从小鼠肾上腺皮质建立区域富集的原代培养体系

我的研究探讨了肾上腺微环境的调控，重点关注肾上腺球状带和束状带分化及肿瘤发生过程中ACM与Wnt信号通路的作用。现有方法无法清晰区分肾上腺的不同区域。本方案可富集ZG和ZF，从而实现对不同类型细胞的研究。

该方案可用于研究球状带（ZG）和束状带（ZF）的肾上腺生理学，包括区域分带和细胞分化。为建立富集特定区域的肾上腺原代培养体系，需使用10至15只年轻的成年雄性小鼠，年龄约为6至7周。在处死小鼠后，将其置于无菌平坦表面上呈仰卧位，并用70%乙醇对动物体表毛发进行消毒。

使用剪刀在腹部腹股沟区域做初始切口。将切口向两侧横向延伸至胸部，以暴露腹膜。小心牵拉皮肤。

然后轻柔地牵拉腹壁肌肉以暴露腹腔，避免损伤血管，以保持肾上腺的清晰视野。更换手术器械以尽量减少微生物污染。在腹膜后间隙中识别左侧肾上腺，其位于左肾内侧上方，呈卵圆形，粉红色，周围被白色脂肪组织包绕。

使用钝头镊子小心移开邻近器官，以更好地暴露肾上腺。使用剪刀通过短而可控的剪切动作，去除大部分周围脂肪组织，从而分离肾上腺。避免直接夹持肾上腺，以防损伤其包膜。

将分离的肾上腺立即放入含有10毫升预温DMEM F-12培养基的P60培养皿中，直至所有样本收集完毕。接下来，识别位于右肾外侧和上方腹膜后腔的右肾上腺，需注意其邻近肝脏、升结肠及周围血管，可能增加观察难度。操作时应小心处理肾静脉和肾动脉，避免意外切割和出血。

采用与分离左侧肾上腺相同的方法分离右侧肾上腺后，将两侧肾上腺共同置于同一个培养皿中。在将肾上腺转移至超净工作台前，先用70%酒精将培养皿表面擦拭干净。随后，依次将肾上腺转移至盛有PBS的培养皿中，在25°C条件下重复洗涤三次。

最后一次洗涤后，将分离的组织收集并置于第四个培养皿中，内含预热的DMEM，以在多个腺体准备过程中保持组织活性。将肾上腺转移至滤纸上进行解剖。接着，使用精细镊子夹住附着的脂肪组织以固定肾上腺。

用受控的动作小心地在滤纸上解剖脂肪组织，避免损伤包膜。确保腺体表面光滑完整，无多余脂肪组织和结缔组织。将肾上腺小心转移至新的滤纸上，以便进行精确的显微解剖。

使用精细镊子轻轻夹住肾上腺的包膜。用手术刀片在腺体上做放射状切口，注意不要完全切断组织。施加轻微的机械压力，使皮质内部物质从切口向外挤出。

在保持包膜和球状带与镊子尖端相连的同时，暴露内部的腺体组织。将挤出的内部腺体组织确认为束状带和髓质。待所有腺体处理完毕后，再开始酶消化，以确保外层和内层区域得到充分的机械分离。

离心后，将收集的细胞重悬于培养基中。建立肾上腺细胞培养后，通过基因表达分析和免疫染色对培养细胞进行分子表征。已成功从富含球状带细胞的外层组分和富含束状带细胞的内层组分中建立了原代肾上腺细胞培养。

谱系示踪小鼠模型实现了由Cyp11b2启动子驱动的球状带特异性mGFP表达的可视化。mGFP表达主要见于富含球状带细胞的培养物中，而富含束状带细胞的培养物则主要表达mTomato。与内层细胞群培养物相比，外层细胞群培养物中Cyp11b2、Dab2和Sonic hedgehog的相对表达水平更高。

与外层组分培养物相比，内层组分培养物中 Cyp11b1 和 Akr1b7 的相对表达水平更高。醛固酮分泌在富含球状带的培养物中高于富含束状带的培养物。在外层组分培养物中，血管紧张素II、钾和促肾上腺皮质激素刺激可进一步增加醛固酮的分泌。

束状带富集培养物中的皮质酮分泌量高于球状带富集培养物。束状带富集培养物在促肾上腺皮质激素和佛司可林刺激下，皮质酮分泌增加。该方案可用于研究肾上腺皮质不同带区的特异性生理功能与分化过程，包括激素生成、信号通路及细胞外基质。

未来的研究可以探索肾上腺带状结构及分化机制，并利用这些细胞构建三维模型以研究细胞外基质相互作用。