Name: 用于评估肽通量的标准化 体外 猪口瘤模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-09T12:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 了解利用离体猪口腔黏膜模型评估肽类药物渗透性的标准化方法。该方案采用Franz扩散池和3D打印插件，结合促渗剂甘氨脱氧胆酸盐，为口腔颊膜和舌下给药制剂的临床前筛选提供可靠平台。

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作者感谢都柏林大学兽医学院的 Ben Shovlin 提供的技术支持。同时感谢都柏林大学化学学院的 Hans Eckhardt 博士在超高效液相色谱分析方面的支持。本项目获得了欧盟“地平线欧洲”研究与创新计划的资助，资助编号为 101071054。我们还感谢资助编号 13/RC/2073_P2、爱尔兰研究理事会 CURAM 医疗器械中心以及欧洲发展基金提供的额外资金支持。作者感谢 Rosderra Irish Meats 公司的 Kenneth McNamara 提供猪脸颊组织。

本研究使用的猪脸颊组织取自当地屠宰场，因此无需伦理审批。
1. 猪颊黏膜上皮的分离、制备与保存
<ol>
	<li>从当地屠宰场采集猪颊组织，并在90分钟内用冰冻的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）运输至实验室。在接下来的60分钟内，按照先前描述的方法19,24进行组织制备，针对不同口腔黏膜部位进行轻微修改，如图1所示。</li>
	<li>使用手术刀将颊黏膜与下方组织分离，并用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗组织三次。丢弃表面有可见损伤的黏膜。</li>
	<li>将完整的黏膜浸入65 °C的PBS中3分钟，然后使用5号钟表匠镊子分离上皮层与下方剩余的结缔组织及平滑肌。该方法同样适用于舌下和舌部上皮黏膜的分离。</li>
	<li>将解剖后的口腔黏膜在纤维素滤纸上轻轻干燥，随后立即进行渗透实验（优先选择）或冷冻保存，最长不超过4周。</li>
	<li>分离后如需冷冻，将口腔黏膜浸入冷冻保护剂（85%甘油）中2小时，并轻轻振荡。高黏度甘油可置换细胞间水分，防止冰晶形成，从而避免组织结构受损25。</li>
	<li>此步骤结束后，用新鲜PBS和10%甘油替换甘油溶液。根据所需储存时间，将黏膜样品在-20 °C或-70 °C下冷冻。冷冻过程应以约-1 °C·min-1的受控速率进行。 
	注意：所有实验均使用至少三个来自不同动物颊部的组织样本进行。</li>
</ol>
2. 离体 采用Franz扩散池装置进行黏膜渗透研究及使用Hilltop小室呈递GLP-1 RA与GDC
注意： 离体 使用Franz扩散池（FDC）对新鲜分离的猪颊黏膜进行通透性研究。
<ol>
	<li>将分离的组织黏膜安装在腔室中（窗口面积 1.2 cm2），如图 2所示，并用 PBS（pH 6.8，供体侧，1 mL 体积）和 PBS（pH 7.4，接收侧，10 mL 体积）平衡 30 分钟。</li>
	<li>平衡 30 分钟后，将供体侧溶液 PBS（pH 6.8）替换为 1 mL 含有 1:1 比例的 GLP-1RA（25 mg/mL）和 GDC（25 mg/mL）的 PBS 溶液。</li>
	<li>在 37 °C 条件下以 300 rpm 持续搅拌接收侧腔室中的 10 mL PBS（pH 7.4），每 60 分钟从接收侧取样 1 mL，持续 180 分钟。在实验开始和结束时，分别从供体侧取三份样品。每次取样后，向腔室中补充 1 mL PBS。</li>
	<li>实验结束后，将组织保存于 10% 甲醛溶液中用于组织学分析，或进行匀浆处理以定量组织中残留的 GLP-1RA 肽段。</li>
	<li>类似地，使用 Hilltop 腔室（HTC）进行 GLP-1RA 的通透性实验。 
	注：使用 HTC 的目的是在制备双层颊膜之前，验证 GDC 在溶液中对 GLP-1RA 的口腔黏膜渗透增强作用。HTC 腔室由生物相容性苯乙烯-乙烯-丁烯-苯乙烯（SEBS）嵌段共聚物 Kraton G-2705 制成，外径为 19 mm，内含直径为 12.7 mm 的 Webril 垫片，该垫片由 100% 非织造棉纤维组成，作为吸收性非粘连材料用于溶液施加26。</li>
	<li>同样地，通过将载有 GLP-1RA 和 GDC（1:1 比例）的黏附性双层膜置于 FDC 的供体腔室或 3D 插入装置中，评估其离体（ex vivo）通透性，方法同 HTC 所述。</li>
	<li>为确认猪颊部上皮组织的完整性，使用 FD-4（0.05 mM）作为荧光示踪剂，将其加入供体侧以评估组织间的渗漏情况。 
	注：显示渗漏的组织样本将被排除在通透性计算之外。</li>
	<li>3 小时实验结束后，通过 uHPLC 分析从基底外侧腔室中三份取出的 200 µL 样品，定量累积的 GLP-1RA 通量。所有渗透实验均重复三次。根据一系列已知浓度的 GLP-1RA 绘制的标准曲线，定量 GLP-1RA 的累积通量。</li>
</ol>
3. 制备包埋GLP-1RA和GDC的颊膜
注意：含有黏膜黏附层和背衬层的颊部双层膜采用溶剂浇铸法，并使用半自动涂布机制造27。
<ol>
	<li>使用 HPMC 和 PVP-K90 作为成膜聚合物，并以 Na-CMC 作为黏膜黏附组分，制备用于包埋 GLP-1RA 的双层膜。 
