Name: 单纤维分离测定法用于评估氧化性肌纤维行为 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 学习从小鼠比目鱼肌分离完整单肌纤维的方法，用于肌肉生物学和神经肌肉疾病研究。该优化方案通过调整胶原酶浓度和消化时间，减少纤维损伤并提高产量，支持免疫标记和卫星细胞扩增应用。

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本研究得到了科学技术创新大学奖学金（JST，授予T.H.的资助编号JPMJFS2139）以及日本促进科学基金（JSPS）的资助（授予N.L.F.的KAKENHI 23H00457、授予Y.Mi.的20J12849、授予Y.Ma.的24K22254）。本研究还得到了东京都政府先进研究基金[R2-2]（授予Y.Ma.和N.L.F.）以及东京都立大学创新研究项目战略研究基金[R3]（授予N.L.F.）的支持。感谢Yasuro Furuichi提供的建议和有益的评论。

所有动物均饲养于东京都立大学动物实验中心（许可证编号：A4-4、A5-9、A6-7、A7-018）。所有动物均在无特定病原体（SPF）条件下维持饲养。本研究中的动物操作及实验程序严格遵循东京都立大学安全与伦理委员会的指导方针。
1. 试剂准备
<ol>
	<li>全程佩戴手套。在25 mL离心管中，用高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）+ GlutaMAX配制含1%青霉素-链霉素-两性霉素B混合液（AB）的0.5% I型胶原酶溶液。待胶原酶充分溶解后（必要时可轻弹管壁），通过0.22 µm低蛋白结合滤膜过滤，对溶液进行灭菌。 
	注意：2.5 mL胶原酶溶液足以处理两只小鼠的腓肠肌（每只小鼠一块腓肠肌）。</li>
	<li>在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制10 mL 5%牛血清白蛋白（BSA）溶液。于60 °C加热灭活30分钟，然后通过0.22 µm低蛋白结合滤膜过滤。 
	注意：PBS中的5% BSA溶液可在4 °C保存最多10天。</li>
</ol>
2. 比目鱼肌的解剖
<ol>
	<li>准备肌肉解剖所需的器材（图1A）。</li>
	<li>通过腹腔注射三重麻醉混合液（0.5 mL/g 体重）对 C57BL/6 小鼠进行麻醉，混合液包含 1 mg/mL 盐酸美托咪啶、5 mg/mL 咪达唑仑和 5 mg/mL 酒石酸布托啡诺，随后通过颈椎脱位处死小鼠。</li>
	<li>在后肢进行连续的皮肤切口并剥离皮肤，去除表面筋膜。</li>
	<li>将趾长屈肌（PLA）肌腱与腓肠肌（GAS）和比目鱼肌（SOL）的肌腱束分离，从 PLA 肌腱处轻轻牵拉以完整取出 PLA（图1B）。</li>
	<li>切断 GAS 和 SOL 的肌腱束以暴露肌肉，在 GAS 与 SOL 的近端肌腱之间的间隙插入一根针（图1C）。</li>
	<li>小心将针向远端滑动，以分离比目鱼肌和腓肠肌（图1D）。在踝关节附近放置第二根针以固定后肢，防止解剖过程中移动。</li>
	<li>从 GAS 一侧切断肌腱束（图1E）。</li>
	<li>将 SOL 置于 GAS 上，小心调整 SOL 的位置以暴露其近端肌腱，并使用显微剪刀将其剪断（图1F）。</li>
	<li>将 SOL 放置在解剖台上，并去除残留的肌腱（图1G）。 
