-year+human+gut+time+series%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Strain phylogroup and environmental constraints shape Escherichia coli dynamics and diversity over a 20-year human gut time series.</a> ISME J. 19 (1), (2024).</li>
<li>Cougnoux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+genotoxin+colibactin+promotes+colon+tumour+growth+by+inducing+a+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Bacterial genotoxin colibactin promotes colon tumour growth by inducing a senescence-associated secretory phenotype.</a> Gut. 63 (12), 1932(2014).</li>
<li>Oliero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+pks+%2B+bacteria+and+enterotoxigenic+Bacteroides+fragilis+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Pathog%22%5BJournal%5D)">Prevalence of pks + bacteria and enterotoxigenic Bacteroides fragilis in patients with colorectal cancer.</a> Gut Pathog. 14 (1), 51(2022).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+commensal-encoded+genotoxin+drives+restriction+of+Vibrio+cholerae+colonization+and+host+gut+microbiome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A commensal-encoded genotoxin drives restriction of Vibrio cholerae colonization and host gut microbiome remodeling.</a> PNAS. 119 (11), e2121180119(2022).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

产大肠杆菌素的pks+ E. coli的促癌作用最近已被证实与早发性结直肠癌（CRC）发病率的上升9以及“&#34;西方化饮食&#34;”的普及密切相关12，这些因素将在未来几十年持续影响结直肠癌的发展趋势。目前大多数关于pks+ E. coli定植的研究模型均基于结肠炎相关癌症背景，无法在非炎症条件下对pks+ E. coli进行特征分析。本实验方案描述了一种在小鼠中实现pks+ E. coli定植的方法，可用于研究涉及一种与结直肠癌发生及治疗耐药相关的致病共生菌的宿主-微生物群相互作用，同时有助于探索以减轻该菌有害影响为目标的靶向性微生物群干预治疗策略20,21。
在整个实验方案中，应采取若干步骤以确保各组小鼠中 pks+ E.coli 的定植达到最佳状态。在抗生素预处理阶段，小...

肠道微生物群在宿主健康与疾病中具有重要作用，肠道菌群失调，即某些潜在致病菌（pathobionts）过度增殖，已被确认为多种疾病状态的特征，包括心血管疾病、炎症性肠病（IBD）和癌症1. 产pks大肠杆菌 是一种在炎症性肠病（IBD）患者结肠组织样本中富集的共生致病菌2 结直肠癌（CRC）3 与健康个体相比。肿瘤促进活性的 pks+ 大肠杆菌 与聚酮合酶（polyketide synthase，pks) 基因簇及基因毒素colibactin的产生4. 大肠杆菌素可转位至结肠上皮细胞的细胞核内，导致双链DNA断裂的形成5 以及结直肠癌相关关键通路中的突变6. pks+ 大肠杆菌 定植已被证明有助于肿瘤的启动7 和肿瘤进展3 在结肠炎相关性结直肠癌（CAC）的临床前模型中。最近，大肠杆菌素诱导的诱变已被关联于早发性结直肠癌8,9近年来，早发性结直肠癌（发生在50岁以下人群）的发病率持续上升，有可能逆转当前结直肠癌总体发病率下降的趋势。9.
pks+ 大肠杆菌的作用 在结直肠癌发生发展以及其他微生物群介导的宿主健康方面的作用机制仍在持续阐明中。此外，已有研究表明多种因素可产生影响 pks 基因表达，包括炎症10管腔铁浓度11以及饮食因素12,13，为靶向微生物群的干预措施开辟了道路。本文描述了一种方法 pks+ 大肠杆菌 肠道定植 通过 使用小鼠品系进行小鼠口服灌胃 pks+ 大肠杆菌 菌株 NC101（E. coli NC101）。其他模型已评估了 E. coli NC101对通过口服灌胃和直肠拭子接种的无菌（GF）小鼠炎症及致癌过程的影响3，在遗传易感性（IL-10）个体中-/-结肠炎模型3,14以及在化学诱导的结肠炎症和肠道屏障破坏模型中15然而，使用具有成本效益的方式进行定植 pks+ 大肠杆菌 在使用抗生素预处理以创造定植和扩增生态位的无特定病原体（SPF）小鼠中，也可在非炎症条件下获得14,16,17. 检测与定量的各种方法 pks+ 大肠杆菌 小鼠粪便中的结果也已展示，包括目标基因的定量PCR（qPCR）扩增 clbP 基因，通过qPCR评估该科的丰度 肠杆菌科，以及在麦康凯琼脂培养基上回收革兰阴性乳糖发酵菌的菌落形成单位（CFUs）。这些方法可互换使用或联合应用，以确认特定微生物的存在 pks+ 大肠杆菌 以及用于验证目的或评估产肠杆菌素差异的生产 pks+&#160;E. coli 针对微生物群干预措施的扩增反应。
本方案通过qPCR和CFU回收来评估膳食纤维菊粉对pks+ E. coli定植与扩增的影响。菊粉是一种益生元，已被证明可促进肠道内有益的Bifidobacterium和Lactobacillus菌种的生长，并增加短链脂肪酸的产生，后者在维持肠道稳态中发挥重要作用18。然而，研究也发现菊粉可促进pks+&#160;E. coli的生长及其colibactin的生成，从而在葡聚糖硫酸钠（DSS）处理的腺瘤性息肉病ApcMin/+结直肠癌（CRC）模型中加剧肿瘤发生。本实验旨在评估在无炎症或肠道屏障未受损的小鼠模型中，膳食菊粉对pks+ E. coli扩增的影响。