	注：有关颊膜黏附层和背衬层的组成，请参见表1。在模型膜中加入少量（低毫克量）GDC 与 GLP-1RA 肽共存，以观察其对肽类物质透过安装在扩散池中的猪颊黏膜的影响。</li>
	<li>通过磁力加热搅拌器在 400 rpm 条件下搅拌 10 分钟，将成膜聚合物（45 mg HPMC、10 mg Na-CMC 和 25 mg PVP-K90）溶解于含有 3% 甘油的去离子水中，制备黏膜黏附层。 
	注：HPMC 在室温下可溶，而 PVP-K90 需在 40 °C 加热 30 分钟才能完全溶解。</li>
	<li>在搅拌条件下加入 2 mg Aerosil 200 F，随后加入 GLP-1RA 肽。然后加入 GDC，并在 600 rpm 条件下分散 30 分钟。</li>
	<li>将最终的聚合物溶液置于超声水浴中处理 90 分钟，以去除气泡。</li>
	<li>将溶液浇铸至聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）衬垫上，使用涂布刮刀（设定为 2600 µm，速度为 2 mm/s）进行涂膜，并在 40 °C 的热风烘箱中干燥约 1 小时。</li>
	<li>对于背衬层，将 5% 乙基纤维素（EC）和 5% 丙二醇（PG）溶解于醇水混合溶剂（乙醇:水）中，然后将所得溶液浇铸到 PET 衬垫上。最后，将干燥后的膜切成 1 cm × 1 cm 的正方形，装入铝箔袋中，并于 4 °C 保存。</li>
</ol>
4. 定制 3D Transwell 模拟插件的打印
注意：3D打印的定制插件是根据先前描述的方法并稍作修改后制备的28。
<ol>
	<li>简而言之，使用计算机辅助设计（CAD）软件设计三维模型。</li>
	<li>保持3D插件的尺寸与主圆柱体（供体室）相同，最大表面积为1659.06 mm2，整体外部尺寸沿x轴为25.20 mm，沿y轴为14.50 mm，沿z轴为21.63 mm。</li>
	<li>此外，设计一个可拆卸的圆形固定环以支撑上皮组织。该固定环外径约为19.90 mm，内径为17.93 mm，与主圆柱体的尺寸相匹配，并可适配Transwell 12孔板（图3）。</li>
	<li>使用台式光固化（SLA）3D打印机和可紫外固化的透明树脂制造所有组件。所有尺寸均为近似值，可根据需要进行调整，以确保在Transwell中的正确适配及实验兼容性。 
	注意：为确保未反应单体及潜在可浸出物的去除，所有部件均经过标准化的后处理流程，包括在纯净的99%异丙醇（IPA）中清洗10分钟，随后按照制造商说明进行紫外固化，即在Form Cure 2设备中于室温下照射1分钟。用于3D模型设计的立体光刻文件（STL）可从以下网址获取：https://doi.org/10.5281/zenodo.19368577，或参见补充文件（补充文件1和补充文件2）。</li>
</ol>
5. 跨越3D培养插件中黏膜的渗透
注意： 离体 GLP-1RA 和 GDC 掺入黏膜黏附性双层颊膜后的渗透性，也可通过低体积、定制设计的模拟 Transwell 3D 插入装置进行评估（图2) 作为FDC的替代方法。这是因为FDC的10 mL接收侧会稀释肽段，影响uHPLC的检测灵敏度。因此，FDC设计在肽段渗透研究中既不经济也不实用，因其需持续依赖酶联免疫吸附测定（ELISA）或放射免疫分析（RIA）进行检测。
<ol>
	<li>使用桌面SLA 3D打印机，以可紫外光固化的树脂制备/打印插件28，并将其安装至12孔组织培养板中。</li>
	<li>将猪颊黏膜置于顶侧与基底侧腔室之间面积为1.4 cm2的窗口区域，使用EVOM 2伏欧计配合STX2镊形电极插入供体侧和接收侧插件中，测量基础跨上皮电阻（TEER）。TEER通过欧姆定律计算。</li>
	<li>将薄膜（1.0 × 1.0 cm2）置于组织表面后，用移液器向顶侧腔室加入0.5 mL PBS（pH 6.8），向基底侧腔室加入1.5 mL PBS（pH 7.4）。</li>
	<li>在3小时内每隔1小时从接收侧取样（0.2 mL），并补充等体积的新鲜缓冲液。</li>
	<li>采用uHPLC定量测定透过GLP-1 RA肽的量。 
	注意：如补充图1和补充文件3所示，3小时后未观察到GLP-1RA与3D插件之间存在吸附现象。</li>
	<li>在3小时内每隔1小时使用EVOM 2伏欧计配合STX2镊形电极测量跨上皮电阻（TEER）。TEER通过欧姆定律计算。</li>
	<li>为验证猪颊部及舌下上皮组织的完整性，使用FD-4（0.05 mM）作为荧光标记物。 
	注意：所有实验均设三个重复，报告结果为三组数据的平均值±标准差。</li>
</ol>
6. GLP-1受体激动剂的超高效液相色谱检测
<ol>
	<li>使用带有 CSH C18 柱（130 Å，1.7 µm，2.1 mm × 50 mm）的超高效液相色谱法（uHPLC），以乙腈中含 0.1% 三氟乙酸为流动相 A，水中含 0.1% 三氟乙酸为流动相 B，在 30 °C 下进行 8 分钟梯度洗脱，进样体积为 20 µL，流速为 0.7 mL/min，于 214 nm 处进行紫外检测（保留时间：约 4.2 分钟），定量测定从安装在 FDC 和插入物中的口腔黏膜上渗透的 GLP-1 受体激动剂（RA）的量，样品来源于各供体侧溶液、HTC 及薄膜。</li>
	<li>进行线性研究。
	<ol>
		<li>设计一项线性研究，采用浓度范围为 2.5–20.0 µg·mL⁻1 的 GLP-1 校准品，评估优化后的 uHPLC 条件下的分析响应。</li>
