Name: 从小鼠肾上腺皮层建立带富集初级培养物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-08T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 了解从小鼠肾上腺皮质分离并培养球状带和束状带富集原代细胞的方法。该方案通过显微解剖和二维培养技术，为研究肾上腺分区特异性信号传导与生理功能提供可靠的体外模型。

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本工作由圣保罗研究基金会（FAPESP，巴西）资助，项目编号为2024/14165–6（BEPE – JLK）、FAPESP：2020/02988–7（C.F.P.L），以及2R01DK123694（资助对象：DTB）和波士顿儿童医院内分泌科基金的支持。

所有实验均依照波士顿儿童医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准号00002611批准的方案进行。本方案所使用的所有材料（包括试剂、耗材和设备）的完整清单如下所示 材料表，以及相应的生产厂家和目录编号，以确保可重复性。
小鼠肾上腺球状带和束状带细胞的原代培养 
本研究中建立成年雄性野生型小鼠（Mus musculus，C57BL/6）肾上腺皮质细胞原代培养的方法，借鉴了最初为Sprague-Dawley大鼠开发的实验流程28。为验证球状带和束状带细胞群体的分离情况及其身份，采用谱系示踪模型，使用了Cyp11b2tm1.1(cre)Brlt/+（也称为-Cre）小鼠1,2,3,4 和 Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato-EGFP) Luo/J（也称为ROSAmT/mG）小鼠29。
操作前的准备 
材料 
两套用于浅表切口的镊子和剪刀，另备一套用于腹腔切口（补充图 1A）。将培养基和 PBS 预热至 37 °C。准备 2 个含 DMEM/F-12 培养基的培养皿（P60）。准备 3 个含预热 PBS 的培养皿，用于依次清洗腺体（洗液 1、2、3）（补充图 1B，1–3），另准备 1 个培养皿用于将肾上腺保存在溶液中（补充图 1B，4）。准备 2 个表面铺有无菌滤纸的培养皿（P60）（补充图 1C，1–2）。准备 2 个 P60 培养皿，各加入 500 µL 消化液，并标记为球状带（zG）或束状带（zF）（补充图 1D，zG，zF）。准备 2 支离心管，分别标记为 zG 和 zF，并各加入 4.5 mL 消化液。
溶液 
配制消化液时，将 I 型胶原酶（终浓度 4 mg/mL）和 DNase I（终浓度 0.04 mg/mL）溶解于 5 mL 纯 DMEM/F-12 培养基中。 使用注射器和 0.22 µM 滤器将溶液过滤至 50 mL 离心管中。 消化液应每次新鲜配制。
动物 
为获得富含小鼠肾上腺球状带和束状带细胞的原代培养物，需使用10–15只年轻的成年雄性小鼠，年龄约为6–7周。雌性小鼠的肾上腺略大于雄性，但本方案中两种性别均可使用。然而，在本研究中仅使用雄性小鼠，以避免年轻雌性小鼠中存在的X区可能带来的干扰，从而确保准确的带区分离。小鼠按照机构动物护理指南通过吸入CO₂实施安乐死。通过呼吸停止及缺乏反射反应确认死亡。在确认死亡后3–5分钟内立即解剖肾上腺，以保持组织活性。
腹部的位置与暴露 
将小鼠置于无菌平坦表面上，呈仰卧位（图1A）。用70%酒精对动物毛发进行消毒。使用镊子和剪刀进行皮肤切口，另换一套器械用于腹腔切口。首先在腹部腹股沟区域做一初始切口，向两侧横向延伸至胸部，以暴露腹膜（图1B）。仔细将皮肤向两侧牵拉，随后分离腹壁肌肉组织，以充分暴露腹腔（图1C）。初始切口应较浅，以避免损伤内脏器官。谨慎切开至肌肉层后，再逐步暴露腹腔。操作中应避免损伤血管，因为出血会影响肾上腺的定位并延迟样本采集。更换手术器械以尽量减少微生物污染。
