Name: 在体内的单细胞电穿孔内完整的大脑发育 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-11T18:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: 了解单细胞电穿孔技术，用于在完整大脑中对神经元进行荧光标记和活体成像。本方法以非洲爪蟾蝌蚪为模型，帮助研究者观察细胞形态和生长动态。

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作者感谢Sharmin Hossain提供了捕捉未成熟神经元生长过程的延时电影，以及Derek Dunfield提供的SCE微电极尖端的电子显微镜图像。

仪器设置：
<ol>
<li>该技术所需的电学设备包括刺激器、示波器，以及装有银丝的微电极夹持器，用于插入微移液管中。我们通常使用 Axon Instruments 的 Axoporator 800A 刺激器，但其他常见的刺激器（如 Grass Instruments SD9 刺激器）也适用于单细胞电穿孔。刺激器连接至前置放大器（headstage），后者与插入含有内充导电溶液的玻璃微电极中的银丝电极相连接。刺激器的另一根导线连接至示波器输入端，该输入端同时也接收来自蝌蚪外部接地电极的信号。蝌蚪外部接地电极是一根简单的银丝，在电穿孔过程中始终保持与蝌蚪的电紧张接触。当微电极与蝌蚪接触时，电路即告完成。 </li>
<li>单细胞电穿孔需要配备工作距离良好的显微镜（至少 5 cm），因为这为操作提供了足够的空间，并允许微电极以约 30–45 度的角度插入。</li>
</ol>
微移液管的制备：
制备合适的微电极是本方案中的关键步骤。难点在于平衡尖端的细度（直径小于1μm）与穿刺组织时不易折断之间的关系。我们还发现，尖端锥角大于10度的微电极更为理想。
<ol>
<li>准备一支拉制的玻璃微电极，其尖端直径小于1μm，尖端锥角大于10度。<ol>
<li>选用外径为1.5mm、内径为0.75mm且带有内部丝状结构的硼硅酸盐玻璃，非常适合此用途。<ol>
<li>相对较厚的玻璃可为尖端提供一定的刚性。</li>
<li>内部丝状结构有助于将回填液体向微电极尖端方向引流。</li>
</ol></li>
</ol></li>
<li>制备合适的尖端通常需要根据观察结果进行多次调整。不同组织可能需要具有略微不同形状或尖端直径的微电极。</li>
</ol>
单细胞电穿孔实验方案：
对于新用户，建议首先使用荧光葡聚糖染料，因为与基因编码的荧光蛋白不同，这类染料可在落射荧光显微镜下立即观察到。使用荧光染料可使用户直接看到微电极尖端在组织中的位置，并在电穿孔过程中即时反馈设备是否设置正确以及微电极尖端是否合适。
<ol>
<li>使用上样注射器或反向填充法将待电穿孔化合物的溶液吸入微量移液器中。 <ol>
<li>若使用质粒DNA，需确保样品无内毒素污染，浓度为1-2µg/ml，并以水配制。</li>
<li>荧光葡聚糖染料的浓度应通过实验确定。我们通常将荧光染料用水稀释至约300µM。</li>
<li>通常，0.5–1 µl 的体积已足够。</li>
<li>上样前，需将溶液高速短暂离心，以减少吸入微量移液器中的颗粒碎屑，避免堵塞。</li>
<li>移液管尖端内的气泡常会影响电流流动，因此在将移液管安装到放大器头stage之前，应用力弹击微移液管以排除气泡。</li>
</ol></li>
<li>将微量移液器插入安装在三维微操纵器上的固定夹或头架中。确保银丝电极已插入微量移液器内，并与内部溶液形成电紧张接触。</li>
<li>将蝌蚪浸入用蝌蚪培养液（Steinberg溶液，pH 7.4）配制的0.02% MS-222（3-氨基苯甲酸乙酯）中以进行麻醉。 <ol>
<li>我们通常在实验中使用44至48期的白化型非洲爪蟾蝌蚪。</li>
<li>蝌蚪通常在约5分钟后完全麻醉。</li>
<li>可同时麻醉多只蝌蚪以减少等待时间，但避免将蝌蚪暴露于MS-222超过1小时。</li>
</ol></li>
<li>使用塑料移液器将一只麻醉后的蝌蚪转移至电穿孔室中。 <ol>
<li>电穿孔室可由实验室自制，方法是在一小块Sylgard®硅胶块中雕刻出蝌蚪形状的腔室，并将一根银质接地导线插入腔内，使其与腔室中的蝌蚪样本形成电紧张接触。</li>
</ol></li>
<li>使用湿润的画笔将蝌蚪背部朝上放置。</li>