		<li>独立配制校准品（n = 6–8 个浓度水平），每一样品进样三次。以峰面积（mAU）对名义浓度进行最小二乘法线性回归，并通过决定系数（r2）、% y 轴截距以及残差（实测值–预测值）分布评估线性关系。 
		注：校准曲线图与残差图的目视检查表明，在最低灵敏度水平（2.5 µg·mL⁻1）下，偏离线性的程度不显著，残差在预设的可接受限度内（±3%）。因此将校准范围限定为 2.5–20.0 µg·mL⁻1，在此范围内回归显示良好的线性（r2 ≥ 0.999，% y 轴截距 &#60; 2%，所有残差均在 ±3% 范围内）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 估算保留在颊组织中的 GLP-1RA
<ol>
	<li>从FDC/插入物中取出暴露于GLP-1受体激动剂和GDC的猪颊部上皮黏膜组织。</li>
	<li>用PBS冲洗组织三次，以去除吸附的药物及薄膜辅料。</li>
	<li>随后，使用台式匀浆机在5 mL PBS中将组织匀浆，直至完全破碎。</li>
	<li>将样品在4 °C下保存过夜，使肽段在匀浆组织与PBS之间的分配达到平衡。</li>
	<li>接着，将混合物在5000 × g 条件下离心5分钟，沉淀组织碎片，并收集上清液用于定量分析。</li>
	<li>在进行uHPLC分析前，通过0.22 µm离心滤膜对上清液进行过滤除菌，以去除残留颗粒。</li>
</ol>
8. 口腔黏膜组织学
注意：GLP-1 受体激动剂从混合物、HTCs 或薄膜中渗透 3 小时后，需对黏膜进行处理以评估损伤情况。
<ol>
	<li>将组织用10%福尔马林固定48小时，然后将固定后的组织包埋于石蜡中。</li>
	<li>使用切片机将组织切成5 µm大小的切片。</li>
	<li>然后用苏木精和伊红（HE）对组织进行染色，通过4×放大倍数的光学显微镜检查组织学完整性。</li>
	<li>使用正置显微镜对载玻片进行成像，并利用图像分析软件进行分析。 
	注：整体实验流程总结于图4中。</li>
</ol>

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作者没有需要披露的财务关系或利益冲突。

本方法描述了猪颊部及其他口腔黏膜上皮的分离实验方案，以及使用一种低效价稳定的GLP-1RA类似物作为示例，进行基于肽类治疗药物的通透性测定30。肽类是亲水性大分子，其在黏膜膜上的通透性可忽略不计17。上述方案的成功实施依赖于颊部和舌下黏膜的精确分离与安装。分离过程需要专门的技术和严格的温度控制；加热过程中即使轻微的温度波动也可能引起上皮组织产生有害的生理和形态学变化，最终影响渗透数据的完整性。此外，将分离的组织固定于定制的3D打印插入装置中是一个关键步骤。鉴于上皮层结构脆弱，在安装过程中存在较高的组织破裂或泄漏风险。为降低该风险，我们采用了FD4泄漏检测，作为质量控制手段，以确保在开始通量研究前膜的完整性。FD4泄漏首先通过肉眼观察评估，并进一步利用紫外-可见光谱法进行定量分析。相关数据见补充资料（补充图4 和 补充文件3）。
传统的FDC（经皮扩散池）被认为是ex vivo研究的标准方法，但在定量肽类治疗药物时常常面临挑战，原因在于接收室的体积较大，通常为10 mL。较大的体积导致样品过度稀释，使渗透的肽浓度低于常规分析方法的检测下限（LOD）。为避免这一问题，我们开发了一种新型3D打印插入装置，其尺寸和体积模拟了用于上皮细胞单层（包括Caco-231）的transwell系统。该插入装置可直接置于标准的12孔组织培养板中，并能牢固地承载分离的猪颊部上皮黏膜组织。该改进将供体室体积显著减少了近7倍，降至1.5 mL，从而提高了分析物的浓度，克服了uHPLC的灵敏度限制。这一改进对于定量高成本、低渗透性的肽类药物尤为重要。
使用3D插入系统观察到，在GDC存在下GLP-1 RA的渗透显著增加。3小时时GLP-1RA的累积渗透量达到约55.3 µg，相当于初始施加于供体侧浓度的约4.3%。相比之下，当将含有相似浓度GLP-1RA和GDC的颊膜应用于安装在FDC中的颊黏膜时，未检测到可测量的GLP-1RA通量，这表明肽可能已发生渗透，但由于接收室体积较大导致过度稀释，分析上无法检出。然而，在3D插入系统中，双层颊膜制剂在3小时内GLP-1RA的累积渗透量达到约1.8%，证明了利用微型化接收系统检测剂型中肽类在颊组织中低水平转运的可行性。ex vivo条件下也采用含有浸渍肽和GDC棉垫的HTC系统评估了GLP-1RA的渗透，这是一种非常有用的初步筛选工具，可用于验证肽类通过含渗透促进剂的膜剂递送具有可行性。实验过程中可通过经上皮电阻（TEER）和FD-4泄漏监测猪颊上皮屏障的完整性。暴露于GLP-1受体激动剂（GLP-1 RA）期间，TEER呈现缓慢且时间依赖性的下降，这与胆盐在颊黏膜中诱导的细胞旁路转运增强现象一致32。
该技术的一个局限性在于依赖新鲜的猪组织，而屠宰场并不总能按需提供，且组织质量可能存在差异。为解决从实验室较远距离获取新鲜组织的限制，我们评估了使用冷冻保护剂来储存高质量样本，以便后续使用。尽管使用新鲜组织是最佳选择，但分离后储存的黏膜组织需要谨慎选用冷冻保护剂并控制冷冻速率，以防止冰晶形成及由此造成的屏障损伤。本方案能够弥合标准宏观渗透研究与高灵敏度肽段分析之间的差距。通过优化组织分离过程以及利用3D小室进行渗透实验的方案，我们实现了比通常使用全层皮肤装置（FDCs）更高的重复性和灵敏度。此外，使用3D小室为研究人员提供了对昂贵肽分子进行检测限测定的框架，显著提升了离体（ex vivo）黏膜研究的灵活性和通量。