左侧肾上腺的识别与采集 
左侧肾上腺位于腹膜后间隙，处于左肾的内侧上方，呈卵圆形，颜色为粉红色，周围被白色脂肪组织包绕（图1D–G）。使用钝头镊子小心地移开邻近器官以改善视野，用剪刀以短而可控的剪切动作去除大部分脂肪组织，从而分离出肾上腺。避免直接夹取肾上腺，以防损伤其包膜。分离后应立即将腺体置于含10 mL预热至37 °C的DMEM/F-12培养基的P60培养皿中（图1F）。
右侧肾上腺的识别与采集 
右侧肾上腺位于腹膜后腔，处于右肾的外侧和上方，呈卵圆形，颜色为粉红色（图1E–H）。由于其邻近肝脏、升结肠以及其他附近的血管结构，识别该肾上腺可能更具挑战性。在操作过程中，应使用钝头镊子小心地移开邻近器官以改善视野，同时使用剪刀以短而受控的剪切方式去除大部分脂肪组织，从而分离出肾上腺，注意避免损伤其包膜。分离后应立即将肾上腺置于含有10 mL预热至37 °C的DMEM/F-12培养基的P60培养皿中。多个肾上腺可共同置于同一培养皿中（图1F）。在操作期间，必须谨慎处理该区域的主要血管，防止意外剪断导致出血，进而增加采集难度。需特别注意的主要血管包括肾静脉和肾动脉。采集肾上腺时可保留少量附着的脂肪组织，这有助于操作过程中的 Handling，并减少包膜损伤和污染的风险（图1I）。
在无菌超净工作台中操作 
在将腺体转移至超净工作台前，用70%乙醇将培养皿擦拭干净。肾上腺在室温（25 °C）下用PBS洗涤三次（分别在1、2、3号培养皿中洗涤，收集于4号培养皿中）补充图1B）。滤纸有助于脂肪附着，并确保获得更好的结果。在制备多个腺体时，分离的组织应保存在预热的DMEM中以维持其活性。肾上腺通过附着的脂肪组织被夹住（图1I–J），并在滤纸上小心地解剖脂肪组织（补充图1C，使用精细镊子并配合受控动作小心操作，避免损伤包膜。预期结果为获得一个表面光滑、完整且无多余脂肪组织和结缔组织的腺体，如图所示 图1K. 将肾上腺小心转移至新的滤纸（补充图1C，培养皿2） 以利于精确显微解剖。用精细镊子轻轻夹住囊膜，并用手术刀片在腺体上做放射状切口，但不完全切断组织。
通过镊子施加轻微的机械压力，使皮质内部内容物从切口处向外轻轻挤出，从而暴露出来。胶囊和zG仍连接在镊子的尖端，而被挤出的内部腺体组织则对应于zF和髓质。由于外层和内层区域已通过机械方法分离，所有腺体处理完毕后才应开始酶消化（图1L）。
消化 
将两支试管标记为OF（外层组分：被膜和肾小球）或IF（内层组分：肾小球旁器和髓质）（图1M加入4.5 mL预热的消化液（37 °C），并将OF和IF转移至相应的试管中。将样品置于含5% CO₂的湿润培养箱中，于37 °C孵育30分钟，每隔10分钟轻轻晃动试管。, 通过手动翻转2–3次，确保组织均匀接触酶溶液。消化所需时间可能因胶原酶的质量、活性及其储存条件而异。. 30分钟后，使用5 mL血清移液管，以缓慢且受控的方式上下吹打40次，将组织解离成单细胞悬液。组织解离后，理想情况下应无可见的组织碎片残留，培养基应呈现浑浊状态。 如果仍有组织碎片存在，可考虑进行一次额外的15分钟消化。
洗涤与接种 
消化完成后，通过加入 45 mL DMEM/F-12 对细胞进行洗涤，以去除残留的酶（图 1 M）。样品在室温（25 °C）下以 150 × g 离心 12 分钟。离心后，预期可见少量致密的沉淀，呈微粉红色至淡黄色，而上清液应保持澄清，无可见颗粒。小心移除并弃去上清液，注意不要扰动沉淀。将沉淀用预热至 37 °C 的培养基重悬，培养基体积根据接种所需的最终体积确定（见下文）。接种时维持约 70% 的最佳密度，以确保培养物的存活率和生长活力。接种前使用 Neubauer 计数板估算细胞数量，并根据培养皿的表面积调整接种细胞数，以达到目标融合度。在 48 孔板中，将富含 zG 的外层组分（OF）细胞以每孔约 1 只动物的细胞量接种（通常获得 ~1.5–2.5 × 104 个细胞），将富含 zF 的内层组分（IF）细胞以每孔约 0.63 只动物的细胞量接种（通常获得 ~2.5–4.0 × 104 个细胞）。