<li>将微量移液器降低至与皮肤接触，紧邻目标区域。 <ol>
<li>靶向细胞体密集区域将显著提高电穿孔的成功率。我们通常以蝌蚪视顶盖为靶区。</li>
<li>以30至45度的角度插入微量移液器。角度过小会增加皮肤穿刺难度，而角度过大会常阻碍视野。</li>
</ol></li>
<li>继续降低微量移液器将首先使皮肤表面产生凹陷，随后穿透进入下方组织。 <ol>
<li>优先选择表层细胞 体内 成像，并可通过缓慢降低微移液管尖端直至皮肤出现凹陷来实现靶向定位。</li>
</ol></li>
<li>一旦将微移液电极置入组织，应持续监测其电阻。若使用Axoporator 800A（Axon Instruments），电阻值在约10–40 MΩ范围内为最佳。电阻是判断电极尖端直径是否适用于单细胞电穿孔的良好指标。 <ol>
<li>高微移液管电阻（&gt;100 MΩ）表明吸头堵塞或微移液器吸头过窄。</li>
<li>低微移液管电阻（<3 MΩ）&lt;10 MΩ）表明尖端直径过大，通常是尖端破损所致。</li>
<li>若使用无法直接测量电阻的刺激器，可通过观察示波器测得的电压脉冲幅度来间接测定微电极电阻（下文将讨论）。</li>
</ol></li>
<li>施加电压脉冲序列。 <ol>
<li>对于质粒DNA，最有效的脉冲序列由持续时间为1 ms的负向方波脉冲组成，以300 Hz的频率递送，脉冲序列持续时间为500 ms。 <ol>
<li>脉冲电压通过经验确定，使得在示波器上测得的脉冲幅度介于0.75至1.5μA之间。</li>
</ol></li>
<li>对于荧光葡聚糖染料，以300 Hz的频率施加持续时间为300 μs的正向方波脉冲，脉冲串持续时间为10 ms。 <ol>
<li>与DNA实验方案类似，脉冲电压需通过经验确定，使在示波器上测得的脉冲幅度介于0.75至1.5μA之间。</li>
<li>可根据在落射荧光下观察到的电穿孔结果，对刺激参数进行进一步调整。 <ol>
<li>如果电穿孔后的细胞显得暗淡，应逐步增加脉冲参数，直至细胞亮度增强。</li>
<li>另一方面，如果细胞成簇被标记，则应降低脉冲参数，直至实现单个细胞的标记。</li>
</ol></li>
</ol></li>
</ol></li>
<li>收回微量移液器，重新插入组织中的另一位置，并施加电压脉冲序列。 <ol>
<li>为提高产量，我们通常在蝌蚪视顶盖的每个半球内选择多个位点进行电穿孔，各位点之间保持足够间距，以确保标记的细胞不发生重叠。</li>
</ol></li>
<li>将电穿孔后的蝌蚪转移至含有 Steinberg 培养液的容器中。 <ol>
<li>蝌蚪将在几分钟内迅速从麻醉状态恢复。</li>
</ol></li>
<li>同一根微量移液器可用于多只蝌蚪。重要的是要持续观察示波器上所显示脉冲的幅度。 <ol>
<li>如果在显著增加脉冲强度后脉冲振幅仍然较低，则可能是电极尖端堵塞所致，这种情况常在一次操作中对多个蝌蚪进行电穿孔时出现。 <ol>
<li>一种解除微量尖端堵塞的方法是在将微量移液管插入组织后施加一次正向脉冲。</li>
<li>如果无法清除堵塞，或堵塞频繁发生，请更换微量移液器。</li>
</ol></li>
<li>如果在显著降低脉冲参数后，脉冲幅度仍然非常大，则表明尖端可能已损坏，需要更换。</li>
</ol></li>
</ol>
筛选成功转染的细胞：
<ol>
<li>电穿孔后，使用直立式落射荧光显微镜对蝌蚪进行筛选，以检测标记的细胞。</li>
<li>若使用荧光染料，可在电穿孔后仅30分钟即开始对蝌蚪进行筛选。<ol>
<li>然而，我们发现较长的间隔时间与较低的背景荧光水平相关。</li>
</ol></li>
<li>对于基因编码的荧光蛋白，通常在电穿孔后至少12小时进行筛选。<ol>
<li>表达荧光蛋白的细胞会随着时间推移而逐渐增亮，因此对于荧光较弱的细胞，可在额外等待12至24小时后重新筛选。</li>
</ol></li>
<li>按照前述方法将蝌蚪麻醉后，置于Sylgard®培养皿中并加盖盖玻片。随后在落射荧光显微镜下逐个检查蝌蚪。<ol>
<li>请注意，过度暴露于落射荧光光源将导致光毒性，可能杀死被标记的细胞。因此，应尽量减少细胞暴露于荧光光照的时间。</li>
</ol></li>
<li>将蝌蚪放回盛有Steinberg's饲养液的容器中。</li>
</ol>

