一种优化的用于研究真菌致病机制与宿主防御的Candida albicans感染Schmidtea mediterranea实验方案

我的研究聚焦于白色念珠菌感染，以及宿主反应如何决定感染结局是被清除还是进展为疾病。一个关键挑战是缺乏可用于早期真菌感染研究的模型。本实验方案采用涡虫作为可操作性强、通量高的解决方案。

涡虫系统能够实现对疾病发生、发展、清除及致死性的研究，并可高分辨率地检测先天免疫反应。开始时，在体视显微镜下选择体长约五毫米的地中海涡虫（Schmidtea mediterranea），测量前需确保动物完全伸展。避免使用小于五毫米的涡虫，因其可能含有具有再生芽团或发育不完全的个体，可能导致实验结果不一致。

同时，排除体长超过五毫米的涡虫，因为较大的个体不太适合进行荧光免疫染色。排除具有再生芽、组织缺乏色素或色素发育不完全的个体。将符合所有纳入标准的健康涡虫转移至未经组织培养处理的六孔聚苯乙烯板中，每孔加入两毫升新鲜涡虫培养用水。

设置阴性对照孔，包含未感染或模拟处理的动物，以及阳性对照孔，包含感染了野生型白色念珠菌（Candida albicans）的动物。将每孔中的水全部移除，并替换为两毫升新鲜的涡虫培养用水，以确保各孔条件一致。在感染前，让动物在新环境中适应一天。

倾斜六孔板，使用无菌技术逐个轻轻移除一个孔中的全部水分。立即向孔中加入计算好的涡虫培养用水和白色念珠菌培养物的体积，然后进行下一个孔的操作。记录接种的日期和时间。

将接种后的六孔板置于室温下避光、静置处。根据所需实验终点，用白色念珠菌感染涡虫培养最多72小时。在第一个时间点，即感染后24小时，轻轻倾斜培养板。

然后，使用无菌移液管吸取含有白色念珠菌培养物的液体，轻轻将其滴加到孔中无生物区域，以混匀已沉降的真菌层。每孔重复此操作5至10次，以打散沉降的真菌层，避免直接接触涡虫。在重悬操作前后，应在深色背景下观察真菌的沉降情况，以获得最佳可视效果。

在相同条件下重悬未感染的对照孔。在感染后48小时重复此操作。在感染后72小时，将涡虫转移至含有两毫升清洁水的新孔中，转移时尽量减少液体量以降低真菌残留。

动物转移后，移除所有水并更换为新鲜的涡虫培养水。从感染后第一天开始评估宿主结果，并持续每日观察，直至达到预期的实验终点。使用标准化的0到3分评分系统对宿主损伤进行定量评估。

感染后第三天，将涡虫轻柔转移至新的六孔板中，每孔加入两毫升新鲜涡虫培养水，注意避免带入残留的真菌培养物。使用光学显微镜（物镜倍数至少10倍）观察动物状态。采用标准化评分表记录宿主的实验结果。

此外，可进行抗白色念珠菌免疫染色，以观察感染及清除过程中真菌对宿主上皮的定植情况。在感染后第四天，真菌对上皮的定植显著减少；感染后第七天，在ID50条件下，几乎所有与表面相关的真菌均被清除。未感染的对照组始终完全无症状。

在每毫升约 7.0 × 10⁷ 个白色念珠菌细胞时，约 30% 为无症状，50% 为有症状，20% 已死亡。在每毫升约 8.0 × 10⁷ 个白色念珠菌细胞时，约 30% 为无症状，20% 为有症状，50% 已死亡。中位生存率从每毫升 7.0 × 10⁷ 个细胞时的约 90% 下降至每毫升 8.0 × 10⁷ 个细胞时的约 50%，并在每毫升 8.5 × 10⁷ 个细胞时降至 25% 以下。

在感染野生型白色念珠菌（浓度约为每毫升8.0 × 10⁷个细胞）的涡虫中，总体生存率约为50%，而未感染的对照组生存率为100%。该实验方案通过在遗传背景可控的宿主中整合成像与分子生物学方法，实现了对宿主-病原体相互作用动态过程的体内研究。未来可应用于高通量突变体筛选、不同微生物物种间的比较研究，以及毒理学和药物疗效测试的适应性拓展。