<table><tbody><tr><td>0.9% 无菌生理盐水</td><td>Baxter</td><td>JF7634</td><td></td></tr><tr><td>含10%菊粉的定制饲料</td><td>Teklad</td><td>TD.240286</td><td>代表性结果</td></tr><tr><td>无纤维、含50 ppm FeSO₄的定制饲料</td><td>Teklad</td><td>TD.120515</td><td>代表性结果</td></tr><tr><td>8–12周龄雌性B6小鼠</td><td>Charles River Laboratories</td><td>C57BL/6</td><td>代表性结果&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐&amp;nbsp;</td><td>Wisent Inc</td><td>400-110 XG</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Fisher scientific</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>细胞密度计</td><td>Biochrom</td><td>80-2116-30</td><td></td></tr><tr><td>13 mL培养管</td><td>Sarstedt</td><td>62.515.006</td><td></td></tr><tr><td>EcNC101</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>由北卡罗来纳大学教堂山分校Christian Jobin博士惠赠&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>灌胃针头，38 mm × 22 G</td><td>Harvard Apparatus Canada</td><td>34-024</td><td>已不再供应——可考虑使用Instech Labs提供的替代产品（FTP-22-38）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>恒温振荡摇床</td><td>VWR</td><td>980153</td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>Fisher scientific</td><td>22-363-595</td><td></td></tr><tr><td>L型涂布棒</td><td>Fisher scientific</td><td>14-665-230</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基&amp;nbsp;</td><td>Wisent Inc</td><td>800-060 LG</td><td>将35 g LB粉末溶于1 L水中，使用前高压灭菌。</td></tr><tr><td>LB琼脂培养基&amp;nbsp;</td><td>Wisent Inc</td><td>800-011 LG</td><td>将35 g LB粉末溶于1 L水中，使用前高压灭菌。</td></tr><tr><td>麦康凯琼脂</td><td>Becton Dickinson</td><td>211387</td><td>将50 g麦康凯粉末溶于1 L水中，使用前高压灭菌。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>微生物DNA提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>47016</td><td></td></tr><tr><td>微生物培养箱</td><td>Fisher scientific</td><td>150152633</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL微量离心管&amp;nbsp;</td><td>UltiDent Scientific</td><td>73-M150-C</td><td></td></tr><tr><td>实时PCR用Rotor-Gene条形管&amp;nbsp;</td><td>UltiDent Scientific</td><td>73-V100-RG</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>实时PCR SYBR Green预混液</td><td>ThermoFisher&amp;nbsp;</td><td>A25742</td><td></td></tr><tr><td>实时PCR仪</td><td>Corbett Research</td><td>RG-3000A</td><td></td></tr><tr><td>15 mL螺口管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>硫酸多黏菌素钠&amp;nbsp;</td><td>Fresenius Kabi</td><td>C309306</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>1 mL结核菌素注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisher scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

在非炎症条件下小鼠pks+ escherichia coli的定植

Colonization with Murine pks+ Escherichia coli under Non-Inflammatory Conditions

pks+ 大肠杆菌（Escherichia coli） increasingly 被认为与结直肠癌（CRC）的发生有关，尤其是在早发性结直肠癌年轻患者中这一亚群迅速扩大。pks+&#160;大肠杆菌菌株可产生一种基因毒素——colibactin，已知该毒素可导致 DNA 双链断裂，并在与 CRC 相关的细胞增殖和分化通路中引发突变。本文详细介绍了一种在非炎症条件下实现pks+ 大肠杆菌在小鼠体内定植的方法，涵盖细菌接种物的制备到定植效果的验证。经过过夜培养后，通过口服灌胃将pks+ 大肠杆菌菌株E. coli NC101 接种至经抗生素处理的小鼠体内。通过定量检测粪便中乳糖发酵型革兰氏阴性菌的菌落形成单位（CFUs）数量以及采用定量 PCR 扩增法来评估定植情况。利用该方案的研究显示，在成功实现E. coli NC101 菌株在 C57BL/6 小鼠体内的定植后，补充膳食纤维菊粉可促进pks+ 大肠杆菌的生长，表现为 CFUs 回收量增加、Enterobacteriaceae 科细菌丰度升高以及clbP 基因水平上升。总之，该模型可用于研究针对结直肠癌发生过程中关键致病共生菌的预防性和治疗性干预措施。