细胞培养维持 
细胞在上述培养基中培养，并于37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中标准条件下维持。培养24小时后更换培养基，以去除碎片及任何残留的血细胞。此步骤有助于实现最佳生长状态。小心吸除旧培养基，加入新鲜预热（37 °C）的培养基。在进行功能实验前，至少等待48小时。建议在进行功能实验前等待三天，以确保培养物已稳定建立。若培养时间超过此期限，可能需要进行胰酶消化和传代，而这可能导致细胞筛选及原代培养特性的丧失。
数据分析与辅助步骤 
原代肾上腺细胞培养物的制备 
原代全肾上腺组织培养物的建立采用相同的组织采集、消化、洗涤和接种步骤，并作为分子和功能检测的标准对照使用。
基因表达分析 
为了从OF和IF细胞中纯化总RNA，按照试剂盒制造商的说明书，使用RNA试剂盒在TRIReagent中对培养的细胞进行匀浆。采用分光光度法评估RNA的完整性和浓度。总RNA的进一步处理包括使用高容量cDNA反转录试剂盒将其反转录为cDNA。使用热循环仪进行实时定量PCR（qPCR）进行基因表达分析。采用技术重复样本来控制变异性。使用TaqMan通用PCR主混合液和小鼠TaqMan引物（表1）。为每个重复运行的样品在扩增的线性范围内选择循环阈值（CT）。通过内源性对照基因β-actin和核糖体蛋白18S（Rps18）进行标准化。相对表达水平采用2–ΔΔCt法计算30。三次独立实验的数据以均值±标准差（SD）表示。我们共进行了三次独立实验。
原代球状带和束状带细胞培养中醛固酮和皮质酮分泌的刺激 
建立并维持球状带（ZG）和束状带（ZF）细胞的原代培养，培养条件为37 °C、含5% CO₂的湿润大气环境。使用完全生长培养基，每48孔板每孔接种约5 × 104个细胞。连续培养四天后，基础分泌量反映该时间段内激素的累积生成量。在刺激实验中，吸除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，以去除残留因子。随后，每孔加入200 µL新鲜培养基，以下实验代表在特定时间窗口内的急性刺激分泌。在醛固酮刺激实验中，培养基中添加血管紧张素II（Ang II，10 nM）、钾离子（K+，以氯化钾KCl形式加入，10 mM）和促肾上腺皮质激素（ACTH，10 nM）。氯化钠（NaCl，10 mM）作为溶剂对照。在皮质酮刺激实验中，采用相同操作步骤，但培养基中添加ACTH（10 nM）、佛司可林（forskolin，10 µM）或NaCl（10 mM）作为溶剂对照。在37 °C、5% CO₂条件下孵育6小时后，收集培养上清液，并于−80 °C保存，用于后续激素定量分析，方法如前所述31。剩余贴壁细胞经裂解提取蛋白，激素水平根据相应裂解液的总蛋白含量进行标准化处理。
醛固酮和皮质酮测定的蛋白质提取与标准化 
使用 RIPA 裂解和提取缓冲液（添加 1× halt 蛋白酶抑制剂混合物）进行蛋白质提取。用 P200 移液器吸头上下吹打 15 次重悬细胞，随后使用探头式超声仪进行超声处理。根据制造商说明书，采用 BCA 蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度。
通过放射免疫分析法（RIA）测定醛固酮 