这些方案为使用多肽以外的药物类别可靠测量黏膜组织渗透性提供了基础。ex vivo 模型生成高分辨率渗透曲线的能力将有助于预测来自动物模型的临床前吸收数据。此外，采用含有浸润多肽和GDC（一种渗透促进剂溶液）棉垫的HTC装置，评估了GLP-1受体激动剂（GLP-1 RA）的ex vivo 渗透性。该递送方式确保了混合物与黏膜表面之间紧密且可重复的接触。在模拟3D插件的transwell系统中，当GDC与药物比例为1:1时，观察到GLP-1RA的渗透性显著增加。该装置是一种非常有用的筛选工具，可用于验证一种概念：即通过将渗透促进剂与薄膜结合，并基于培养的上皮细胞单层结构进行改造设计，实现多肽在组织黏膜上的递送是可行的。实验过程中可通过跨上皮电阻（TEER）测量和FD4渗漏来监测猪颊部上皮的屏障完整性。
总体而言， 离体 渗透性与组织学评估表明，在存在渗透促进剂的情况下，对颊部和舌下肽类物质转运的可靠评估依赖于组织制备方法、通量检测方案以及分析灵敏度。在所考察的分离方法中，采用热分离法处理新鲜获取的猪颊部和舌下上皮组织，在维持上皮完整性与组织解剖可重复性之间实现了良好平衡，这由稳定的基线TEER值、极低的FD4泄漏以及保存完好的组织细胞结构所证实。重要的是，3D打印插入式装置通过减少接收室的稀释效应，显著提高了实验的可靠性，使得原本在FDCs中无法检测到的低肽通量得以定量。综上所述，这些结果支持将分离的猪颊部上皮黏膜与插入式装置结合用于组织培养腔室中作为 离体 用于评估治疗性肽经颊给药实现全身递送的平台

颊部和舌下口腔黏膜是具有吸引力的口服给药途径，因为它们提供了直接可及的给药位点，并可避免肝脏首过代谢，与包括口服在内的其他给药途径相比，可能提高药物的生物利用度和患者的依从性1,2。由于肽类分子分子量较高、亲水性强且易受酶降解，其经肠道上皮渗透的能力较差，因此通常优先选择注射给药而非口服给药3。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准102种肽类用于治疗用途，另有约450种治疗性肽类正处于临床前或临床试验评估阶段4。其中包括使用渗透促进剂配制的口服片剂（如司美格鲁肽Rybelsus）5，以及采用Catalent公司Zydis口服速溶片（ODT）技术开发的口腔黏膜给药平台（如Minirin Melt和舌下醋酸去氨加压素Nocdurna）6。尽管已有大量关于颊部药物渗透性的研究，不同研究中分子的渗透性数值仍表现出较差的可重复性和有限的可比性7,8。这些不一致性主要源于所用实验动物模型的差异，以及分离颊黏膜组织在处理和制备方法上的不同9。
ex vivo 渗透性实验利用分离的颊黏膜和舌下黏膜组织，是预测in vivo 口腔黏膜小分子渗透性以及筛选与剂型相关的处方成分的重要工具10,11,12；然而，其在多肽筛选中的应用受到限制，因为基础渗透性极低。近年来，猪颊黏膜已成为首选模型，因其非角化结构以及生理和生化特性与人类高度相似13。与屠宰场来源的猪组织相比，犬颊黏膜样本更难获取，尽管两者均为非角化组织14。目前仍存在上皮厚度和处理方法的显著差异。标准化的颊部和舌下口腔黏膜制备方法至关重要。短期和长期储存条件、组织厚度以及实验过程中组织活性的维持等因素均会影响ex vivo 渗透性结果8。组织保存尤为关键，因为黏膜的结构完整性和代谢活性直接影响扩散特征12,15。屏障功能的丧失可能导致药物渗透率被人为高估16,17。除储存外，用于将猪颊黏膜组织剥离并安装至渗透室的方法也引入了额外的变异性。通过机械、化学或热学手段去除黏膜下层结缔组织的方式差异可能改变渗透性18。尽管有报道称，采用加热分离法将上皮与平滑肌分离可保持渗透性19，但尚未达成共识。目前尚无普遍接受的方法用于分离并评估分离后颊黏膜的完整性20。荧光素异硫氰酸酯标记的亲水性糖类——右旋糖酐（FITC dextran 4000, FD-4）常被用作猪颊黏膜完整性的标志物，因为只有分子量低于约 500 Da 的小分子才能被动穿透该组织。相比之下，完整的黏膜会限制 FD-4 的转运，通常认为在 2–4 小时内供体侧到接收侧的转运率低于 0.6% 即可接受21,22。此外，苏木精-伊红（H&E）染色可对上皮形态提供简便的评估手段23。
在本研究中，我们建立了一套标准化的黏膜处理方案，用于处理分离的猪颊黏膜，旨在特定时间段内优化黏膜完整性和通透性。我们的目标是提供一种用于解剖猪颊部上皮组织的实验框架，并提高 离体 在扩散池和插件中测定肽类物质跨口腔黏膜的渗透性。我们首先通过肉眼分析，从屠宰场获取无损伤的颊黏膜组织。我们优化了组织处理技术、黏膜厚度以及实验过程中维持组织完整性的方法。采用一种稳定的低效价胰高血糖素样肽-1受体激动剂（GLP-1 RA）类似物作为工具分子，在Franz扩散池和定制的3D打印Transwell型插件中，对颊黏膜进行肽类渗透研究，分别在有或无胆盐吸收促进剂甘氨脱氧胆酸钠（GDC）存在的情况下开展实验。GDC与GLP-1 RA通过溶液、Hilltop扩散室以及黏膜黏附性聚合物双层膜递送至颊黏膜。我们以渗透性标记物、组织病理学检查以及跨上皮/内皮电阻（TEER）值作为主要评价指标。