通过PCR和凝胶电泳在实验终点检测粪便中clbA和E. coli 16S基因的扩增与可视化结果显示，在定植了E. coli NC101的小鼠中两种基因均可检出，而在对照组小鼠中仅能检出E. coli 16S基因，证实E. coli NC101不存在于对照组小鼠中（图2B）。
与预期一致15，接受添加菊粉饮食的小鼠体内大肠杆菌（E. coli）NC101的定植情况显示，经过一周后，E. coli NC101 的扩增更为显著，这通过在麦康凯琼脂培养的粪便匀浆中回收的更高菌落形成单位（CFU）得以确认（图 2C），同时clbP基因水平升高（图 2D）以及肠杆菌科（Enterobacteriaceae）丰度...

本实验方案描述了在非炎症条件下使小鼠定植 pks+ Escherichia coli 所需的步骤，以及验证定植效果和评估粪便中 pks+ E. coli 扩增情况的非侵入性方法。

在非炎症条件下小鼠pks+ Escherichia coli的定植

pks+ 大肠杆菌在结直肠癌（CRC）的发生中作用日益受到关注，尤其是在一个快速增长的年轻人群亚群中……

本方案描述了在小鼠体内定植和定量PKS阳性大肠杆菌的方法，可用于研究宿主与微生物群相互作用在结直肠癌相关关键致病共生菌演化过程中的作用。与其他采用基因改造或化学诱导结肠炎症模型的方法相比，本方案描述的是在非炎症条件下的细菌定植过程。开始时，将氨苄青霉素、多粘菌素和链霉素加入容器中。然后加入无菌饮用水以稀释抗生素。将含有抗生素的饮用水提供给8至12周龄的雌性C57 BL6小鼠，持续三天。随后移除含有抗生素的饮用水，恢复供应无菌饮用水，进行24小时的洗脱期，然后进行灌胃。使用无菌接种环，从琼脂平板上挑取一株大肠杆菌 NC101 单菌落，接种于 5 mL 无菌 LB 液体培养基中。在 37°C 恒温摇床中以 150 转/分钟的转速培养过夜。随后，在室温下以 1500 ×g 离心 4 至 5 分钟。移除并弃去上清液，注意避免扰动细菌沉淀。细菌沉淀呈管底乳白色沉积物。将细菌沉淀重悬于5 mL 0.9%无菌生理盐水中。重复离心步骤，并用0.9%无菌生理盐水再次洗涤沉淀。第二次洗涤后，使用细胞密度计在600纳米处测定悬浮液的光密度。用无菌生理盐水将600纳米处的光密度调整至0.625，相当于每只小鼠约1×10⁸个菌落形成单位。根据动物的大小选择合适的灌胃针。轻轻振荡细菌接种物，以确保细菌分布均匀。用0.2毫升细菌接种物填充注射器，并排除所有气泡。将小鼠从笼中取出。用拇指指腹和食指侧面捏住小鼠耳后至肩胛部位的皮肤，固定头部。用同一只手的中指或无名指夹紧尾巴。将小鼠保持直立姿势。将灌胃针从口腔侧边插入。沿小鼠口腔顶部轻柔地将灌胃针尖端滑入食道和胃中，同时轻轻向后推动小鼠头部以伸展颈部。缓慢注入0.2毫升的细菌接种物，并以与插入时相同的角度撤出灌胃针。灌胃后观察小鼠5分钟，注意是否有呼吸困难或不适的迹象。随后将小鼠放回笼中。将动物置于添加菊粉的饮食或无纤维对照饮食中。通过如前所述的方法抓取小鼠颈背部皮肤，从每只小鼠收集粪便颗粒至1.5毫升微量离心管中。或者，将小鼠放入干净的空笼中，等待最多30分钟，直至其排便。将微量离心管置于液氮中，快速冷冻样品。如有需要，将样品在零下80摄氏度条件下冷冻，直至进一步分析。接下来，称量一个空的1.5毫升微量离心管。向1.5毫升微量离心管中加入约20毫克粪便，并记录重量。向管中加入200微升0.9%无菌生理盐水，在室温下孵育以软化粪便。10至15分钟后，以最大速度涡旋振荡管子5分钟，制成均一的悬液。未消化的食物残渣微粒可能仍然可见。取每种悬液100微升，接种于麦康凯琼脂平板上，使用L形涂布棒将匀浆均匀涂布。将平板在37摄氏度下孵育过夜。第二天，统计每块平板上粉红色菌落的数量。根据每粒粪便样本的重量和涂布体积对结肠菌落数量进行归一化处理。使用DNA提取试剂盒从粪便样本中提取基因组DNA。使用基因特异性和科特异性引物，通过定量PCR定量CLB基因和肠杆菌科的丰度。终点PCR及凝胶电泳检测结果显示，在大肠杆菌NC101定植小鼠的粪便中可同时检测到耶尔森菌素A（Colibactin A）和大肠杆菌16S基因；而在对照小鼠中仅检测到大肠杆菌16S基因，表明不存在PKS阳性大肠杆菌的定植。一周后，接受菊粉补充饮食的 E.coli NC101 定植小鼠，其粪便匀浆在麦康凯琼脂培养基上培养后回收的菌落形成单位数量高于接受无纤维对照饮食的小鼠。在同一时间点，饲喂菊粉的小鼠还表现出更高的大肠杆菌素 P 基因水平，以及比无纤维对照组小鼠更高的肠杆菌科丰度。本方案描述了多种通过细菌培养和PCR扩增来验证产PKS大肠杆菌定植及定量产PKS大肠杆菌生长的方法。该方案可与多种结直肠癌模型联合使用，以评估产PKS大肠杆菌在结肠组织中相关的诱变作用。本方案可用于研究靶向微生物群的方法，以限制产PKS大肠杆菌在健康宿主中的扩增及其诱变潜力。

