活体完整发育大脑中的单细胞电穿孔技术

单细胞电穿孔是一种特殊技术，可将DNA或其他大分子递送至完整组织中的单个细胞内，当与先进的活体成像技术结合时，亦可用于活体样本。对细胞进行荧光标记物的单细胞电穿孔，可直接可视化观察细胞形态、细胞生长以及细胞间事件，时间尺度可从数秒至数天。在本视频中，我们详细介绍了在中国台湾XUS蝌蚪完整大脑内对神经元进行荧光染料或质粒DNA单细胞电穿孔的操作步骤，并展示了荧光标记神经元的活体成像实例。

哦，您好。我叫Eth Haa，我在不列颠哥伦比亚大学脑研究中心Kurt Haass博士的实验室工作。今天，我将演示如何在白化XUS Lavis蝌蚪完整大脑内对神经元进行靶向单细胞电穿孔。

该技术的显著优势在于，可在对单个细胞进行实验操作的同时，保持周围组织不受干扰，从而能够区分细胞自主性效应与全局处理所引发的效应。第一步是制备具有合适尖端直径和锥角的微电极，随后将转移材料装入微电极中。然后需将TA池麻醉并转移至记录室，接着将微电极插入脑组织，并施加一系列电压脉冲。

最后，使用双光子显微镜对已标记的神经元进行成像。他们将在蝌蚪中演示这一技术。单细胞标记也可应用于其他模式系统以及离体样本。

基于这一考虑，让我们开始吧。单细胞电穿孔技术利用拉制的玻璃微电极毛细管，通过限制电场作用于与电极尖端接触的单个细胞，从而实现对单个细胞的靶向操作。电极尖端的物理几何形状是直接影响该技术成功与否的关键因素。

使用焊料型号 P 97 拉制仪，从外径为 1.5 毫米、内径为 0.75 毫米且含有内部丝状结构的硼硅酸盐玻璃中制备微电极，该内部丝状结构有助于在无气泡的情况下填充尖端。研究发现，用于单细胞电穿孔效果最佳的微电极尖端直径为 0.5 至 1 微米，锥角大于 10 度。拉制完成后，可通过反向填充或使用装样注射器将溶液中的物质装入玻璃微电极中。

在本演示中，我们将使用此处所示的荧光染料或编码GFP（绿色荧光蛋白）的质粒对单个神经元进行荧光标记。GFP绿色荧光蛋白溶液应短暂高速离心，以减少进入移液管的颗粒状杂质。由于这会增加新手操作者发生管尖堵塞的风险，因此建议初学者首先使用荧光染料，因为它们可在落射荧光下直接观察到。

这可以实现对样品内移液尖端的可视化，并直接反馈设备是否已正确设置以及移液尖端是否合适。做得好。现在我们已经准备好了微量移液器，接下来可以进行单细胞电穿孔实验操作。

该技术所需的电子设备包括刺激器、示波器，以及装有银丝并可插入移液管的移液管固定器。此处我们使用的是 Axon 仪器公司的 Axon Separator 800 A，但其他常见的刺激器，例如 Grass SD9，同样可以使用。Axon Separator 通过与银丝电极连接的前置放大器（head stage）与系统连接，该前置放大器在 Axon Separator 和银丝电极之间起到接口作用。

蝌蚪外部接地仅是一根银丝，用于保持与蝌蚪的电接触。在电穿孔过程中，前级放大器、接地导线和蝌蚪外部接地均连接至示波器输入端。电学设备设置完毕后，即可将移液管放入移液管支架中。

移液器支架应安装在三轴显微操作器上，以实现精细移动。单细胞电穿孔需要配备较大工作距离的显微镜，因为这样可提供更大的操作空间，并允许以约30至45度的角度将移液器导入。

设备正确连接后，即可开始单细胞电穿孔操作。首先将蝌蚪浸入0.02% MS 222中进行麻醉，通常蝌蚪会完全麻醉。约五分钟后，将单个蝌蚪转移至电穿孔室。

使用塑料移液管，可通过在小块硅胶上雕刻出蝌蚪形状的腔体，并插入一根银质接地导线，使其置于腔体内时能与蝌蚪皮肤接触，从而轻松自制该装置。接下来，使用画笔调整蝌蚪的位置，确保其背侧朝上。然后 lowering 微量移液管，直至其与目标区域附近皮肤直接接触。

继续降低移液管将首先使皮肤凹陷，随后进入下方组织。此处我的目标是潮汐杆脑的视束隆起部位，具体瞄准的是细胞体层区域。

如果使用的是xi，可以监测移液管在组织中的电阻。通常，电阻范围为10到约40兆欧，此范围内的电阻效果良好。

移液管的电阻是判断其尖端直径是否过小或尖端是否堵塞的良好指标，若尖端过小或堵塞，则电阻会较高。相反，如果尖端直径过大或尖端破损，则移液管的电阻会偏低。需要注意的是，使用常规刺激器时无法测量移液管的绝对电阻。