按照生产商的说明书测定细胞培养上清液中醛固酮的浓度。简言之，将50 µL上清液和150 µL含1% BSA的PBS，连同500 µL醛固酮放射性示踪剂，加入预先包被醛固酮抗体的试管中。混匀后，试管在室温（25 °C）孵育18小时。随后倾去孵育液，使用Cobra II自动γ计数器31测定试管中的放射活性。醛固酮水平如前所述，以总蛋白量进行标准化。
皮质酮浓度测定 
采用针对小鼠和大鼠皮质酮的特异性竞争性酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，按照制造商提供的说明书检测细胞培养上清液中的皮质酮浓度。皮质酮水平经总蛋白浓度标准化，方法如前所述32。
免疫染色 
免疫荧光染色在包埋于石蜡的肾上腺组织切片以及培养于经多聚-L-赖氨酸包被的预处理玻璃盖玻片上的细胞中进行。所有样本均使用含5%正常山羊血清（NGS）的PBS进行封闭，细胞核复染采用DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚，1:1000）。每次孵育步骤之间，载玻片和盖玻片均用含0.1% Tween-20的PBS洗涤三次，每次5分钟。染色完成后，样本用抗荧光淬灭封片剂封片，并避光保存直至成像。组织切片： 肾上腺石蜡切片经二甲苯脱蜡，随后依次通过梯度乙醇溶液（100%、95%、70%）水化，最后用PBS冲洗。抗原修复在Tris-EDTA缓冲液（10 mM Tris碱，1 mM EDTA，0.05% Tween-20，pH 9.0）中进行，95 °C加热20分钟。室温冷却后，切片用PBS洗涤，并在含5%正常山羊血清（NGS）的PBS中封闭1小时。切片在含5% NGS的PBS中，以1:100稀释比例加入以下一抗，4 °C孵育过夜：小鼠抗Dab2抗体、鸡抗GFP抗体和兔抗RFP抗体。次日使用以下二抗（1:300稀释）：Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 594标记的山羊抗鸡IgY、Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG。
培养细胞：铺板后第四天对盖玻片进行免疫荧光染色。细胞用预热的4%多聚甲醛（PFA）在37 °C固定15分钟，随后用PBS洗涤三次。用含5%正常山羊血清（NGS）的PBS在室温下封闭1小时。盖玻片在4 °C用小鼠抗Dab2抗体（1:100，溶于5% NGS/PBS）孵育过夜，然后加入Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠抗体（1:500）进行孵育。
图像采集： 使用显微镜系统获取培养细胞的明场和荧光图像（mGFP 和 mTomato）。mGFP 荧光使用绿色荧光滤光镜组（激发：470 nM，发射：525 nM）采集，mTomato 荧光使用红色荧光滤光镜组（激发：585 nM，发射：624 nM）采集。
软件与统计分析 
视觉摘要、示意图和图表使用 Adobe Illustrator 2023（Adobe 公司，https://www.adobe.com/products/illustrator.html）和 BioRender（https://www.biorender.com）制作，于 2025 年 5 月访问。数据采用 GraphPad Prism 10.0 版本进行分析。获取地址：https://www.graphpad.com。所有实验均至少以三复孔进行，并独立重复多次，以确保结果的可重复性。对于两组之间的比较，采用 Student t 检验（根据情况选择配对或非配对检验）。对于三组或更多组之间的比较，采用方差分析（ANOVA），随后进行适当的事后检验，以确定组间显著性差异。结果以均值 ± 标准差（SD）表示。p 值小于 0.05 被认为具有统计学显著性。