<table><tbody><tr><td>计算机 / 笔记本电脑</td><td>通用</td><td>任何标准系统</td><td>&amp;ge;建议配备 8 GB 内存</td></tr><tr><td>数据采集脚本</td><td>自定义</td><td>collect.py</td><td>基于 Python 的采集脚本</td></tr><tr><td>一次性凝胶电极</td><td>通用</td><td>预凝胶化 Ag/AgCl 电极</td><td>一次性，粘性</td></tr><tr><td>脑电图采集模块</td><td>倒置实验室</td><td>BioAmp EXG Pill</td><td>生物电位信号模拟前端</td></tr><tr><td>电极凝胶（若使用可重复使用的电极）</td><td>通用</td><td>导电凝胶</td><td>提高信号传导性</td></tr><tr><td>交互式应用程序（游戏）</td><td>通用</td><td>任何简单的游戏（例如，竞速）</td><td>键盘控制界面</td></tr><tr><td>跳线</td><td>通用型</td><td>雄性&amp;ndash;雌性连接器</td><td>标准面包板导线</td></tr><tr><td>Matplotlib / Seaborn</td><td>开源</td><td>最新版本</td><td>可视化文库</td></tr><tr><td>微控制器板</td><td>Arduino</td><td>Uno / Maker Uno</td><td>10位ADC，USB接口</td></tr><tr><td>Python 编程环境</td><td>Python 软件基金会</td><td>Python &amp;ge;3.8</td><td>开源编程语言</td></tr><tr><td>PyTorch 库</td><td>Meta AI</td><td>版本 &amp;ge;1.12</td><td>深度学习框架</td></tr><tr><td>Scikit-learn</td><td>开源</td><td>最新稳定版本</td><td>机器学习工具</td></tr><tr><td>信号处理库</td><td>SciPy</td><td>最新版本</td><td>滤波，短时傅里叶变换</td></tr><tr><td>USB线缆</td><td>通用型</td><td>USB Type-A 转 Type-B</td><td>数据传输电缆</td></tr></tbody></table>

标准化的 离体 用于评估肽类物质跨黏膜转运的猪口腔黏膜模型

A Standardized Ex Vivo Porcine Oromucosal Model for Evaluating Peptide Fluxes

将药物以膜剂、片剂、含片及其他剂型进行口腔黏膜给药，为儿科和老年患者以及难以顺利吞服胶囊或片剂的患者提供了一种便捷的全身给药途径。开发颊部和舌下肽类制剂需要与人类非角化口腔黏膜上皮结构相匹配的临床前模型，其中猪和犬是最合适的动物模型。我们从屠宰场获取了废弃的新鲜猪口腔黏膜组织。通过控制加热法将黏膜从下方的平滑肌组织上分离，随后将其安装于Franz扩散池或新型低体积3D打印树脂固化插件中。将肽类-渗透促进剂组合物加入供体侧，从受体侧采集渗透分子，并采用超高效液相色谱法（uHPLC）进行定量分析。对于插件系统，使用EVOM筷子式电极测量安装后黏膜的跨上皮电阻（TEER）值。在Franz扩散池和3D插件中孵育后，对组织进行组织学检查。当肽与渗透促进剂的水溶液混合物能够提高渗透率时，即确定为渗透促进剂的最佳浓度。在三维（3D）插件中，肽的渗透率在3小时内达到4.3%，而在Hilltop扩散池模型中为1.7%，后者模拟了颊膜直接暴露的情况。我们开发了含有肽-促进剂组合的逐层聚合物黏附膜，并将其应用于黏膜组织，用于扩散室中的渗透研究。离体实验显示，当猪颊黏膜暴露于含有甘氨脱氧胆酸盐（GDC）的最佳组合颊膜时，肽的跨黏膜渗透率达到2%。这些离体筛选研究为后续在猪和人体中经口腔黏膜途径给予载肽膜剂后的药代动力学评价提供了可行路径。

猪颊部上皮组织的分离与解剖 
猪颊黏膜因其与人类口腔黏膜具有相似的解剖结构和生理屏障特性，被广泛用作人类口腔黏膜的替代组织29。猪颊部上皮组织可通过外科手术法和加热法进行分离，如图4所示。首先，使用手术刀从颊部去除肌肉及深层结缔组织。将带有完整黏膜层和结缔组织的组织片段放入预热至65 °C的PBS中孵育3分钟。随后将组织从缓冲液中取出，用5号镊子剥离上皮层及其下方的固有层。加热处理有助于获得厚度一致且均匀的解剖后上皮组织。
体外评估GLP-1RA通过安装在FDC和3D打印插入件中的猪颊部口腔黏膜的渗透性 
采用安装在FDC和插入件中的猪颊部上皮组织黏膜评估GLP-1RA的体外渗透性。为确定GLP-1RA与GDC的最佳浓度比例，在FDC黏膜供体侧固定含有面积为12.7 mm棉垫的HTC，并将肽-增强剂混合物移液至棉垫上。当GDC以1:1比例（GLP-1RA 25 mg : GDC 25 mg）存在时，3小时内GLP-1RA的累积渗透量约为4.3%。相比之下，在无GDC存在时，未检测到GLP-1RA的渗透通量27。表观渗透系数（Papp）等定量渗透性参数通过以下公式计算：
Papp = <img alt="流体动力学方程；dQ/dt=1/(A×Co)；数学分析过程。" src="/files/ftp_upload/70935/70935eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="方程 1">
其中： 
Papp：表观渗透系数（cm/s）。 
dQ/dt：GLP-1RA 在稳态下的转运速率，计算为单位时间内转运的肽量（µg/s）。 
A：3D 插入膜的表面积（cm2）。 
Co：供体（顶侧）室中肽的初始浓度（µg/mL）。