	注：此步骤为可选步骤；残留肌腱不影响实验结果。</li>
</ol>
3. 消化比目鱼肌
<ol>
	<li>将完整的比目鱼肌转移至含有已配制0.5%胶原酶溶液的25 mL离心管中，在37 °C下孵育130分钟。 
	注意：每15–20分钟可手动振荡样品，以轻微分离肌纤维并促进胶原酶活性。</li>
</ol>
4. 在体视显微镜下分离单根肌纤维
<ol>
	<li>截取两根巴斯德吸管，制成一根具有宽口径和一根具有窄开口的吸管（图2A）。在火焰下灭菌并使切口平滑，以避免在吹打过程中损伤肌纤维。</li>
	<li>为防止分离过程中纤维粘附，用5% BSA/PBS包被巴斯德吸管以及三个50 mm的培养皿。 
	注意：整个分离步骤中均使用体视显微镜（图2B）。</li>
	<li>肌肉消化完成后，弃去多余的胶原酶溶液，将比目鱼肌转移至第一个含有含1%抗生素的DMEM的培养皿中（图2C）。</li>
	<li>使用宽口径巴斯德吸管轻轻上下吹打，以解离肌纤维（图2D）。</li>
	<li>用窄口径巴斯德吸管沿肌纤维长度方向将完整单根纤维转移至第二个培养皿中。在此过程中可同时去除碎片和/或皱缩的纤维（图2E、F）。</li>
	<li>使用窄口径巴斯德吸管将高质量（全长/完整）的单根纤维转移至第三个培养皿中，以确保纯度（图2G、H）。</li>
	<li>将纤维收集至经BSA包被的25 mL离心管中。轻轻搅拌悬液，然后在室温下静置5分钟，使纤维沉淀至管底。</li>
	<li>使用窄口径巴斯德吸管小心弃去上清液，去除残留的碎片，保留约500 µL含1%抗生素的DMEM溶液。此沉淀物中将含有高度纯化的单根肌纤维群体（图2G、H）。 
	注意：该技术可获得&#62; 300根单根肌纤维，可用于后续蛋白质和mRNA的提取与分析。</li>
</ol>
5. 从比目鱼肌纤维建立高纯度成肌细胞培养物
<ol>
	<li>将Matrigel基质稀释至0.1 mg/mL，并用其包被一个100 mm的培养皿。将培养皿在37 °C孵育30–60分钟，直至包被均匀聚合。</li>
	<li>向肌纤维悬液中加入等体积的Accutase，在室温下孵育10分钟。随后加入10 mL生长培养基（由无葡萄糖DMEM、30%胎牛血清、1% GlutaMAX、1%鸡胚提取物（CEE）、1%抗生素-抗真菌剂（AB）和0.01 µg/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）组成）44。 
	注意：此处等体积的Accutase指第4.8节中所述的500 µL。Accutase有助于温和地解离肌纤维，促进卫星细胞的释放，从而支持后续成肌细胞培养的扩增。</li>
	<li>将10 mL经Accutase处理的肌纤维悬液转移至Matrigel包被的培养皿中。每100 mm培养皿中约添加4根单纤维/cm2。确保纤维在培养皿内均匀分布。</li>
	<li>在培养基中培养3天后，可观察到成肌细胞克隆。每日更换生长培养基，直至成肌细胞达到所需数量。通常在第6天，成肌细胞培养物即可达到实验阶段所需的汇合度（图3A）。</li>
	<li>使用胰蛋白酶（Trypsin）将成肌细胞从原始培养皿中解离，并在37 °C孵育2分钟。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并根据孔板尺寸及成肌分化所需细胞汇合度进行接种。 
	注意：对于100 mm培养皿，加入1 mL胰蛋白酶。</li>
</ol>