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</ol>

作者声明，他们不存在与本研究相关的竞争性经济利益。

本研究提出了一种优化的实验方案，可建立富含小鼠肾上腺皮质球状带（zG，OF）和束状带（zF，IF）细胞的原代细胞培养体系，该体系能够真实再现各带的区域特性和类固醇生成功能。该方案有望在区域特异性的背景下深入研究肾上腺皮质的细胞与分子生物学特性，有助于探索参与肾上腺皮质发育、分化、功能及更新过程中的蛋白质、信号通路和相关机制，同时减少其他组织区域（尤其是外层部分）的干扰。二维（2D）小鼠原代肾上腺细胞培养物分别来源于富含zG细胞的OF区域和富含zF细胞的IF区域。分子表征证实了这些培养物具有不同的细胞组成，功能实验则显示其具备区域特异性的激素分泌能力以及对生理刺激的特异性反应。
分离外层区（OF）和内层区（IF）33 并建立本研究中所用原代培养细胞的方法，改编自最初在Sprague Dawley大鼠中建立的方法28，适用于Mus musculus（C57BL/6J）。通过使用ASCre/+:: R26RmTmG/+谱系示踪小鼠模...

一层薄薄的间充质被膜包裹着小鼠肾上腺，该腺体由两个主要部分组成：外层的皮质和内层的髓质。成年雄性小鼠的肾上腺皮质进一步分为两个明显不同的区域：球状带（zG）和束状带（zF），每个区域都具有独特的形态学和功能特征1,2,3,4。肾上腺皮质的主要功能是合成类固醇激素，包括盐皮质激素（醛固酮）和糖皮质激素（在小鼠中为皮质酮）5。球状带位于最外层，结构最致密，由呈玫瑰花结样排列的卵圆形细胞构成，这些细胞表达醛固酮合成酶（CYP11B2），从而能够生成醛固酮2,3,5,6,7。醛固酮的分泌主要受肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）、钾离子浓度调控，促肾上腺皮质激素（ACTH）也参与调节，但作用较弱5,8。束状带由较大的细胞组成，排列成放射状的索状或束状结构，占皮质总体积的大部分（约85%），其功能主要受ACTH调控2,3,5,9。多种信号通路通过调控前体细胞动态、皮质分区结构以及类固醇生成活性，共同协调肾上腺的发育、维持与功能。其中，SF-1（类固醇生成因子-1，Nr5a1）是关键的主调控因子，对肾上腺皮质的特化、细胞增殖和激素生成至关重要10。Sonic hedgehog（Shh）信号通路在球状带中活跃，可促进前体细胞的扩增，并支持球状带内的皮质更新11,12,13。
Wnt 信号通路，特别是经典的 β-catenin 通路，在肾上腺带状结构形成和皮质完整性中起关键作用。在小鼠中，正常的肾上腺皮质大小和带状分区由从被膜延伸至束状带（zF）的 WNT 信号活性梯度所调控。该梯度由局部表达的 WNT 配体和增强因子维持，主要包括球状带（zG）中的 WNT4，以及被膜中的 WNT2B 和 R-脊椎蛋白（RSPO1 和/或 RSPO3）7,14,15,16,17,18,19,20,21,22。肾上腺皮质通过位于被膜下/外层 zG 区域的增殖性前体细胞向心迁移而得以维持，这些前体细胞分化为成熟的 zG 细胞，并向内迁移到 zF。当细胞从 zG 迁移至 zF 时，其基因表达和功能发生改变，这一过程称为转分化。该模型已通过使用 ASCre/+ 转基因小鼠品系进行的谱系示踪研究得到有力支持，该品系可特异性标记 zG 中产生醛固酮的细胞23,24,25。
已有多种体外方法用于研究肾上腺生物学，这些方法基于对整个肾上腺的分离26,27,28。例如，一项研究描述了肾上腺皮质的分离，用于进行电生理和膜片钳分析27；另一项研究则采用分离的肾上腺皮质细胞来探究与肾上腺生理及血压调节相关的信号机制26。尽管这些方法已提供了重要的功能信息，但它们依赖于来自整个肾上腺组织的细胞，而非在细胞培养前对皮质不同区域进行分离。
鉴于肾上腺结构的复杂性和组织学多样性，明确其不同细胞区室的独特功能对于阐明肾上腺功能的潜在机制至关重要。本研究建立了富含小鼠肾上腺皮质球状带（zG）或束状带（zF）细胞的原代细胞培养体系。该方法的主要优势在于能够获得富含zG细胞的培养物，从而可通过实验手段调控信号通路和环境因素，以更深入地研究其在肾上腺皮质生物学中的特异性作用。这包括祖细胞维持、区域可塑性及向zF转分化机制的研究，以及细胞外基质成分的建模。同时，该方法还可获得高度富集的zF细胞培养物，为区域特异性的功能与信号转导研究提供了互补平台。上述特点共同构建了一个稳健且可实验调控的系统，有助于推动对肾上腺生物学的深入理解。