GLP-1RA 经猪颊黏膜的表观渗透系数（Papp）见补充图2。当 GLP-1RA:GDC 比例为 1:1 时，其浓度与 HTC 中相同，并被掺入双层膜中；然而，使用传统的 FDC 装置无法定量测定 GLP-1RA 通过离体猪颊组织的渗透，因为膜剂中 GLP-1RA 向黏膜的递送速度慢于溶液混合物或 HTC 中的递送速度。为克服这一限制，开发了定制的低体积 3D 打印插入装置，将接收相体积减少至 1.5 mL，从而提高检测灵敏度。使用 3D 插入装置后，GLP-1RA 从颊膜在 3 小时内的累积渗透量可被测定，约为 1.8%，如图5所示。通过 TEER 值和 FD-4 通量评估上皮屏障完整性和旁细胞渗透性。在处理组中观察到 TEER 呈时间依赖性下降（补充图3），并与 GLP-1RA 渗透增加相对应。PBS 和空白膜处理的组织 TEER 无变化，表明双层膜基质未破坏屏障结构。这些数据表明，GDC 是促进渗透效应的主要因素。
猪组织的组织学评估 
组织学评估 离体 猪颊黏膜用于评估组织分离方法的影响，并检测经GLP-1RA和GDC暴露3小时后上皮完整性的变化。如图所示 图6采用加热法获得的新鲜组织保留了正常的上皮生理结构，具有完整的复层结构和连续的表面黏液层，未见结构损伤的证据。相比之下，通过机械分离法获取或经过储存/冷冻处理的组织，其上皮细胞形态出现轻微改变，且表面黏液层厚度减少。在含有25 mg GDC的条件下，暴露于25 mg GLP-1RA的颊黏膜组织保持了上皮完整性，且与未处理对照组高度相似，仅观察到轻度水肿和表层上皮糜烂。单独暴露于GLP-1RA或暴露于空白及负载GLP-1RA:GDC双层膜的组织均未产生可见的组织损伤，其组织学特征与PBS处理的对照组织相当。
<img alt="用于医学研究的口腔示意图，显示颊部和舌下黏膜上皮解剖结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70935/70935fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图1"> 
图1：猪口腔示意图，显示颊部和舌下黏膜区域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/70935fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于皮肤渗透性和药物释放研究的Franz扩散池装置、示意图及池帽套件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70935/70935fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图2"> 
图2：Franz扩散池（FDCs）及其组件。六个扩散池腔室安装在一个集成系统中（左图）。单个Franz扩散池的示意图（中图）。单个腔室中用于固定颊黏膜组织的装置（右图）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/70935fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡装置：用于通透性研究的组织固定环和供体室示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70935/70935fig3.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图3"> 
图3：3D打印的1 cm2树脂插件的组成部分。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/70935fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="猪颊黏膜组织处理步骤；分离、超高效液相色谱定量及组织学分析示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70935/70935fig4.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图4"> 
图4：猪颊黏膜上皮的分离、固定、渗透及组织学表征流程图。由 BioRender.com 制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/70935fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示HTC、FDC和3D插入剂中GLP-1RA累积水平（µg/mL）的条形图；实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70935/70935fig5.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图5"> 
图5： GLP-1RA的累积量。在猪颊黏膜上皮组织的接收侧，经HTC、FDC和3D插入剂分别施用25 mg/mL GLP-1RA（红色）、25 mg/mL GLP-1RA:25 mg/mL GDC溶液（黑色）以及载有25 mg/mL GLP-1RA:25 mg/mL GDC的薄膜（紫色）作用180分钟后，ex vivo测得的GLP-1RA累积渗透量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/70935fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="组织学：皮肤组织横截面、显微镜图像、细胞结构分析、150μm比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/70935/70935fig6v2A.jpg" data-altupdatedat="1785816036000" data-alt="图6"> 