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作者声明无任何利益冲突。

从比目鱼肌（SOL）中分离大量肌纤维的第一个关键是，在解剖过程中保持肌肉的结构完整性。如果比目鱼肌的肌外膜被撕裂，或在解剖过程中用力牵拉肌肉，尤其是沿其纵轴方向施加拉力，则分离的产量将严重受损。这些解剖错误通常在事后容易识别。事实上，经过胶原酶消化后，肌肉会均匀收缩，形成白色、致密的团块。在这种情况下，仅能解离出极少量的活细胞纤维。
成功分离比目鱼肌的第二个决定性因素是I型胶原酶消化的效率。当胶原酶作用最佳时，在前10次冲洗过程中可获得约100–200根比目鱼肌纤维。相反，当消化效果不理想时，即使在前20次冲洗后，获得的肌纤维数量仍少于50根。 可能会释放出纤维。为了获得更高的纤维得率，需要更充分的冲洗以及增加冲洗次数。然而，由于SOL纤维极为脆弱，这通常会导致冲洗过程中纤维收缩。
为了建立纯的比目鱼肌来源的原代成肌细胞培养，胶原酶消化再次发挥关键作用。当消化充分时，较少的肌纤维会残留在组织碎片上，将肌纤维转移至培养基后可使成纤维细胞污染降至最低。相反，如果比目鱼肌消化不充分，分离的肌纤维仍会附着在残留组织上，导致成肌细胞培养物被成纤维细胞污染。研究人员应观察接种细胞样本中成纤维细胞污染的典型特征；这些特征包括细胞体积明显更大，并具有广泛的细胞骨架突起，而贴附在Matrigel包被培养皿上的卫星细胞则体积小得多，呈纺锤形。若发生污染，研究人员可采用其他文献所述的预贴壁步骤45。简言之，卫星细胞在分离后培养3天，然后用胰蛋白酶消化，并短暂预贴壁于胶原蛋白包被的培养皿中。在15–30分钟的孵育期间，成纤维细胞会贴壁，而卫星细胞仍保持悬浮状态，随后被转移至新的Matrigel包被培养板中。
如上所述，并与我们的经验一致，比目鱼肌（SOL）纤维比趾长伸肌（EDL）和趾短屈肌（FDB）的纤维更长且更脆弱。这使得使用巴斯德吸管转移纤维变得困难。必须沿纤维的纵轴方向吸取，而不能从中间吸入；否则，纤维会在应力作用下发生折叠和收缩。除了直接决定纤维分离是否成功的几个关键因素外，还有一些额外的技术步骤对于提高比目鱼肌纤维的得率至关重要。其中之一是将所有巴斯德吸管、培养皿和收集管用5% BSA进行包被。这可以防止新解离的肌纤维黏附于器皿表面，从而避免纤维折叠和后续收缩。建议每次分离肌肉样本时都准备新的经热灭菌并用BSA包被的巴斯德吸管。或者，研究人员也可准备一套用于长期使用的巴斯德吸管。若如此操作，则每次使用前均需重新进行热灭菌，并重新用BSA新鲜包被。
传统的单肌纤维分离方案主要针对趾长伸肌（FDB）和趾短伸肌（EDL）等糖酵解型肌肉进行了优化37。然而，氧化型肌肉（如比目鱼肌SOL）在结构上具有显著差异。转录组学分析表明，SOL与EDL在细胞外基质（ECM）相关基因的表达上存在差异46，其中包括编码骨骼肌细胞骨架连接蛋白——抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的基因44。因此，使用0.2%（2 mg/mL）胶原酶消化60–90分钟的标准EDL肌肉处理条件并不适用于SOL肌肉，常导致消化后形成致密的纤维束或纤维皱缩。在本研究中，我们优化了多个关键步骤，以使该方案适用于氧化型SOL肌肉。通过将I型胶原酶浓度调整为0.5%（5 mg/mL），延长孵育时间至130分钟，并在洗涤过程中尽量减少机械应力，可从单只小鼠稳定获得300–500根完整的肌纤维。与EDL相比，SOL样本的纤维数量和得率仍较低（EDL可获得&#62; 500根纤维）；然而，我们所获得的SOL肌纤维在数量上稳定，且更重要的是质量高，适用于免疫标记和免疫印迹等下游实验。尽管本研究中的免疫印迹结果来自合并的单根纤维样本，但本报告所介绍的技术能够可靠地分离出完整的单根肌纤维，使其适用于在单纤维分辨率下进行免疫印迹、蛋白质组学和RNA测序47等分析。本领域的研究人员可利用该技术研究氧化型与糖酵解型肌纤维之间的代谢和收缩特性差异。
总体而言，本方案提供了一种可重复且易于操作的方法，用于从比目鱼肌中分离完整的氧化型肌纤维，从而扩展了研究肌纤维类型特异性生理学及分子机制的可用工具。