<ol><li>Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-cell+electroporation+for+transfer+of+DNA+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules.</a> Nature Protocols. 1, 1267-1272 (2006).</li>
<li>Dunfield, D., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Neuroscience+%284th+Ed.%29%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation.</a> Encyclopedia of Neuroscience (4th Ed.). , Elsevier, Amsterdam. In press Forthcoming.</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
</ol>

单细胞电穿孔（SCE）是一种用于确定基因功能和实现靶向遗传操作的有力工具。白化蝌蚪具有透明的身体以及易于观察的大脑结构，使其成为在活体生物中可视化神经元生长和细胞内事件的理想模型系统。SCE技术能够在整体未受干扰的大脑中，实现单个神经元生长的可视化，并进行细胞自主性的操作。虽然本视频文章展示了在非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪中进行单细胞电穿孔的操作流程，但该技术也已应用于其他生物体，并被用于海马脑片及分离的细胞培养体系中。

活体完整发育大脑中的单细胞电穿孔技术

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

单细胞电穿孔（SCE）是一种专门技术，可用于将DNA或其他大分子递送至完整组织内的单个细胞中，包括在体实验样本。该技术的显著优势在于，可在不影响周围组织的情况下对单个细胞进行实验操作，从而区分细胞自主性效应与全局处理所引发的效应。当与先进的在体成像技术结合时，荧光标记物的单细胞电穿孔可实现对细胞形态、细胞生长以及细胞内事件的直接可视化观察，时间尺度可从数秒延续至数天。尽管该技术已应用于多种在体和离体实验体系，我们已将其优化用于非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪。在本视频文章中，我们详细描述了在白化型非洲爪蟾蝌蚪完整脑内对神经元进行荧光染料或质粒DNA单细胞电穿孔的操作流程。同时讨论了提高实验效率的方法，并展示了通过SCE荧光标记神经元后进行活体双光子荧光成像的实例。

单细胞电穿孔（SCE）是一种专门技术，可用于将DNA或其他大分子递送至完整组织内的单个细胞中，包括在体实验样本。本文详细描述了在非洲爪蟾（Xenopus laevis）蝌蚪完整大脑中对神经元进行荧光染料或质粒DNA单细胞电穿孔的实验步骤。

单细胞电穿孔（SCE）是一种专门技术，可将DNA或其他大分子递送至完整组织中的单个细胞内...