图6：不同暴露条件下猪颊部上皮黏膜的HE染色显微图像。（A）空白膜，（B）GLP-1RA:GDC水溶液混合物，（C）包载GLP-1RA:GDC的膜。红色箭头显示表层上皮糜烂，蓝色箭头显示轻度水肿。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/70935fig6v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">黏膜粘附层组成</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>成分</td>
			<td>浓度 (mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLP-1RA</td>
			<td>12.5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDC</td>
			<td>12.5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPMC</td>
			<td>45 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-CMC</td>
			<td>10 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP-K90</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>甘油</td>
			<td>3 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosil 200F</td>
			<td>2 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">背衬层</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>乙基纤维素</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>丙二醇</td>
			<td>5 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：颊膜黏膜粘附层和背衬层的组成。
补充图1：将0.5 mg GLP-1RA与3D插入物共孵育6小时后GLP-1RA的吸附情况。数据为三次实验的平均值±标准差（n = 3）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：GLP-1RA在3D培养插件中猪颊黏膜组织经3小时暴露后的表观渗透系数（Papp）。25 mg/mL GLP溶液（红色）、25 mg/mL GLP + 25 mg/mL GDC水溶液（黑色），以及将25 mg/mL GLP + 25 mg/mL GDC掺入颊膜中（紫色）。数据表示为均值 ± 标准差（n = 3）。组间差异具有统计学意义：p &lt; 0.05。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图3：跨上皮电阻（TEER）。 将分离的猪颊部上皮组织固定在3D插入式培养装置中，分别暴露于25 mg/mL GLP-1 + 25 mg/mL GDC溶液（红色）、含25 mg/mL GLP-1 + 25 mg/mL GDC的颊膜制剂（绿色）以及含25 mg/mL GLP-1RA的PBS溶液（蓝色）后，跨上皮电阻（TEER）随时间逐渐降低。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图4：组织完整性和渗漏性。 通过将3D小室中的猪颊部上皮组织在供体侧暴露于0.05 mM FD4来评估组织完整性和渗漏性。在6小时内，每隔60分钟采集一次样品。数据为三次实验的平均值±标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 1：transwell-Oring-v7 (JOVE).stl。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/transwell-Oring-v7%20(1)%20(1).stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：transwell-v9 (JOVE).stl。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/transwell-v9%20(1)%20(1).stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：额外的实验细节。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/70935/Supplementary%20File%203.docx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种利用新分离的猪颊部上皮组织黏膜来评估肽类渗透的筛选平台。该方法结合了在Franz扩散池和3D打印插入物中，使用溶液、Hilltop室以及膜剂型，在渗透促进剂存在条件下对GLP-1受体激动剂（GLP-1RA）进行渗透性研究，并辅以组织学黏膜评估。

薄膜、片剂、含片及其他剂型药物的口腔黏膜给药为儿科患者提供了一种便捷的全身给药途径...