<table><tbody><tr><td>锥形管（50 mL）</td><td>Corning (Corning, NY, USA)</td><td>352070</td><td>无菌</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器</td><td>MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)</td><td>SLGV033RS</td><td>消化液过滤</td></tr><tr><td>10 mL 一次性注射器</td><td>BD Plastipak (Franklin Lakes, NJ, USA)</td><td>300912</td><td>无菌</td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>Corning (Corning, NY, USA)</td><td>4487</td><td>无菌</td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Corning (Corning, NY, USA)</td><td>4488</td><td>无菌</td></tr><tr><td>带滤芯移液器吸头（P200）</td><td>Axygen (Union City, CA, USA)</td><td>TF-200-R-S</td><td>无菌</td></tr><tr><td>带滤芯移液器吸头（P1000）</td><td>Axygen (Union City, CA, USA)</td><td>TF-1000-R-S</td><td>无菌</td></tr><tr><td>P60 培养皿</td><td>Corning (Corning, NY, USA)</td><td>430166</td><td>组织培养处理</td></tr><tr><td>48 孔板</td><td>Corning (Corning, NY, USA)</td><td>3527</td><td>组织培养处理</td></tr><tr><td>无菌滤纸</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>脂肪去除与解剖支撑</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 培养基</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>11320033</td><td>1:1 配方</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>10082147</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>ITS 添加剂</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>41400045</td><td>100X</td></tr><tr><td>GlutaMAX 添加剂</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>35050061</td><td>100X</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（100X）</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>15140122</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>10010023</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>I 型胶原酶</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>17100-017</td><td>组织消化</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>DN25-1</td><td>组织消化</td></tr><tr><td>血管紧张素 II（Ang II）</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>A9525</td><td>激素刺激</td></tr><tr><td>促肾上腺皮质激素（ACTH）</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>A0298</td><td>激素刺激</td></tr><tr><td>福斯高林</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>F6886</td><td>cAMP 刺激</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>P9541</td><td>醛固酮刺激</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>S7653</td><td>溶剂对照</td></tr><tr><td>小型手术剪</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, USA)</td><td>14060-09</td><td>解剖</td></tr><tr><td>带一次性刀片的手术刀</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, USA)</td><td>10003-12</td><td>显微解剖</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, USA)</td><td>11252-00</td><td>解剖</td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Fine Science Tools (Foster City, CA, USA)</td><td>11251-10</td><td>解剖</td></tr><tr><td>层流罩</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>N/A</td><td>无菌组织处理</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>N/A</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf (Hamburg, Germany)</td><td>N/A</td><td>细胞沉淀</td></tr><tr><td>Neubauer 计数板</td><td>Hausser Scientific (Horsham, PA, USA)</td><td>1490</td><td>细胞计数</td></tr><tr><td>RIPA 裂解与提取缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>89901</td><td>蛋白提取</td></tr><tr><td>Halt 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>87786</td><td>蛋白提取</td></tr><tr><td>Fisherbrand Model 120 超声破碎仪</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>FB120</td><td>超声处理</td></tr><tr><td>RIA 系统</td><td>Tecan (M&amp;auml;nnedorf, Switzerland)</td><td>MG13051</td><td>激素定量</td></tr><tr><td>Cobra II Auto-Gamma 计数器</td><td>Berthold Technologies (Bad Wildbad, Germany)</td><td>N/A</td><td>放射性测量</td></tr><tr><td>皮质酮 ELISA 试剂盒（96 孔）</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>55-CORMS-E01</td><td>激素测定</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>P36930</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>小鼠抗 Dab2 抗体</td><td>BD Biosciences (San Jose, CA, USA)</td><td>610464</td><td>一抗</td></tr><tr><td>鸡抗 GFP 抗体</td><td>Aves Labs (Tigard, OR, USA)</td><td>GFP-1020</td><td>一抗</td></tr><tr><td>兔抗 RFP 抗体</td><td>Rockland Immunochemicals (Limerick, PA, USA)</td><td>600-401-379</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠二抗</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>A-11005</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗鸡二抗</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>A-11042</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 山羊抗兔二抗</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>A-21244</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>A-11001</td><td>二抗</td></tr><tr><td>EVOS 显微镜系统</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>N/A</td><td>成像</td></tr><tr><td>TRI 试剂</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)</td><td>T9424</td><td>RNA 提取</td></tr><tr><td>Direct-zol RNA 试剂盒</td><td>Zymo Research (Irvine, CA, USA)</td><td>R2050</td><td>RNA 纯化</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)</td><td>ND-1000</td><td>RNA 定量</td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR 主混合液</td><td>Applied Biosystems (Foster City, CA, USA)</td><td>4304437</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex 热循环仪</td><td>Life Technologies (Carlsbad, CA, USA)</td><td>N/A</td><td>qPCR</td></tr></tbody></table>