单细胞电穿孔是一种特殊技术，可将DNA或其他大分子递送至完整组织中的单个细胞内，当与先进的活体成像技术结合时，亦可用于活体样本。对细胞进行荧光标记物的单细胞电穿孔，可直接可视化观察细胞形态、细胞生长以及细胞间事件，时间尺度可从数秒至数天。在本视频中，我们详细介绍了在中国台湾XUS蝌蚪完整大脑内对神经元进行荧光染料或质粒DNA单细胞电穿孔的操作步骤，并展示了荧光标记神经元的活体成像实例。哦，您好。我叫Eth Haa，我在不列颠哥伦比亚大学脑研究中心Kurt Haass博士的实验室工作。今天，我将演示如何在白化XUS Lavis蝌蚪完整大脑内对神经元进行靶向单细胞电穿孔。该技术的显著优势在于，可在对单个细胞进行实验操作的同时，保持周围组织不受干扰，从而能够区分细胞自主性效应与全局处理所引发的效应。第一步是制备具有合适尖端直径和锥角的微电极，随后将转移材料装入微电极中。然后需将TA池麻醉并转移至记录室，接着将微电极插入脑组织，并施加一系列电压脉冲。最后，使用双光子显微镜对已标记的神经元进行成像。他们将在蝌蚪中演示这一技术。单细胞标记也可应用于其他模式系统以及离体样本。基于这一考虑，让我们开始吧。单细胞电穿孔技术利用拉制的玻璃微电极毛细管，通过限制电场作用于与电极尖端接触的单个细胞，从而实现对单个细胞的靶向操作。电极尖端的物理几何形状是直接影响该技术成功与否的关键因素。使用焊料型号 P 97 拉制仪，从外径为 1.5 毫米、内径为 0.75 毫米且含有内部丝状结构的硼硅酸盐玻璃中制备微电极，该内部丝状结构有助于在无气泡的情况下填充尖端。研究发现，用于单细胞电穿孔效果最佳的微电极尖端直径为 0.5 至 1 微米，锥角大于 10 度。拉制完成后，可通过反向填充或使用装样注射器将溶液中的物质装入玻璃微电极中。在本演示中，我们将使用此处所示的荧光染料或编码GFP（绿色荧光蛋白）的质粒对单个神经元进行荧光标记。GFP绿色荧光蛋白溶液应短暂高速离心，以减少进入移液管的颗粒状杂质。由于这会增加新手操作者发生管尖堵塞的风险，因此建议初学者首先使用荧光染料，因为它们可在落射荧光下直接观察到。这可以实现对样品内移液尖端的可视化，并直接反馈设备是否已正确设置以及移液尖端是否合适。做得好。现在我们已经准备好了微量移液器，接下来可以进行单细胞电穿孔实验操作。该技术所需的电子设备包括刺激器、示波器，以及装有银丝并可插入移液管的移液管固定器。此处我们使用的是 Axon 仪器公司的 Axon Separator 800 A，但其他常见的刺激器，例如 Grass SD9，同样可以使用。Axon Separator 通过与银丝电极连接的前置放大器（head stage）与系统连接，该前置放大器在 Axon Separator 和银丝电极之间起到接口作用。蝌蚪外部接地仅是一根银丝，用于保持与蝌蚪的电接触。在电穿孔过程中，前级放大器、接地导线和蝌蚪外部接地均连接至示波器输入端。电学设备设置完毕后，即可将移液管放入移液管支架中。移液器支架应安装在三轴显微操作器上，以实现精细移动。单细胞电穿孔需要配备较大工作距离的显微镜，因为这样可提供更大的操作空间，并允许以约30至45度的角度将移液器导入。设备正确连接后，即可开始单细胞电穿孔操作。首先将蝌蚪浸入0.02% MS 222中进行麻醉，通常蝌蚪会完全麻醉。约五分钟后，将单个蝌蚪转移至电穿孔室。使用塑料移液管，可通过在小块硅胶上雕刻出蝌蚪形状的腔体，并插入一根银质接地导线，使其置于腔体内时能与蝌蚪皮肤接触，从而轻松自制该装置。接下来，使用画笔调整蝌蚪的位置，确保其背侧朝上。然后 lowering 微量移液管，直至其与目标区域附近皮肤直接接触。继续降低移液管将首先使皮肤凹陷，随后进入下方组织。此处我的目标是潮汐杆脑的视束隆起部位，具体瞄准的是细胞体层区域。如果使用的是xi，可以监测移液管在组织中的电阻。通常，电阻范围为10到约40兆欧，此范围内的电阻效果良好。移液管的电阻是判断其尖端直径是否过小或尖端是否堵塞的良好指标，若尖端过小或堵塞，则电阻会较高。相反，如果尖端直径过大或尖端破损，则移液管的电阻会偏低。需要注意的是，使用常规刺激器时无法测量移液管的绝对电阻。示波器读数是荧光葡聚糖染料移液管电阻的间接测量指标。刺激参数包括一串持续10毫秒的正向方波脉冲，以300赫兹的频率施加。