骨骼肌是人体中最丰富的组织，约占总体重的40–50%1。骨骼肌以糖原的形式作为能量储存库。在寒冷暴露时，它通过产热作用提供热量，并且重要的是提供运动功能。骨骼肌由多核的、终末分化的肌纤维组成。为了维持肌肉的成熟与修复，新的肌核由骨骼肌内的成体干细胞——卫星细胞（SC）生成。SC位于出生后骨骼肌纤维的周围区域2,3,4。SC可通过转录因子Pax7进行鉴定，该因子在静息态和激活态中均有表达3,5。在损伤或肥大刺激下，SC被激活并上调MyoD，进入肌源性程序，增殖，并最终与已有的或新生的肌纤维融合，以恢复肌肉功能6,7,8。SC在干性能力、胚胎起源（体节来源与非体节来源）、出生后发育阶段（年轻与年老）以及肌肉组成（快肌与慢肌纤维）方面均具有异质性9,10,11。
根据身体部位的不同，骨骼肌会相应地调整其能量和功能需求。这种肌纤维的异质性得益于其收缩能力和氧化能力。实际上，肌纤维由慢缩氧化型纤维（称为I型和IIa型）以及快缩糖酵解型纤维（在啮齿类动物中称为IIx型和IIb型）组成12,13。这种精妙的功能性纤维类型镶嵌结构使我们能够在日常生活中自由活动。例如，像比目鱼肌（SOL）和竖脊肌这样的姿势肌处于持续的低水平激活状态，因此含有较高比例的慢缩氧化型I型和IIa型肌纤维。相反，作用时间短但快速的肌肉，如趾长伸肌（EDL），主要由糖酵解型IIx型和IIb型纤维构成。然而，肌纤维的组成并非固定不变；相反，肌纤维是动态结构，能够根据其所承受的功能需求从快缩型向慢缩型转变，或反向转变。不同类型肌纤维收缩能力的差异源于肌球蛋白含量的不同。肌球蛋白是骨骼肌中的主要蛋白质，由肌球蛋白轻链和重链的同工型组成12,14。
在肌节（肌肉中产生力量的最小功能单位）内，肌球蛋白头部与肌动蛋白相互作用，形成称为横桥的结构。通过ATP的水解，肌球蛋白与肌动蛋白相互作用的循环释放能量15,16。肌球蛋白重链（MyHC）是用于肌纤维类型鉴定的最合适标志物12,13。根据所表达的MyHC同工型不同，肌肉收缩速率也会有所差异。如前所述，I型纤维为慢缩氧化型纤维，而II型纤维则不同。以I型纤维为主的肌群含有更丰富的氧化酶，线粒体含量更高，并具有密集的毛细血管网络以灌注肌肉17,18（可联想马拉松运动员）。I型纤维由MYH7基因编码13,19。II型纤维易疲劳，含有较高比例的糖酵解酶，且具有更高的最大缩短速度，因此适合短时间爆发性力量或运动（可联想举重运动员）。IIa、IIx和IIb型（在啮齿类动物中）纤维分别由MYH2、MYH1和MYH4基因编码20,21。毫不奇怪，任何影响肌肉完整性的病理生理损伤都会改变肌纤维类型的组成，进而对肌肉功能产生不利影响，可能降低生活质量。事实上，许多肌营养不良症起源于卫星细胞（卫星细胞病）或肌纤维本身（运动神经元或肌肉组织来源），并可导致肌纤维类型组成发生改变22,23,24,25。例如，脊髓损伤、卧床研究以及太空飞行（微重力环境）表明，长期不活动可促使姿势肌从慢缩型向快缩型纤维表型转变26,27,28,29,30。相反，在杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy）中，无论是在人类患者还是小鼠模型（mdx）中，快缩糖酵解型纤维受到的影响均比慢缩纤维更显著且更严重31,32,33,34。类似地，在面肩肱型肌营养不良症（FSHD）中，观察到由快缩向慢缩的转变，表现为I型纤维比例增加，同时II型纤维的收缩力下降24,35,36。
目前尚不清楚为何在不同疾病中某些肌纤维类型会受到选择性影响或免受损害。这些模式并非随机出现，凸显了深入解析其潜在机制的重要性，而单根肌纤维分离技术已成为实现这一目标的强大且广泛应用的手段。事实上，自20世纪80年代中期Bischoff37首次提出以来，这一不可或缺的技术不断得到优化和改进，使得对肌肉生物学的研究日益精确38,39,40。重要的是，单根肌纤维分离能够使卫星细胞（SCs）尽可能保持在其生理微环境中，从而充分研究其分子活动。尽管像趾短屈肌（FDB）和趾长伸肌（EDL）等肌肉群相对容易提取41,42,43，但比目鱼肌（SOL）仍是获取大量完整肌纤维最为困难的肌肉之一。这归因于其组织僵硬、纤维长度较长以及易受损伤的特性。为解决这一难题，本研究优化了一种技术，可稳定地从 notoriously difficult-to-isolate 的SOL肌肉中获得高质量且具有活性的肌纤维群体。当该方法与EDL肌纤维分离相结合时，可实现来自不同肌肉群的肌纤维及其衍生细胞（卫星细胞、成肌细胞和肌管）的培养。关键的是，该平台能够系统性地探究可能在不同类型肌肉病理中发挥差异作用的分子因素，并为药物干预提供强有力的手段，揭示肌肉类型特异性的反应，最终推动骨骼肌疾病有效疗法的开发。