本研究建立了一种标准化的离体猪颊黏膜实验方案，以保持组织完整性，并提高随时间推移对肽类渗透性的可靠测量。我们的离体实验方案适用于在临床前研究中探究肽类和小分子在猪颊黏膜和舌下组织模型中的渗透行为。首先，在 pH 7.4 的冰冻 PBS 中获取猪的颊部组织。使用手术刀将颊黏膜与下方组织分离。用 PBS 冲洗组织三次，并丢弃有明显表面损伤的黏膜。然后将完整的黏膜浸入 65 摄氏度的 PBS 中，持续三分钟。使用5号钟表匠镊子将上皮与下方结缔组织从平滑肌中分离。用纤维素滤纸轻轻吸干分离的口腔黏膜。将分离的黏膜组织置于Franz扩散池中，暴露的扩散面积为1.2平方厘米。在供体室中加入1 mL pH 6.8的磷酸盐缓冲液（PBS），在受体室中加入10 mL pH 7.4的PBS，将组织平衡30分钟。平衡结束后，将供体室中的PBS溶液更换为1 mL含有GLP-1RA和GDC的PBS溶液，两者浓度均为25 mg/mL，且比例为1:1。在受体室中持续以300 rpm搅拌，同时维持10 mL pH 7.4的PBS环境，并保持温度为37 °C。在180分钟的实验过程中，每隔60分钟从接收室取样1毫升。在实验开始和结束时，分别从供体室取三份平行样品。每次取样后，向各室补充1毫升PBS。实验结束后，将组织保存在10%福尔马林中用于组织学分析，或匀浆组织以定量组织中残留的GLP-1RA肽。在制备膜剂之前，为验证GDC的促渗透作用，可使用Hilltop扩散池加载肽增强剂溶液进行GLP-1RA的渗透性研究。在通过Hilltop扩散池确认增强剂活性后，进一步评估加载GLP-1RA和GDC的黏附性双层膜在Franz扩散池中猪颊黏膜组织上的离体渗透性，或使用3D细胞培养插入片进行评估。为评估上皮屏障完整性，向供体室中加入终浓度为 0.05 毫摩尔的异硫氰酸荧光素标记的 4000 道尔顿葡聚糖（FD-4）。在三小时内定期从受体室收集样品，以评估组织渗漏情况。组织完整性实验进行三小时后，使用酶标仪测定 FD-4 的浓度。为了在薄膜渗透研究中提高肽类物质的检测灵敏度，使用预先制备的GLP-1RA和GDC载药颊部双层膜。采用紫外光固化树脂制备3D插件，并将组织固定于插件中。将猪颊黏膜置于顶侧与基底侧室之间，覆盖面积为1.4平方厘米的窗口区域。将面积为1平方厘米的膜依次放置在组织上方。放置膜后，向顶端室加入0.5毫升pH为6.8的PBS，然后向基底外侧室加入1.5毫升pH为7.4的PBS。在3小时内每隔1小时从接收侧收集0.2毫升样品，并在每次取样后补充等体积的新鲜缓冲液。使用插入物供体侧和受体侧的筷子式电极测量跨上皮电阻力，并根据欧姆定律计算跨上皮电阻力。为确认猪颊部和舌下上皮组织的完整性，采用0.05毫摩尔的FD-4作为荧光标记物。在三小时实验结束后，采用超高效液相色谱法定量分析GLP-1RA的渗透量及残留组织含量。重复所有渗透实验三次，并定量GLP-1RA的累积通量。将组织在福尔马林中固定48小时后，用70%乙醇脱水，并包埋于石蜡中。使用切片机将组织切成5微米厚度的切片。接下来，使用苏木精和伊红对组织切片进行染色，然后在4倍放大倍数下通过光学显微镜检查其组织学完整性。最后，对切片进行成像，并使用合适的图像分析软件进行分析。与不含GDC的对照组相比，当GDC以1:1比例加入时，GLP-1RA的渗透显著增加。当将GLP-1RA与GDC组合掺入双层膜中时，使用传统的Franz扩散池装置无法定量测定GLP-1RA在离体猪颊黏膜组织中的渗透。采用3D插入式装置后，可在3小时内检测到GLP-1RA从颊膜中的累积渗透，渗透量约为1.8%。添加GDC的处理组中，TEER值随时间下降，且与GLP-1RA渗透增加相对应。经PBS对照处理的组织未显示TEER变化，表明GDC是促进渗透效应的主要因素。组织学评估表明，暴露于含有GLP-1RA和GDC的水性混合物或双层膜的颊黏膜均保持上皮完整性。仅观察到轻度水肿和表浅上皮糜烂。暴露于空白膜未引起明显的组织损伤。本方案可实现对药物经黏膜组织渗透的准确测量，支持利用大型动物模型进行可靠的临床前吸收预测和制剂开发。主要挑战在于整个上皮分离及全部实验过程中维持组织完整性，以确保渗透性测量的准确性和可重复性。未来的研究可采用标准化的跨实验室离体方案评估更多口腔黏膜肽类制剂，以提高与人体体内吸收的相关性。

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标准化的离体用于评估肽类物质跨黏膜转运的猪口腔黏膜模型

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