colonization-with-murine-pks-escherichia-coli-under-non-inflammatory

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

在非炎症条件下，使用小鼠 pks+大肠杆 菌定植

来源：Morrill, S. R., et al. 厌氧培养细菌建立小鼠阴道定植模型。J. Vis. Exp.

建立小鼠阴道厌氧菌定植模型

来源： Taylor, M. N., 等。 利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用 视频实验杂志 (2022)本视频展示了将无菌且年龄匹配的Caenorhabditis...

评估无菌 C. elegans 中的肠道细菌定植

Citrobacter rodentium 小鼠模型：研究病原体与宿主在感染性结肠炎中的作用

小鼠鼻咽部的定植 肺炎链球菌 并描述了随后对黏附或募集细胞的提取方法。该技术包括冲洗鼻咽部并通过鼻孔收集冲洗液，适用于多种检测指标，包括差异细胞计数和mRNA表达分析。 原位.

鼻腔定植Streptococcus pneumoniae期间炎症反应的表征

本文描述了一种利用大肠埃希菌 K1（Escherichia coli...

新生大鼠中神经致病性Escherichia coli感染的非侵入性模型

在此抗原驱动的结肠炎模型中，表达红色荧光蛋白的OT-II CD4+ T细胞被过继转移至单核吞噬细胞（MPs）表达绿色荧光蛋白的RAG-/-小鼠体内。随后，用表达卵清蛋白（OVA）与青色荧光蛋白（CFP）融合蛋白的大肠杆菌（Escherichia...

开发一种抗原驱动的结肠炎模型以研究抗原呈递细胞向T细胞呈递抗原的过程

一种用于肠出血性大肠杆菌感染的 小鼠模型的详细实验方案 E. coli 使用生物发光标记细菌来研究肠出血性大肠杆菌（EHEC）定植的方法被展示。通过非侵入性方式检测这些生物发光细菌 体内...

检测小鼠体内肠出血性Escherichia coli定植的非侵入性体内生物发光系统

本方案介绍了一种利用厌氧培养的人源阴道细菌建立小鼠阴道定植模型的方法。我们主要关注Gardnerella vaginalis ，同时也提供了针对Prevotella bivia和Fusobacterium...

小鼠阴道定植的厌氧培养细菌模型

我们描述了一种从小鼠结肠隐窝中分离并建立三维结肠类器官的实验方案。所建立的结肠类器官可进一步终末分化，以模拟宿主上皮细胞的组成，随后可用于炎症刺激实验，或进一步诱导形成上皮单层细胞模型。...

研究肠道炎症对上皮的影响 体外 已建立的小鼠结肠类器官

噬菌体（phages）是一类感染细菌的病毒，是肠道微生物组的重要组成部分。尽管这些共生微生物影响着细菌的适应性和种群动态，但其对肠道稳态及疾病的影响机制仍知之甚少。本实验方案采用小鼠模型研究分离的T4噬菌体，该方法可适用于其他噬菌体-细菌组合的研究。...

T4 噬菌体与小鼠肠道内E. coli的相互作用：研究宿主-噬菌体体内动态关系的典型模型

建立小鼠阴道上行感染、早产及新生儿发病模型

了解在非炎症条件下使用pks+大肠杆菌定植小鼠的实验方法，通过口服灌胃和菊粉饮食干预研究宿主-微生物群相互作用。该方法适用于结直肠癌相关研究。

在非炎症条件下小鼠pks+ Escherichia coli的定植

探索更多视频