示波器读数是荧光葡聚糖染料移液管电阻的间接测量指标。刺激参数包括一串持续10毫秒的正向方波脉冲，以300赫兹的频率施加。每个单独脉冲持续时间为300微秒，施加电压为50伏特。

使用这些参数设置，在电穿孔施加刺激后，可观察到荧光染料从尖端被释放出来。在一个位点完成操作后，需将移液管回撤，并在组织内的不同位点重复该过程，以提高标记效率。在递送电压脉冲序列期间，应通过示波器监测所产生脉冲的幅度，并在必要时将其调整至1至1.5微安之间。

如果在显著增加电压后脉冲幅度仍然较低，或在操作过程中幅度下降，则强烈提示尖端可能堵塞或尖端直径过小。这种情况发生时可能令人相当沮丧。相反，如果在显著降低施加电压后幅度仍然较高，或在操作过程中幅度升高，则强烈表明尖端过宽，或尖端已断裂，或尖端发生断裂。

我常常变得非常激动和伤感。如前所述，使用荧光染料的优点在于，可以立即检查在给定刺激参数下是否实现了单细胞的电穿孔。如果细胞荧光非常微弱或没有细胞被标记，则应逐步独立地增加每个刺激参数，直至标记的细胞明显亮起，像这样清晰可见的标记细胞总能让我心情愉悦。

另一方面，如果观察到大量细胞被标记，则需逐步降低刺激参数，直至仅有一个细胞被强烈标记，如本例所示。观察到强烈标记的细胞令人非常满意。对于质粒DNA，所使用的脉冲序列是负向脉冲，持续时间为1毫秒，频率为300赫兹，脉冲序列持续时间为500毫秒。

电穿孔后，将蝌蚪放入新鲜的饲养液中，它们会迅速从麻醉状态恢复。通常在完成50至100只蝌蚪的电穿孔后，我们即可开始对其进行筛选，接下来我将为您演示该步骤。在开始成像实验之前，使用直立式落射荧光显微镜快速筛选经过电穿孔的蝌蚪是十分有效的。

为了确定哪些蝌蚪含有适合成像的神经元，需先将蝌蚪麻醉，然后置于 cigars chamber 中，并用盖玻片覆盖。随后迅速在落射荧光照明下观察单个蝌蚪的大脑，以确认是否存在单个荧光标记的神经元。需要注意的是，过度暴露于落射荧光照明下会导致光毒性，可能杀死被标记的细胞。因此，应尽量减少细胞暴露在荧光光照下的时间。

对于葡聚糖染料，转染后30分钟即可进行筛选。然而，我们发现较长的时间间隔与较低的背景荧光水平相关。对于质粒DNA，筛选通常在转染后至少12小时进行。

我们常规使用单细胞电穿孔技术对蝌蚪视顶盖内的神经元进行荧光标记。我们的双光子显微镜为自行搭建，由 Olympus FV 300 共聚焦显微镜和 Chameleon XP 激光光源组成。成像绿色荧光时，我们通常采用 910 纳米的激发波长。

在找到一个单个标记的AL神经元的蝌蚪并将其放置在双光子成像系统上后，我们对触觉神经元进行不同时间间隔的延时成像。这使我们能够观察AL细胞树突树的动态生长模式。此处展示的是一个通过单细胞电穿孔标记的表达GFP的神经元示例。

该图像采用活体双光子显微镜拍摄，用于定量分析神经元生长。通常会对每个神经元图像生成骨架化的三维重建。通过较长间隔的时间序列成像，可深入了解实验干预的长期影响。

在此我们看到一个表达 GFP 的未成熟神经元，该神经元在四天内每天成像，记录了其树突分支结构的逐步发育过程。这些图像采用双光子显微镜采集，并以 Z 投影形式呈现。快速时间序列成像使我们能够观察神经元生长中更为动态的过程，包括树突丝状伪足的形成与回缩。

本视频展示了一个相对成熟的表达GFP的神经元，该神经元每两分钟进行一次三维成像，持续一小时。这是一个不成熟的表达GFP的神经元示例，其在一小时内每五分钟成像一次。较年轻的神经元具有高度动态性，表现出广泛的分支生长和分支回缩。

该表达GFP的神经元的放大图像显示了树突丝状伪足的持续形成与回缩，这是该系统中发育期神经元的典型特征。白化蝌蚪具有透明的身体，其脑部易于观察，因此这一模型系统非常适合在活体生物体内可视化神经元生长及细胞内事件。单细胞电穿孔技术使我们能够观察单个神经元的生长过程，并在整体未受干扰的脑组织中对特定细胞进行自主性操作。

我们刚刚向您展示了如何在 zap lavis tat 极体中进行单细胞电穿孔，尽管本文主要关注在 TA 极体中的电穿孔。该技术已应用于其他生物体，也已在海马脑片和分离细胞培养物中使用。在进行该操作时，重要的是要持续调整移液器尖端和刺激参数，以保持较高的实验成功率。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。