从小鼠肾上腺皮质建立区域富集的原代培养体系

Establishment of Zone-Enriched Primary Cultures from the Mouse Adrenal Cortex

小鼠肾上腺由一层间充质细胞（被膜）包裹，其下方的皮质分为具有特定内分泌功能的同心环状区域：球状带（zG）分泌醛固酮，束状带（zF）分泌皮质酮。位于腺体中央的肾上腺髓质则分泌儿茶酚胺。由于缺乏针对各肾上腺皮质区域细胞的特异性研究手段，对其机制的研究一直受到限制 体外 保留其区域特异性的分子、细胞和功能特征的模型。为克服这一局限，研究人员开发了一种基于成年小鼠肾上腺显微解剖的分步分离方法。该方法将雄性小鼠肾上腺细胞分离为富含球状带（zG）的外层组分（OF），其中包含被膜和zG细胞，以及富含束状带（zF）的内层组分（IF），其中包含zF细胞和髓质细胞。这些组分被用于建立分别富集zG或zF细胞的二维（2D）原代培养体系。基因表达分析证实，zG富集的培养细胞高表达zG标志物Cyp11b2, Dab2，以及 Shh），以及Wnt/β-catenin信号通路标志物增加（Wnt4, Lef1）。相比之下，富含 zF 的培养物表现出更高的 zF 标志物表达水平（Cyp11b1 和 Akr1b7）以及Wnt/β-catenin信号通路标志物水平降低，与zF转录特征一致。类固醇生成标志物的表达（Nr5a1, 星) 验证了两种细胞组分均具有肾上腺皮质来源。酪氨酸羟化酶的存在表明在束状带富集培养物中含有肾上腺髓质细胞。功能上，球状带富集培养物在基础条件下可产生醛固酮，并在血管紧张素II、钾离子和促肾上腺皮质激素（ACTH）刺激下产量增加；相反，束状带富集培养物在基础状态下产生皮质酮，并在ACTH刺激下分泌量显著升高。总体而言，该方案具有稳健性、可重复性及生物学相关性 体外 研究肾上腺皮质生物学的模型。该系统可实现对信号通路、分子机制及生理反应的分区特异性研究。

带区富集的肾上腺原代细胞培养物的建立与表征 
成功从肾上腺外层区（OF）建立了富含球状带（zG）细胞的原代培养物，以及从中间区（IF）建立了富含束状带（zF）细胞的原代培养物。培养细胞的代表性图像如图2A （OF–zG）和图2B （IF–zF）所示。为评估这些培养物中zG细胞与非zG细胞的富集情况，采用了ASCre/+:: ROSAmTmG/+小鼠模型（图2C）。在这些小鼠中，由Cyp11b2启动子驱动的Cre重组酶可在5至6周龄动物的zG细胞中特异性诱导mGFP表达（图2C、S2A–C）。活细胞荧光成像显示，mGFP表达主要存在于富含zG细胞的培养物中（图2D–I），而富含zF细胞的培养物中mGFP信号极微弱。相反，富含zF...

建立了一种稳定且可重复的方法，用于培养富含小鼠肾上腺皮质球状带和束状带细胞的二维原代细胞体系。该体系保留了各区域关键的分子和功能特征，可支持对信号通路、激素生成及肾上腺皮质细胞行为的深入研究 离体.