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>酒石酸布托啡诺</td><td>Meiji Yakuka Co., Ltd</td><td>711-12</td><td>产品名称：Vetorphale 注射液</td></tr><tr><td>鸡胚提取物</td><td>US Biological</td><td>C3999</td><td></td></tr><tr><td>I型胶原酶</td><td>Worthington</td><td>M9B2717</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>无葡萄糖DMEM</td><td>Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10569</td><td></td></tr><tr><td>高糖DMEM+GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>马血清</td><td>Life technology</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>低蛋白结合滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGVR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>盐酸美托咪定</td><td>Kyoritsu Seiyaku Co., Ltd</td><td>8816</td><td>产品名称：Dorbene 注射液</td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>4987211762100</td><td>产品名称：Dormicum 注射液</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-两性霉素B混合液</td><td>Wako</td><td>161-23181</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S染色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24-3875-5</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心管（25 mL）</td><td>IWAKI</td><td>2362-025</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>IWAKI</td><td>5 3/4 IK-PAS-5P</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M165C</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin培养皿（100 mm）</td><td>Thermo Scientific</td><td>3020-100</td><td>文中称为培养皿（Petri dish）</td></tr><tr><td>免疫荧光染色抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠（H+L），Alexa Fluor 488标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-32723</td><td>1:400</td></tr><tr><td>山羊抗兔（H+L），Alexa Fluor 594标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11012</td><td>1:400</td></tr><tr><td>小鼠抗肌球蛋白重链抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB4470</td><td>1:400</td></tr><tr><td>小鼠抗Pax7抗体</td><td>DSHB</td><td>AB-528428</td><td>1:100</td></tr><tr><td>兔抗MyoD抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-760</td><td>1:100</td></tr><tr><td>免疫印迹抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP标记抗小鼠IgG</td><td>Cytiva</td><td>NA931</td><td>1:1000 / 辣根过氧化物酶</td></tr><tr><td>HRP标记抗兔IgG</td><td>Cytiva</td><td>NA934</td><td>1:1000 / 辣根过氧化物酶</td></tr><tr><td>小鼠抗MyHC I抗体</td><td>Sigma</td><td>M8421</td><td>1:1000 / 肌球蛋白重链I</td></tr><tr><td>小鼠抗MyHC II抗体</td><td>Sigma</td><td>M4276</td><td>1:1000 / 肌球蛋白重链II</td></tr><tr><td>小鼠抗PGC-1&amp;alpha;抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-517380</td><td>1:1000 / Pparg共激活因子1α</td></tr><tr><td>小鼠抗&amp;alpha;-微管蛋白抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#3873</td><td>1:1000 / α-微管蛋白</td></tr><tr><td>兔抗COXIV抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#4850</td><td>1:1000 / 细胞色素c氧化酶IV</td></tr><tr><td>兔抗GAPDH抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2218</td><td>1:10000 / 甘油醛-3-磷酸脱氢酶</td></tr><tr><td>兔抗GLUT4抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2213</td><td>1:1000 / 葡萄糖转运蛋白4</td></tr><tr><td>兔抗&amp;beta;-actin抗体</td><td>Proteintech</td><td>20536-1-AP</td><td>1:2000 / 非肌肉β-肌动蛋白</td></tr></tbody></table>