每个单独脉冲持续时间为300微秒，施加电压为50伏特。使用这些参数设置，在电穿孔施加刺激后，可观察到荧光染料从尖端被释放出来。在一个位点完成操作后，需将移液管回撤，并在组织内的不同位点重复该过程，以提高标记效率。在递送电压脉冲序列期间，应通过示波器监测所产生脉冲的幅度，并在必要时将其调整至1至1.5微安之间。如果在显著增加电压后脉冲幅度仍然较低，或在操作过程中幅度下降，则强烈提示尖端可能堵塞或尖端直径过小。这种情况发生时可能令人相当沮丧。相反，如果在显著降低施加电压后幅度仍然较高，或在操作过程中幅度升高，则强烈表明尖端过宽，或尖端已断裂，或尖端发生断裂。我常常变得非常激动和伤感。如前所述，使用荧光染料的优点在于，可以立即检查在给定刺激参数下是否实现了单细胞的电穿孔。如果细胞荧光非常微弱或没有细胞被标记，则应逐步独立地增加每个刺激参数，直至标记的细胞明显亮起，像这样清晰可见的标记细胞总能让我心情愉悦。另一方面，如果观察到大量细胞被标记，则需逐步降低刺激参数，直至仅有一个细胞被强烈标记，如本例所示。观察到强烈标记的细胞令人非常满意。对于质粒DNA，所使用的脉冲序列是负向脉冲，持续时间为1毫秒，频率为300赫兹，脉冲序列持续时间为500毫秒。电穿孔后，将蝌蚪放入新鲜的饲养液中，它们会迅速从麻醉状态恢复。通常在完成50至100只蝌蚪的电穿孔后，我们即可开始对其进行筛选，接下来我将为您演示该步骤。在开始成像实验之前，使用直立式落射荧光显微镜快速筛选经过电穿孔的蝌蚪是十分有效的。为了确定哪些蝌蚪含有适合成像的神经元，需先将蝌蚪麻醉，然后置于 cigars chamber 中，并用盖玻片覆盖。随后迅速在落射荧光照明下观察单个蝌蚪的大脑，以确认是否存在单个荧光标记的神经元。需要注意的是，过度暴露于落射荧光照明下会导致光毒性，可能杀死被标记的细胞。因此，应尽量减少细胞暴露在荧光光照下的时间。对于葡聚糖染料，转染后30分钟即可进行筛选。然而，我们发现较长的时间间隔与较低的背景荧光水平相关。对于质粒DNA，筛选通常在转染后至少12小时进行。我们常规使用单细胞电穿孔技术对蝌蚪视顶盖内的神经元进行荧光标记。我们的双光子显微镜为自行搭建，由 Olympus FV 300 共聚焦显微镜和 Chameleon XP 激光光源组成。成像绿色荧光时，我们通常采用 910 纳米的激发波长。在找到一个单个标记的AL神经元的蝌蚪并将其放置在双光子成像系统上后，我们对触觉神经元进行不同时间间隔的延时成像。这使我们能够观察AL细胞树突树的动态生长模式。此处展示的是一个通过单细胞电穿孔标记的表达GFP的神经元示例。该图像采用活体双光子显微镜拍摄，用于定量分析神经元生长。通常会对每个神经元图像生成骨架化的三维重建。通过较长间隔的时间序列成像，可深入了解实验干预的长期影响。在此我们看到一个表达 GFP 的未成熟神经元，该神经元在四天内每天成像，记录了其树突分支结构的逐步发育过程。这些图像采用双光子显微镜采集，并以 Z 投影形式呈现。快速时间序列成像使我们能够观察神经元生长中更为动态的过程，包括树突丝状伪足的形成与回缩。本视频展示了一个相对成熟的表达GFP的神经元，该神经元每两分钟进行一次三维成像，持续一小时。这是一个不成熟的表达GFP的神经元示例，其在一小时内每五分钟成像一次。较年轻的神经元具有高度动态性，表现出广泛的分支生长和分支回缩。该表达GFP的神经元的放大图像显示了树突丝状伪足的持续形成与回缩，这是该系统中发育期神经元的典型特征。白化蝌蚪具有透明的身体，其脑部易于观察，因此这一模型系统非常适合在活体生物体内可视化神经元生长及细胞内事件。单细胞电穿孔技术使我们能够观察单个神经元的生长过程，并在整体未受干扰的脑组织中对特定细胞进行自主性操作。我们刚刚向您展示了如何在 zap lavis tat 极体中进行单细胞电穿孔，尽管本文主要关注在 TA 极体中的电穿孔。该技术已应用于其他生物体，也已在海马脑片和分离细胞培养物中使用。在进行该操作时，重要的是要持续调整移液器尖端和刺激参数，以保持较高的实验成功率。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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