小鼠肾上腺由一层间充质细胞（被膜）包裹，其下为皮质结构，皮质分为明显的同心圆状区域……

我的研究探讨了肾上腺微环境的调控，重点关注肾上腺球状带和束状带分化及肿瘤发生过程中ACM与Wnt信号通路的作用。现有方法无法清晰区分肾上腺的不同区域。本方案可富集ZG和ZF，从而实现对不同类型细胞的研究。该方案可用于研究球状带（ZG）和束状带（ZF）的肾上腺生理学，包括区域分带和细胞分化。为建立富集特定区域的肾上腺原代培养体系，需使用10至15只年轻的成年雄性小鼠，年龄约为6至7周。在处死小鼠后，将其置于无菌平坦表面上呈仰卧位，并用70%乙醇对动物体表毛发进行消毒。使用剪刀在腹部腹股沟区域做初始切口。将切口向两侧横向延伸至胸部，以暴露腹膜。小心牵拉皮肤。然后轻柔地牵拉腹壁肌肉以暴露腹腔，避免损伤血管，以保持肾上腺的清晰视野。更换手术器械以尽量减少微生物污染。在腹膜后间隙中识别左侧肾上腺，其位于左肾内侧上方，呈卵圆形，粉红色，周围被白色脂肪组织包绕。使用钝头镊子小心移开邻近器官，以更好地暴露肾上腺。使用剪刀通过短而可控的剪切动作，去除大部分周围脂肪组织，从而分离肾上腺。避免直接夹持肾上腺，以防损伤其包膜。将分离的肾上腺立即放入含有10毫升预温DMEM F-12培养基的P60培养皿中，直至所有样本收集完毕。接下来，识别位于右肾外侧和上方腹膜后腔的右肾上腺，需注意其邻近肝脏、升结肠及周围血管，可能增加观察难度。操作时应小心处理肾静脉和肾动脉，避免意外切割和出血。采用与分离左侧肾上腺相同的方法分离右侧肾上腺后，将两侧肾上腺共同置于同一个培养皿中。在将肾上腺转移至超净工作台前，先用70%酒精将培养皿表面擦拭干净。随后，依次将肾上腺转移至盛有PBS的培养皿中，在25°C条件下重复洗涤三次。最后一次洗涤后，将分离的组织收集并置于第四个培养皿中，内含预热的DMEM，以在多个腺体准备过程中保持组织活性。将肾上腺转移至滤纸上进行解剖。接着，使用精细镊子夹住附着的脂肪组织以固定肾上腺。用受控的动作小心地在滤纸上解剖脂肪组织，避免损伤包膜。确保腺体表面光滑完整，无多余脂肪组织和结缔组织。将肾上腺小心转移至新的滤纸上，以便进行精确的显微解剖。使用精细镊子轻轻夹住肾上腺的包膜。用手术刀片在腺体上做放射状切口，注意不要完全切断组织。施加轻微的机械压力，使皮质内部物质从切口向外挤出。在保持包膜和球状带与镊子尖端相连的同时，暴露内部的腺体组织。将挤出的内部腺体组织确认为束状带和髓质。待所有腺体处理完毕后，再开始酶消化，以确保外层和内层区域得到充分的机械分离。离心后，将收集的细胞重悬于培养基中。建立肾上腺细胞培养后，通过基因表达分析和免疫染色对培养细胞进行分子表征。已成功从富含球状带细胞的外层组分和富含束状带细胞的内层组分中建立了原代肾上腺细胞培养。 谱系示踪小鼠模型实现了由Cyp11b2启动子驱动的球状带特异性mGFP表达的可视化。mGFP表达主要见于富含球状带细胞的培养物中，而富含束状带细胞的培养物则主要表达mTomato。与内层细胞群培养物相比，外层细胞群培养物中Cyp11b2、Dab2和Sonic hedgehog的相对表达水平更高。与外层组分培养物相比，内层组分培养物中 Cyp11b1 和 Akr1b7 的相对表达水平更高。醛固酮分泌在富含球状带的培养物中高于富含束状带的培养物。在外层组分培养物中，血管紧张素II、钾和促肾上腺皮质激素刺激可进一步增加醛固酮的分泌。束状带富集培养物中的皮质酮分泌量高于球状带富集培养物。束状带富集培养物在促肾上腺皮质激素和佛司可林刺激下，皮质酮分泌增加。该方案可用于研究肾上腺皮质不同带区的特异性生理功能与分化过程，包括激素生成、信号通路及细胞外基质。未来的研究可以探索肾上腺带状结构及分化机制，并利用这些细胞构建三维模型以研究细胞外基质相互作用。

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生物学

从小鼠肾上腺皮层建立带富集初级培养物

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小鼠肾上腺嗜铬细胞分离

本视频介绍了从胚胎小鼠发育中的大脑皮层分离神经前体细胞的方法。展示了从子宫中取出胚胎、解剖皮层组织以及消化分离出的大脑皮层的操作过程。...

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从出生后小鼠组织中分离富集的少突胶质细胞培养物及少突胶质细胞/神经元髓鞘形成共培养物

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一只小鼠，两种培养：从单只小鼠的两个神经发生区分离与培养成年神经干细胞

视网膜色素上皮（RPE）是眼部一种具有多种功能的上皮组织。本文介绍一种从小鼠RPE中建立原代细胞培养的实验方案。...

小鼠视网膜色素上皮原代细胞培养

本文介绍一种从小鼠中分离肾上腺组织、固定组织、切片并进行免疫荧光染色的方法。...

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肾上腺皮质分泌的激素对动物抵抗应激和疾病至关重要。本文介绍了一种原代大鼠肾上腺细胞的培养方案。该方法可作为体外研究感兴趣试剂在肾上腺类固醇生成和脂质生物合成中作用机制的良好平台。...

大鼠肾上腺皮质细胞的原代培养及类固醇生成功能检测

了解从小鼠肾上腺皮质分离并培养球状带和束状带富集原代细胞的方法。该方案通过显微解剖和二维培养技术，为研究肾上腺分区特异性信号传导与生理功能提供可靠的体外模型。

从小鼠肾上腺皮质建立区域富集的原代培养体系

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