单纤维分离检测法用于评估氧化型肌纤维行为

Single Fiber Isolation Assay for the Assessment of Oxidative Myofiber Behavior

骨骼肌由多核肌纤维组成，其完整性和功能对运动和整体健康至关重要。在神经肌肉疾病中，不同疾病类型和阶段可导致不同肌群受累，因此从代表性肌肉中分离出有活性的单根肌纤维用于机制研究显得尤为重要。本方案旨在提供一种可靠的方法，以从鼠类比目鱼肌（SOL）中高效分离出大量完整单肌纤维，该肌肉因纤维较长且脆弱而难以解离。通过优化胶原酶浓度和消化时间，本方案在解离过程中最大限度减少纤维损失并保持其活性。优化后的操作流程显著降低了分离纤维上残留的组织附着，从而减少了非肌纤维细胞的带入，避免了细胞间的交叉污染。该技术适用于单纤维分析，也适用于卫星细胞的分离及其后续扩增，且污染极少。采用此优化流程，我们通常可获得约300–500根完整的源自SOL的单肌纤维，这些纤维可高效进行免疫标记，并能分离出高质量的卫星细胞群体，成纤维细胞污染极少。通过与趾长伸肌（EDL）的比较分析，我们强调了在神经肌肉疾病研究中采用针对性、肌肉特异性的方法评估治疗策略的重要性，从而可在小规模、可调控的实验窗口内测试候选药物干预措施。

我们的技术表明，比目鱼肌（SOL）和趾长伸肌（EDL）的分离肌纤维可高效地进行Pax7免疫标记（图3B）。这些分离的肌纤维可在悬浮培养基（含DMEM + GlutaMAX、10% 马血清、1% 抗生素-抗真菌剂、0.5% 鸡胚提取物）中维持3天，随后进行免疫标记（图3B）。不建议将悬浮状态的肌纤维维持超过4天。在所述的悬浮肌纤维培养条件下，肌纤维在此之后容易发生聚集，影响后续的免疫标记分析。
该技术还可用于肌源性程序全过程的免疫印迹分析（图3C）。具体而言，将来源于比目鱼肌（SOL）和趾长伸肌（EDL）的成肌细胞以约70%的融合度接种于24孔板中。细胞或在生长培养基中维持1天（成肌细胞阶段），或诱导分化2天或4天（分别为早期形成和已分化的肌管细胞）。每份样品上样5 µg蛋白进行免疫印迹分析。
MyHC I 的表达几乎特异性地出现在 SOL 来源的肌纤维中，在肌管中表达极少，在成肌细胞中几乎无表达（图 3C）。MyHC II 在 SOL 和 EDL 肌纤维中均有表达。该表达模式反映了 SOL 主要由 I 型和 IIa 型纤维组成，而 EDL 主要由 IIx 和 IIb 型纤维构成。成肌细胞不表达 MyHC II，但其表达在分化过程中逐渐增强。与氧化代谢相关的蛋白 PGC-1α 和 COXIV 在 SOL 来源的肌纤维中表现出预期的较高表达水平。此外，与 EDL 肌纤维相比，分离的 SOL 肌纤维中 GLUT4 的表达也更高。骨骼肌生物学家可能面临的一个问题是，常用的看家蛋白和上样对照（如 α-微管蛋白、β-肌动蛋白、GAPDH 以及包括丽春红 S 在内的总蛋白染色）在成肌细胞、肌管和分离的肌纤维之间并不稳定，各自表现出明显的变异性。α-微管蛋白和 β-肌动蛋白的信号强度在肌管中最高，而丽春红 S 染色在成肌细胞中相对较弱。相反，GAPDH 在 EDL 肌纤维中的表达更强。然而，根据实验目的的不同，这些看家蛋白中的某一种仍可能适用，或者也可考虑使用热休克蛋白 70（HSP70）等其他归一化因子。
<img alt="解剖装置显示肌肉识别；手术工具，标注的肌肉：SOL, GAS。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70637/70637fig1.jpg" data-altupdatedat="1784606404000" data-alt="图1"> 
图1．比目鱼肌解剖过程。（A）解剖所需设备。1：显微剪刀，2：精细镊子，3：解剖剪刀，4：解剖针。（B）从腓肠肌（GAS）和比目鱼肌（SOL）腱束中切断跖肌（PLA）肌腱（黄色箭头）。用镊子提起远端PLA肌腱（白色箭头）。（C）将解剖针插入比目鱼肌近端肌腱（红色箭头）与腓肠肌（绿色箭头）之间的间隙。（D）使用解剖针将比目鱼肌从腓肠肌分离。（E）随后在腓肠肌侧切断腓肠肌和比目鱼肌的腱束。（F）再用显微剪刀切断比目鱼肌近端肌腱。（G）去除额外的远端腱束。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70637/70637fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜装置与图像；移液管、显微镜、不同放大倍数下的真菌生长情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70637/70637fig2.jpg" data-altupdatedat="1784606404000" data-alt="图 2"> 
图 2．分离比目鱼肌纤维。（A）分离所需设备。1：细口和 2：粗口巴斯德移液管。（B）用于分离的体视显微镜。（C）经胶原酶消化的比目鱼肌组织转移至含 1% 抗生素-抗真菌剂（AB）的 DMEM 培养基中。（D）经过首次 10 次冲洗后，比目鱼肌纤维从肌肉组织中解离出来。（E）将单根肌纤维转移至第二个培养皿中。（F）图像显示已去除碎片和皱缩纤维后的清洁肌纤维。（G）无碎片的单根肌纤维转移至第三个培养皿中。（H）完整且清晰可见的单根肌纤维。比例尺 = 10 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70637/70637fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肌肉分化；SOL/EDL肌纤维显微观察；Pax7/MyoD染色；Western blot分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70637/70637fig3.jpg" data-altupdatedat="1784606404000" data-alt="图3"> 
图3．细胞培养扩增及EDL和SOL来源样本的分析。（A）分离后第6天，增殖培养基培养的样本显示从分离的比目鱼肌纤维获得的纯肌母细胞培养物。比例尺 = 100 µm。（B）SOL和EDL来源的单根肌纤维在分离后立即或3天后，可见卫星细胞经Pax7（绿色）免疫标记。MyoD（红色）的缺失表明卫星细胞尚未进入成肌活化阶段。纤维经DAPI（蓝色）复染。随后通过荧光显微镜观察细胞。比例尺 = 20 µm。（C）使用5 µg蛋白对肌母细胞、肌管细胞及肌纤维来源样本进行免疫印迹分析。免疫印迹图显示MyHC I、MyHC II、PGC-1α、COX IV、GLUT4、α-微管蛋白、β-肌动蛋白和GAPDH的表达，以上作为内参/归一化对照。Ponceau S染色用于总蛋白上样量控制。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70637/70637fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了从小鼠氧化型腓肠肌中分离完整单根肌纤维并建立高纯度肌母细胞培养物的方法。优化后的操作可稳定地从每只小鼠获得约300–500根完整的肌纤维，适用于后续的分子与细胞分析。

骨骼肌由多核肌纤维组成，其完整性和功能对运动和整体健康至关重要。在神经肌肉……

本研究聚焦于从氧化型比目鱼肌中分离完整的单根肌纤维。现有的单纤维分离方法难以充分保护脆弱的长比目鱼肌纤维。本优化方案克服了纤维损伤问题，实现了完整肌纤维的有效回收。首先，准备好肌肉解剖所需的器械。使用预先配制的三重麻醉混合液，通过腹腔注射使 C57 black six 小鼠麻醉。随后通过颈椎脱臼法处死动物。在后肢进行连续的皮肤切口，并剥离皮肤以暴露下方组织。随后去除表面筋膜。将跖肌腱与腓肠肌和比目鱼肌的肌腱束分离。轻轻牵拉趾长屈肌的肌腱，将其完整剥离。切断腓肠肌和比目鱼肌的肌腱束，以暴露肌肉组织。将一枚针插入腓肠肌与比目鱼肌近端肌腱之间的间隙中。小心地将此针向远端滑动，以分离比目鱼肌和腓肠肌。将第二根针插入腓肠肌和比目鱼肌的近端肌腱中。从腓肠肌侧切断肌腱束。将比目鱼肌置于腓肠肌上，调整比目鱼肌的位置以暴露其近端肌腱。使用显微剪刀剪断近端肌腱。将比目鱼肌置于解剖台上。去除残留的肌腱。将完整的比目鱼肌转移至含有0.5%胶原酶溶液的25毫升离心管中。在 37 摄氏度下孵育 130 分钟。剪断两根巴斯德吸管，制成一根具有宽口径和一根具有窄开口的吸管。在火焰下对开口进行灭菌并使其光滑，以防止在吹打过程中损伤肌肉组织。使用含5% BSA的PBS血清溶液涂覆移液管和三个50毫米培养皿，以防止纤维粘连。消化完成后，弃去多余的胶原酶溶液。将比目鱼肌转移至含有含1%抗生素-抗真菌剂DMEM的培养皿中。使用宽口巴斯德移液管轻轻吹打以解离纤维。使用窄口巴斯德移液管沿纤维长度方向将完整单根纤维转移至第二个培养皿中。在转移过程中去除碎片和皱缩的纤维。现在使用窄口巴斯德移液管将高质量的完整单根肌纤维转移至第三个培养皿中。将肌纤维收集到经牛血清白蛋白（BSA）包被的25毫升离心管中。轻轻搅拌悬浮液，并在室温下静置5分钟，使肌纤维沉淀。使用窄口移液管弃去上清液，保留约 500 µL 培养基。保留含有纯化单根肌纤维的沉淀物。用 DMEM 将 Matrigel 基质稀释至浓度为 0.1 mg/mL。用其包被一个100毫米的培养皿。将培养皿在37摄氏度孵育30至60分钟，或直至聚合完成。向先前制备的肌纤维悬液中加入约500微升的accutase，并在室温下孵育10分钟。然后加入10毫升含补充剂的无葡萄糖DMEM培养基。将10毫升经accutase处理的肌纤维悬液转移至基质胶包被的培养皿中。每平方厘米培养皿面积接种约4根单根肌纤维。将纤维均匀转移至培养皿中。使用显微镜检查纤维分布的均匀性。培养三天后观察成肌细胞集落。每天更换培养基，直至细胞达到汇合。持续培养至第6天达到汇合状态。在增殖培养基中培养6天后，分离的比目鱼肌纤维可获得纯化的成肌细胞培养物。分离后立即观察，由比目鱼肌来源的单根肌纤维和由趾长伸肌来源的单根肌纤维均显示出经成对框七（paired box seven）免疫标记的卫星细胞。在漂浮培养基中培养三天后，比目鱼肌来源和趾长伸肌来源的单根肌纤维也均显示出经成对框七免疫标记的卫星细胞。该方案可在获得丰富且具有活力的卫星细胞亚群的同时，实现对单根肌纤维内分子行为的高分辨率分析。在解剖过程中保持比目鱼肌结构的完整性，并精确优化I型胶原酶消化条件，对于防止肌纤维损伤至关重要。未来的研究可利用富集的比目鱼肌纤维群体，全面分析肌肉行为背后的分子机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

单纤维分离测定法用于评估氧化性肌纤维行为

皂苷透化纤维制备结合呼吸测定法分析氧化磷酸化，可对线粒体功能进行整体性评估。生理和病理状态下的线粒体呼吸可反映多种调控因素的影响，包括线粒体间的相互作用、形态学特征及生物化学特性。...

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准确检测神经肌肉接头组分的能力对于评估病理或发育过程引起的结构改变至关重要。本文详细介绍了一种简便的方法，可用于获取高质量的全装片神经肌肉接头图像，进而进行定量测量。...

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本文介绍了一种从小鼠骨骼肌中分离线粒体的详细方法，以及随后利用基于微孔板的呼吸测定实验，通过氧消耗率（OCR）分析线粒体呼吸功能。该技术流程可用于研究多种环境或遗传干预对线粒体代谢的影响。...

从小鼠骨骼肌中分离线粒体用于呼吸测定实验

马具有卓越的有氧运动能力，因此马的骨骼肌是研究马运动生理学以及哺乳动物线粒体生理学的重要组织。本文介绍了对马骨骼肌线粒体功能进行全面评估的技术方法。...

高分辨率荧光-呼吸测定法用于马骨骼肌

本文介绍了一系列检测方法，用于独立于哺乳动物细胞消耗分子氧能力之外直接测量其线粒体功能。...

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人类骨骼肌纤维类型鉴定

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通过酶解法分离小鼠六种后肢肌肉获取完整短、中、长骨骼肌纤维：超越趾短屈肌的研究

本文介绍了一种用于测定人或小鼠骨骼肌新鲜通透化肌纤维中线粒体氧化磷酸化水平的综合性方法。该方法能够在保持线粒体网络结构和膜完整性的前提下，实时定量检测线粒体呼吸，并评估底物偏好性与代谢灵活性。...

通过高分辨率呼吸测定法测量人和小鼠骨骼肌纤维的线粒体呼吸

学习从小鼠比目鱼肌分离完整单肌纤维的方法，用于肌肉生物学和神经肌肉疾病研究。该优化方案通过调整胶原酶浓度和消化时间，减少纤维损伤并提高产量，支持免疫标记和卫星细胞扩增应用。

单纤维分离检测法用于评估氧化型肌纤维行为

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